THE EFFECTIVENESS TEST OF ETHANOL EXTRACT OF HIBISCUS LEAVES (Hibiscus rosa sinensis L.) AS ANTIMICROBIAL IN Salmonella typhi BACTERIA IN IN VITRO AND BIOAUTOGRAPHY Suhardjono, Agitya Resti Erwiyani, Martina Nur Laeli ABSTRACT Hibiscus leaves contain flavonoid, saponin, and polyphenol that are expected to have an antimicrobial activity against Salmonella typhi bacteria. The aim of this study is to determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of Salmonella typhi bacteria and to find out the class of compound that has the activity as an antimicrobial. It was a pure experimental of post-test control design. The sample was ethanol extract of hibiscus (Hibiscus rosa sinensis L.) leaves. Antimicrobial effectiveness testing was conducted by paper disc diffusion method with 7 treatment groups, the negative control given by 0.5% of CMC Na, serial concentrations of extract of 3% w/v, 6% w / v, 12% w / v, 24% w / v, the positive control, and the growth control. The obtained data were analyzed by using SPSS for windows version 19. The result showed that the ethanol extract of hibiscus leaves could inhibit Salmonella typhi bacteria growth at concentration of 6% w / v, 12% w / v and 24% w/v. The largest inhibition zone was the concentration of 24% w / v. Bioautography results showed active saponin compound with Rf value of 0.9 and Rf polyphenol of 0.91which could cause the clear zone and got of R 2 = 0.919 on linear regression. Keyword : hibiscus leaves (Hibiscus rosa sinensis L.), antimicrobial, Salmonella typhi, Bioautography 1
UJI EFEKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN KEMBANG SEPATU (Hibiscus rosa sinensis L.) SEBAGAI ANTIMIKRBA TERHADAP BAKTERI Salmonella typhi SECARA IN VITRO DAN BIOAUTOGRAFI Suhardjono, Agitya Resti Erwiyani, Martina Nur Laeli INTISARI Daun kembang sepatu mengandung flavonoid, saponin, dan polifenol yang diduga memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui Kadar Hambat Minimal (KHM) terhadap bakteri Salmonella typhi dan mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antimikroba. Penelitian ini merupakan eksperimental murni post test control design. Sampel menggunakan ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.). Pengujian efektivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi kertas cakram dengan 7 kelompok perlakuan yaitu kontrol negatif CMC Na 0,5%, seri konsentrasi ekstrak 3% b/v, 6% b/v, 12% b/v, 24% b/v, kontrol positif, dan kontrol pertumbuhan.data yang diperoleh dianalisis dengan SPSS for windows versi 19.0. Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kembang sepatu dapat menghambat pertumbuan bakteri Salmonella typhi pada konsentrasi 6% b/v, 12% b/v, dan 24% b/v dengan zona hambat terbesar pada konsentrasi 24% b/v. Hasil bioautografi menunjukkan senyawa aktif saponin dengan nilai Rf 0,9 dan polifenol Rf 0,91 yang dapat menimbulkan zona bening dan diperoleh nilai R 2 = 0,919 pada regresi linear. Kata kunci : Daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.), antimikroba, Salmonella typhi, Bioautografi 2
PENDAHULUAN Demam tifoid merupakan penyakit prevalensi tinggi di Indonesia yang disebabkan oleh bakteri Salmonella typhi. Pengobatan terhadap penyakit ini biasanya dilakukan dengan menggunakan antibiotik lini pertama. Namun, saat ini pemberian antibiotik lini pertama dinilai kurang efektif dan menimbulkan banyak efek samping, sehingga diperlukan obat yang berasal dari tanaman tradisional yang digunakan sebagai antibakteri salah satunya yaitu daun kembang sepatu. Golongan senyawa kimia yang terdapat pada daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) adalah flavonoid, saponin, dan polifenol. Telah dilakukan penelitian terhadap daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) sebagai antibakteri dengan hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) mempunyai aktivitas terhadap Staphylococcus aureus dengan KBM 0,79% dan Staphylococcus aureus multiresisten dengan KHM 3% b/v. 1 Berdasarkan penelitian sebelumnya, maka penelitian ini dilakukan untuk menguji aktifitas ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) terhadap Salmonella typhi dengan metode difusi, dilanjutkan dengan pengujian secara kualitatif terhadap golongan senyawa dalam daun kembang sepatu