BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah benih kedelai varietas Kaba dengan dengan deskripsi varietas pada Lampiran 1. Viabilitas awal benih yang digunakan adalah 90%. Isolat bakteri Methylobacterium spp. yang digunakan adalah strain TD-J7 dan TD-TPB3 koleksi Laboratorium Biologi Tanah Balai Penelitian Tanah Cimanggu, Bogor. Isolat bakteri Methylobacterium spp TD-J7 diisolasi dari permukaan daun jagung dan TD-TPB3 diisolasi dari permukaan daun terong bulat (Lampiran 2). Media perbanyakan bakteri adalah media selektif Amonium Mineral Salt (AMS) cair dan media AMS padat untuk pengamatan populasi bakteri dengan komposisi pada Lampiran 3 dan Lampiran 4. Bahan lain yang digunakan antara lain akuades, bacto agar, alkohol, media pengecambahan benih kertas stensil, kantong plastik, polybag, media tanam tanah, pupuk Urea, SP- 36 dan KCl. Peralatan yang digunakan dalam penelitian meliputi alat pengecambah benih tipe IPB 72-1, water bath sonicator, autoclave, laminar air flow, cawan petri, pipet volumetrik, bunsen, hand sprayer, erlenmeyer, autoklaf, phmeter, timbangan analitik, oven, dan alat pertanian. Lokasi dan Waktu Penelitian Percobaan pertama dilakukan di Laboratorium Kesehatan Benih Departemen Agronomi dan Hortikultura Institut Pertanian Bogor. Perbanyakan bakteri dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah, Balai Penelitian Tanah, Cimanggu Bogor. Penanaman dilakukan di rumah kaca Kebun Percobaan Cikabayan University Farm Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan mulai bulan Desember 2012 sampai Juli 2013. Prosedur Percobaan Penelitian dilaksanakan dalam dua tahap percobaan dengan bagan alir percobaan dapat dilihat pada Gambar 1. Percobaan pertama adalah pengaruh lama perendaman benih dengan isolat Methylobacterium spp. terhadap viabilitas benih kedelai. Waktu perendaman terbaik dari hasil percobaan pertama digunakan sebagai perlakuan pada percobaan kedua. Percobaan kedua adalah uji efektifitas isolat Methylobacterium untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman kedelai.
8 Perendaman dengan isolat Methylobacterium spp dan lama perendaman benih Evaluasi viabilitas benih Aplikasi isolat Methylobacterium dan waktu perendaman terbaik Aplikasi isolat Methylobacterium spp dan dosis pemupukan N, P, K kedelai Evaluasi pertumbuhan tanaman dan produksi Aplikasi isolat Methylobacterium spp dan dosis pemupukan N, P, K kedelai yang paling efisien Gambar 1. Diagram alir penelitian
Percobaan 1. Pengaruh Lama Perendaman Benih dengan Isolat Methylobacterium spp. terhadap Viabilitas Benih Kedelai. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektivitas isolat Methylobacterium spp terhadap viabilitas benih kedelai. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) 2 faktor. Faktor pertama adalah media perendaman benih yang terdiri dari tiga taraf, yaitu (1) tanpa perendaman, (2) perendaman dengan media AMS, (3) perendaman dengan isolat Methylobacterium sp. Faktor kedua adalah waktu perendaman yang terdiri atas 4 taraf, yaitu: 15 menit, 30 menit, 45 menit dan 60 menit perendaman benih. Percobaan diulang 3 kali. Setiap satuan percobaan ditanam 50 butir benih. Isolat Methylobacterium yang digunakan dalam percobaan adalah campuran isolat TD-J7 dan TD-TPB3. Isolat yang digunakan untuk perendaman benih adalah 25 ml campuran isolat TD-J7 dan TPB-3 untuk 50 butir benih. Model liner percobaan adalah: Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Yijk : Nilai pengamatan pada faktor perendaman benih ke-i faktor waktu perendaman ke-j dan ulangan ke-k µ : Nilai rata-rata umum αi : Pengaruh perlakuan perendaman benih ke-i (i= 1, 2, dan 3) βj : Pengaruh perlakuan waktu perendaman ke-j, (i= 1, 2, 3, dan 4) (αβ)ij : Interaksi antara perlakuan perendaman benih dan waktu perendaman. : Pengaruh galat percobaan εijk