yang memiliki aktivitas terhadap antibakteri dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan dianalisa secara statistik SPSS 19.0 for windows, regresi linear serta bioautografi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai alternatif obat antibakteri yang cukup murah dan mudah diperoleh di sekitar kita. PROSEDUR PENELITIAN BAHAN DAN CARA PENELITIAN a. Bahan Daun kembang sepatu, etanol 70%, CMC Na 0,5%, bakteri S.typhi, media MHA, media BHI, media MCA, kapas steril, disc, disc antibiotik ciproflksasin 5μg/ml, metanol, H2SO4, aquadest, HCl 10%, kloroform, pereaksi LB, FeCl3, eluen (kloroform : metanol (4:1), n-heksana : etil asetat (1:4), etil asetat : metanol : asam formiat (60:30:10)), uap ammonia, pereaksi FeCl. b. Alat Blender, ayakan 30 mesh, waterbath, cawan penguap, kain flanel, batang pengaduk, cawan petri, mikropipet, yellow tips, lampu bunsen, ose, autoklaf, oven, inkubator, jangka sorong, alatalat gelas steril, inkase, silika GF 254 nm, lampu UV, chamber, seperangkat alat penyemprot, pipa kapiler, pinset. CARA PENELITIAN 1. Determinasi Tanaman Determinasi di lakukan di Laboratorium Ekologi dan Biosistematik Fakultas SAINS dan Matematika Jurusan Biologi Universitas Diponegoro Semarang. 3
2. Penyiapan Bahan Bahan baku daun kembang sepatu diperoleh dari daerah Banjarnegara. Daun kembang sepatu dicuci dengan menggunakan air mengalir sampai bersih, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari tidak langsung dengan ditutup kain hitam. Setelah kering daun dibuat serbuk dengan cara diblender sampai halus dan diayak dengan ayakan nomor 30 mesh. 3. Pembuatan Ekstrak Daun Kembang Sepatu Pembuatan ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) yaitu menggunakan metode maserasi dan remaserasi (3:1), sebanyak 500 g serbuk simplisia dimasukkan dalam panci kemudian diberi etanol 70% sebanyak 3750 ml. Maserasi dilakukan selama 5 hari, sedangkan remaserasi diberi etanol 70% sebanyak 1250 ml selama 2 hari, proses tersebut dilakukan dalam ruangan yang terlindung dari cahaya matahari dan sering dilakukan pengadukan. 2 4. Identifikasi senyawa flavonoid 1) Diambil 0,1 g sampel ditambahkan metanol sampai terendam lalu dipanaskan hasil filtratnya ditambahkan H 2 SO 4. Reaksi positif ditandai dengan adanya perubahan warna dari kuning kehijauan menjadi warna merah 2) Diambil tiga tetes sampel dalam tabung reaksi ditambahkan 1 tetes FeCl 3 1% kemudian warna dicatat, hasil positif dari penambahan pereaksi ini menghasilkan warna hijau, merah, ungu, hitam, dan biru. 5. Identifikasi senyawa saponin 1) Uji Busa Diambil 0,1 g sampel dimasukkan dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 10 ml air panas selama 5 menit, disaring dan dikocok vertical, diamkan 10 menit. Selanjutnya ditambahkan dengan 1 ml HCl 10%. Hasil positif jika terdapat buih stabil. 2) Uji Warna Diambil 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisikan kloroform 10 ml, dipanaskan selama 5 menit dengan penangas air sambil dikocok. Kemudian ditambahkan beberapa tetes pereaksi LB. Jika terbentuk cincin coklat atau violet maka menunjukkan adanya saponin triterpen, sedangkan warna hijau atau biru, menunjukkan adanya saponin steroid. 6. Identifikasi senyawa polifenol Diambil 0,1 g sampel ditambah aquadest sampai terendam lalu dipanaskan. Kemudian filtratnya ditmbahkan FeCl 3, jika terjadi perubahan warna menjadi biru, hingga hitam menunjukkan adanya senyawa polifenol. 7. Uji Penegasan Lempeng alumunium silika gel GF 254 disiapkan dengan ukuran panjang 7 cm dan lebar 2 cm. Ekstrak kental yang sudah diencerkan dengan metanol ditotolkan pada garis tepi bawah lempeng dan diangin-anginkan beberapa saat. Lempeng dimasukkan ke dalam masing-masing chamber yang berisi eluen kloroform : metanol (4:1), n-heksana : etil asetat (1:4), dan etil asetat : 4
metanol : asam formiat (60:30:10). Lempeng yang telah dimasukkan dalam masing-masing chamber dibiarkan terelusi hingga eluen merambat sampai garis batas tepi atas, lempeng diangkat dan diangin-anginkan hingga kering. Pengamatan noda dibawah sinar UV 254 nm. 8. Metode difusi kertas cakram Uji aktivitas antimikroba dengan metode difusi dilakukan dengan cara kertas cakram direndam semalam dalam ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) dengan seri konsentrasi 3% (b/v), 6% (b/v), 12% (b/v), dan 24% (b/v). Kertas cakram diangkat dan ditiriskan kemudian diletakkan di atas cawan petri yang berisi media MHA yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Setelah itu, dimati dan diukur zona hambat yang terbentuk sehingga diperoleh KHM. 9. Bioautografi Kontak Lempeng KLT hasil elusi diletakkan di atas media yang telah diinokulasi dengan suspensi bakteri Salmonella typhi sebanyak 100 μl selama 30 menit, kemudian lempeng kromatogram diangkat dari media dan cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Pengamatan dilakukan dengan melihat zona bening yang terbentuk sebagai daerah yang tidak ditumbuhi bakteri. 10. Analisis Data Data dianalisis menggunakan SPSS 19,0 for windows. Normalitas data diketahui dengan menggunakan uji Shapiro wilk karena jumlah sampel <50. Homogenitas data diketahui dengan menggunakan uji leavene test, karena data yang dihasilkan tidak terdistribusi normal dan homogen kemudian data dianalisis menggunakan uji non parametik Kruskal-Wallis, dan dilanjutkan uji Mann-Whitney. 3 Selanjutnya, data dianalisis dengan regresi linear dan korelasi. HASIL Hasil determinasi tanaman dalam penelitian ini yaitu :1b 2b 3b 4b 6b 7b 9b 10b 11b 12b 13b 14a 15a (Golongan 8) 109b 119b 120b 128b 129a 130b 132b 133b 135b 136b 139b 140b 142b 143a 144a (Famili 75 Malvaceae) 1a 2b 3b - (Genus 5. Hibiscus) 1b 2a 3a (Hibiscus tiliaceus). Tabel I. Hasil uji pendahuluan kandugan senyawa pada ekstrak daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) dengan hasil sbb: Ekstrak daun kembang sepatu Hasil pengujian Senyawa Sampel+metanol+H 2 SO 4 Warna merah + flavonoid Sampel+FeCl 3 Warna hitam + flavonoid Sampel+aquadest+HCl Busa stabil + saponin Sampel+klroform+LB Cincin coklat + saponin triterpen Sampel+aquadest+FeCl 3 Warna hitam + polifenol 5
Tabel II. Hasil Pengamatan Diameter Zona Hambat Pada Bakteri Salmonella typhi Kelompok Perlakuan Replikasi Mean (mm) SD Kontrol negatif 5 0 0,00 3% b/v 5 0 0,00 6% b/v 5 9 1,22 12% b/v 5 15,2 2,49 24% b/v 5 19,6 0,89 Tabel III. Uji KLT Terhadap Ekstrak Etanol Daun Kembang Sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) kadar 24% b/v Menggunakan Eluen kloroform : metanol (4:1) Pengujian ekstrak Nilai Rf Warna yang terbentuk Ekstrak daun kembang 0,9 Hijau kebiruan sepatu konsentrasi 24% b/v 0, 97 Hijau kebiruan Tabel IV. Uji KLT Terhadap Ekstrak Etanol Daun Kembang Sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) kadar 24% b/v Meggunakan Eluen n-heksana : etil asetat (1:4) Pengujian ekstrak Nilai Rf Warna yang terbentuk Ekstrak daun kembang 0,5 Kuning sepatu konsentrasi 24% b/v 0, 92 Kuning Tabel V. Uji KLT terhadap ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) kadar 24% b/v menggunakan eluen etil asetat : metanol : asam formiat (60:30:10) Pengujian ekstrak Nilai Rf Warna yang terbentuk Ekstrak daun kembang sepatu konsentrasi 24% b/v 0,91 Hijau kehitam-hitaman Uji bioautografi kontak dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri terhadap bakteri Salmonella typhi, dengan hasil sebagai berikut : Rf 0,9 Rf 0,91 Saponin Polifenol Hasil Bioautografi Kontak 6
PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui Kadar Hambat Minimal (KHM) tarhadap bakteri Salmonella typhi dan mengetahui golongan senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antimikroba. Berdasarkan tabel III menunjukkan ekstrak daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) dengan konsentrasi 24% b/v ditotolkan pada lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan eluen kloroform : metanol (4:1) diperoleh dua bercak dengan warna hijau kebiruan. Harga Rf yang diperoleh yaitu 0,9 dan 0,97. Pada tabel IV menunjukkan ekstrak daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) dengan konsentrasi 24% b/v ditotolkan pada lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan eluen n- heksana : etil asetat (1:4) diperoleh dua bercak dengan warna kuning. Harga Rf yang diperoleh yaitu 0,5 dan 0,92. Pada tabel V menunjukkan ekstrak daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) dengan konsentrasi 24% b/v ditotolkan pada lempeng Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan eluen etil asetat : metanol : asam formiat (60:30:10) diperoleh satu bercak