Percobaan dilakukan di laboratorium dengan uji kertas digulung didirikan dalam plastik (UKDdp). Kertas yang digunakan adalah kertas stensil ukuran folio. Setiap gulungan ditanam 25 butir benih sehingga setiap satuan percobaan ditanam 2 gulungan. Gulungan selanjutnya disimpan pada alat pengecambah benih IPB 72-1. Pengamatan perkecambahan dilakukan pada 3 dan 5 hari setelah tanam. Tolok ukur yang diamati adalah daya berkecambah benih (DB), indeks vigor (IV), kecepatan tumuh (KCT) dan bobot kering kecambah normal (BKKN). Daya berkecambah benih dan indeks vigor dihitung dengan rumus: DB = IV = KN1+KN2 Jumlah benih yang ditanam KN1 Jumlah benih yang ditanam 100% 100% Keterangan: DB = Daya berkecambah benih (%), IV = indeks vigor (%), KN1 = jumlah kecambah normal pada hitungan pertama (3 HST), KN2 = jumlah kecambah normal pada hitungan kedua (5 HST) Pengamatan dilakukan dengan melakukan penghitungan kecambah normal sejak hari pertama hingga hari ke-5 setelah tanam. Pengamatan kecepatan tumbuh dengan cara menjumlahkan hasil pembagian antara persentase kecambah normal yang tumbuh pada setiap pengamatan dibagi dengan etmal (jumlah jam dari saat tanam dibagi 24 jam). Rumus perhitungannya Kecepatan tumbuh (KCT) sebagai berikut : 9
10 KCT = % KN ke-1 etmal +... + % KN ke-n etmal Keterangan : % KN ke-1 : Persentase jumlah kecambah normal pada hari ke-1 setelah tanam dan % KN ke-n : Persentase Jumlah kecambah normal pada pengamatan terakhir. Pengamatan Bobot Kering Kecambah Normal (BKKN) dilakukan dengan mengukur bobot kering kecambah yang tumbuh dengan normal pada hari terakhir penghitungan kecambah. Kecambah yang tumbuh normal pada hari ke-5 dicabut dari media, kotiledonnya dibuang, dimasukkan dalan kantong kertas, selanjutnya dikeringkan menggunakan oven suhu 60 ºC selama 3x24 jam. Kecambah yang telah kering lalu ditimbang sebagai bobot kering kecambah normal. Selain itu dilakukan pengamatan rata rata bobot kecambah dengan menghitung BKKN yang dibagi dengan jumlah kecambah normal yang tumbuh pada hari ke-5. Percobaan 2. Uji efektifitas isolat Methylobacterium untuk meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman kedelai. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh aplikasi isolat Methylobacterium dan tingkat pemupukan pada pertumbuhan dan produksi tanaman kedelai. Rancangan yang digunakan dalam percobaan adalah rancangan petak terbagi (split plot). Petak utama adalah aplikasi isolat Methylobacterium spp yang terdiri dari tiga taraf, yaitu kontrol (tanpa penyemprotan), penyemprotan dengan media AMS dan aplikasi Methylobacterium dengan penyemprotan di permukaan tanaman saat tanaman berumur 14 dan 28 HST. Anak petak adalah tingkat pemupukan NPK terdiri atas empat taraf, yaitu P0: kontrol (tanpa pemupukan NPK), P1: pemupukan NPK 1/3 dosis, P2: pemupukan NPK 2/3 dosis dan P3: pemupukan NPK dosis penuh. Dosis penuh pupuk NPK yang digunakan adalah 50 kg N ha -1, 100 kg P2O5 ha -1 dan 100 kg K2O ha -1. Percobaan diulang tiga kali sehingga didapatkan 36 satuan percobaan. Model rancangan percobaan yang digunakan adalah : Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + ρk + (αρ)ik + εijk Yijk : Nilai pengamatan pada kelompok ke-i, aplikasi Methylobacterium ke-j, dan pemupukan ke-k µ : Nilai rata-rata umum αi : Pengaruh kelompok ke-i (j= 1, 2, dan 3) βj : Pengaruh perlakuan petak utama ke-j, (i= 1, 2, 3, dan 4) (αβ)ij : Interaksi antara perlakuan petak utama dan kelompok ρk : Pengaruh anak petak ke-k (k= 1, 2, 3, 4, dan 5) (αρ)ik : Pengaruh interaksi anak petak dan kelompok εijk : Pengaruh galat percobaan pada aplikasi Methylobacterium ke-i, kelompok ke-j dan pemupukan ke-k Data yang diperoleh diuji dengan uji F, apabila menunjukkan pengaruh nyata maka dilakukan pengujian lanjut dengan menggunakan uji wilayah berganda duncan (DMRT) pada taraf 5%.
Pertumbuhan tanaman yang diamati antara lain tinggi tanaman, jumlah daun, jumlah cabang. Komponen produksi yang diamati antara lain jumlah polong, bobot biji per tanaman dan total produksi. Selain itu dilakukan pula pengamatan populasi isolat bakteri sebelum penyemprotan, kelimpahan bakteri setelah dilakukan penyemprotan kedua, dan serapan NPK. Media tanam yang digunakan dalam penanaman kedelai di rumah kaca adalah top soil sebanyak 5 kg (berat kering udara). Setiap satuan percobaan ditanam 6 polybag kedelai. 2 polybag digunakan untuk pengamatan efisisensi pemupukan dan 4 polybag digunakan untuk pengamatan pertumbuhan dan produksi tanaman. Media tanam ditambahkan kapur sejumlah 20 kgl-1. Penentuan jumlah kapur berdasarkan hasil analisis awal tanah yang tercantum dalam Lampiran 5. Perbanyakan bakteri Prosedur pertama yang dilakukan sebelum pelaksanaan percobaan adalah perbanyakan isolat Methylobacterium spp. Isolat yang digunakan adalah campuran TD-J7 dan TD-TPB3. Perbanyakan kedua isolat dilakukan secara terpisah. Kegiatan perbanyakan isolat Methylobacterium spp diawali dengan pembuatan media kultur yaitu media AMS cair dengan bahan seperti yang tercantum pada Lampiran 3 dan Lampiran 4. Media yang telah siap selanjutnya diukur tingkat keasaman (ph) 7 menggunakan phmeter. Media dituang dalam tabung erlenmeyer lalu disterilisasi dalam autoclave pada tekanan 1 atmosfer dan suhu 121 o C selama 2 jam. Untuk pembuatan media AMS padat ditambahkan agar sebanyak 20 g L -1 media cair. Penambahan methanol (10 ml L -1 media) dan inokulasi bakteri dilakukan saat media sudah dingin. Sebanyak 1 ose bakteri atau 1 ml stok kultur cair diinokulasikan pada media secara aseptik. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu ruang (±25 C) dan kultur dikocok menggunakan shaker selama tujuh hari. Panen kultur dilakukan setelah 7 hari dengan ciri ciri kultur cair sudah berwarna pink dengan populasi 10 7 cfu (colony forming unit) seperti yang terlihat pada Gambar 2. Kultur cair yang akan dipakai diuji populasinya dengan metode total plate count pada media AMS padat. 11 Gambar 2. Isolat Methylobacterium TD-J7 dan TD-TPB3 yang siap digunakan.
12 Kebutuhan penyemprotan pada tanaman kedelai ditentukan berdasarkan hasil penelitian Danial (2011) yaitu volume semprot pada daun tanaman kedelai untuk 40 tanaman adalah 120 ml pada 10 HST dan 200 ml pada 20 HST. Pengamatan populasi bakteri di daun Pengamatan kelimpahan populasi Methylobacterium dilakukan dengan metode total plate count dari contoh daun pada saat tanaman berumur 35 HST. Media yang digunakan AMS cair dan padat. Proses yang dilakukan dimulai dengan mengambil contoh daun diambil lalu disimpan dalam cool box untuk menghindari pembusukan. Contoh daun ditimbang sebanyak 1 gram, selanjutnya dicelup dalam larutan fungisida dan dibilas menggunakan akuades steril, dipotong lalu dimasukkan dalam botol berisi 10 ml media AMS cair kemudian ditambahkan methanol sebanyak 100µL per botol. Selanjutnya dilakukan peluruhan bakteri dengan sonikasi pada water bath sonicator selama 20 menit, selanjutnya setiap botol dikocok menggunakan rotary shaker selama 2 menit. Sebelum penanaman dilakukan pengenceran sampai lima serial. Sebanyak 1 ml larutan AMS (berasal dari botol yang berisi daun) diencerkan pada larutan garam fisiologis sampai 5 serial pengenceran. Selanjutnya diambil 100µL larutan pada setiap konsentrasi untuk ditanam pada cawan petri yang berisi media AMS padat. Bakteri yang ditanam diratakan menggunakan segitiga penyebar sampai kering untuk menghindari kontaminasi. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 7 hari. Pengamatan populasi Methylobacterium dilakukan dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada cawan petri. Koloni yang dihitung adalah koloni yang berwarna pink seperti yang trlihat pada Gambar 3. Koloni yang berwarna selain pink dianggap sebagai kontaminan. Koloni Methylobacterium berwarna pink Bukan Koloni Methylobacterium Gambar 3. Koloni Methylobacterium spp