dengan warna hijau kehitaman. Harga Rf yang diperoleh yaitu 0,91. Berdasarkan hasil bioautografi kontak menunjukkan bahwa terdapat zona bening pada Rf 0,9 berwarna kuning kehijauan yang berarti senyawa saponin dan Rf 0,91 berwarna hijau kehitam-hitaman yang berarti senyawa polifenol. Hasil uji Mann Whitney menunjukkan bahwa kontrol negatif dan ekstrak daun kembang sepatu konsentrasi 3% b/v mempunyai nilai signifikasi p = 1,000 (p>0,05), menunjukkan bahwa pada kedua kelompok tersebut memberikan efek yang tidak berbeda terhadap bakteri Salmonella typhi yang ditandai dengan tidak adanya zona hambat yang terbentuk. Ekstrak daun kembang sepatu dengan konsentrasi 6% b/v, 12% b/v, dan 24% b/v memiliki efek yang tidak berbeda dalam menghambat bakteri Salmonella typhi, ditandai dengan adanya zona hambat yang terbentuk. Uji untuk mengetahui hubungan antara dosis respon data dianalisis menggunakan regresi linear dan korelasi. Hasil menunjukkan tidak terdapat hubungan antara peningkatan dosis dengan respon dengan nilai p = 0,183 (>0,05) dan nilai R 2 = 0.919 (>0,878) yang berarti data akurat. Berbagai penelitian tentang daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) telah dilakukan sebagai antimikroba. Penelitian yang dilakukan oleh (Listiyaningsih, 2013) tentang efektivitas daun kembang sepatu sebagai antibakteri terhadap bakteri S.aureus multiresisten menunjukkan nilai KHM 3% b/v. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun kembang sepatu dapat sebagai antibakteri pada Gram positif yaitu S. aureus multiresisten. Penelitian lain menyebutkan bahwa bunga belimbing wuluh dengan kandungan flavonoid, saponin, dan polifenol dapat menghambat bakteri S.typhi (KHM) pada konsentrasi 10% dan dapat membunuh (KBM) pada konsentrasi 12,5%. 4 Daun kembang sepatu juga memiliki golongan senyawa aktif yang sama dengan bunga belimbing wuluh, sehingga dapat disimpulkan daun kembang sepatu 7
dan bunga belimbing wuluh memiliki aktivitas antibakteri yang sama terhadap bakteri Salmonella typhi. KESIMPULAN 1. Ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) memiliki efektivitas antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhi. 2. Ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) dengan konsentrasi 3% b/v tidak dapat menghambat bakteri S.typhi karena tidak terbentuk zona hambat, sedangkan konsentrasi 6% b/v,12% b/v, dan 24% b/v dikatakan menghambat karena terbentuk zona hambat dan zona hambat terbesar pada konsentrasi 24% b/v. 3. Ekstrak etanol daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) memiliki golongan senyawa aktif sebagai antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhi yaitu saponin dengan Rf = 0,9 dan polifenol dengan nilai Rf = 0,91. 4. Diperoleh nilai R 2 = 0,919 (>0,878) yang berarti data yang diperoleh akurat dan tidak terdapat korelasi antara peningkatan dosis (konsentrasi) terhadap respon (zona hambat) yang terbentuk dengan nilai p = 0, 183(>0,05). SARAN 1. Perlu dilakukan penelitian tentang antimikroba dari ekstrak daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) terhadap bakteri Salmonella typhi secara in vivo. 2. Perlu dilakukan penelitian tentang peningkatan variasi konsentrasi ekstrak daun kembang sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) sebagai antimikroba terhadap bakteri Salmonella typhi. UCAPAN TERIMAKASIH Kepada tim peneliti dan seluruh staff Program Studi Farmasi STIKES Ngudi Waluyo yang telah membantu dalam menyelesaikan penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA 1. Listiyaningsih, R., 2013, Uji Efektivitas Antibakteri dan Bioautografi Ekstrak Etanol Daun Kembang Sepatu (Hibiscus rosa sinensis L.) terhadap Staphylococcus aureus Multiresisten, Skripsi, Program Studi Farmasi, STIKES Ngudi Waluyo, Ungaran 2. Anief, M., 2000, Ilmu Meracik Obat, Teori dan Praktik, cetakan ke 9, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. 3. Dahlan, S., 2011, Statistika untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta. 4. Ardananurdin, A., Winarsih, S., dan Widayat, M., 2004, Uji Efektifitas Dekok Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi) Sebagai Antimikroba Terhadap Bakteri Salmonella typhi Secara In Vitro, J.Kedokteran, 20(1), Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Malang. 8