BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Waktu penelitian pada bulan Mei sampai dengan Oktober 2013. Kegiatan analisis kadar asam asetat cuka hasil fermentasi dan karakterisasi gelatin dilakukan di Laboratorium Pengujian dan Pembinaan Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP) propinsi Gorontalo. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini digolongkan berdasarkan jenis kegiatan dalam penelitian dan diuraikan sebagai berikut: a. Alat yang digunakan untuk analisis kadar asam asetat adalah neraca analitik, erlemmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet gondok, mikroburet yang terangkai dalam alat titrasi. b. Alat yang digunakan untuk mengekstraksi tulang ikan menjadi gelatin adalah pisau, wadah, beaker gelas, kompor, oven, thermometer, almuniumfoil, wajan, erlenmeyer, pan almunium dan penyaring. c. Alat yang digunakan untuk karakterisasi kimia adalah cawan petri, oven, neraca analitik, desikator, mortal, cawan porselin, tanur, rangkaian alat kjeldahl, tabung reaksi, pemanas, rangkaian alat sokhlet, beaker gelas, ph meter, labu alas bulat. d. Alat yang digunakan untuk karakterisasi fisik gelatin adalah timbangan, beaker glass, thermometer, tabung reaksi, lemari pendingin dan pemanas. 22
3.2.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas : a. Bahan yang digunakan dalam kegiatan ekstraksi adalah cuka aren yang diperoleh dari perkebunan Tapa kabupaten Bone-bolango, tulang ikan tuna yang berasal dari beberapa Unit Pengolahan Ikan (UPI) dan pasar di kota Gorontalo dan aquades. b. Bahan yang digunakan dalam kegiatan analisis kadar asam asetat adalah flenol ftalein 0,1% dan NaOH. c. Bahan yang digunakan dalam kegiatan analisis proksimat adalah indikator metilenred, CuSO 4. 5 H 2 O, K 2 SO 4, H 2 SO 4 pekat, NaOH, HCl, aquades. d. Bahan yang digunakan dalam kegiatan analisis fisik adalah aquades dan es batu. 3.3 Prosedur Penelitian Penelitian dilakukan melalui 2 tahapan yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. 3.3.1 Penelitian pendahuluan Pada tahap penelitian ini dilakukan uji coba masa perendaman tulang ikan dan penentuan kadar asam asetat dari cuka aren. Cuka aren diperoleh dari air nira yang berasal dari perkebunan Tapa, kabupaten Bone Bolango, difermentasi secara spontan selama 30 hari. Proses ini berdasarkan Hidayat (2012), bahwa proses fermentasi cuka biasa dilakukan di rumah-rumah dengan cara dibiarkan begitu saja (pendiaman) dan tanpa pengadukan atau sirkulasi didalamnya, proses ini dapat berjalan selama berhari-hari bahkan berbulan-bulan. Cuka aren yang telah terbentuk kemudian ditentukan kadar asam asetatnya berdasarkan SNI 01-3711- 23
1995 dengan metode titrimetri. Setelah diketahui kadar asam asetat, kemudian ditentukan perlakuan cuka yang akan digunakan. Proses penelitian pendahuluan dapat dilihat pada Gambar 5. Nira Aren Fermentasi 1 bulan (Hidayat, 2012) Cuka aren Analisis kadar asam asetat Gambar 1. Alur proses penelitian pendahuluan Keterangan: input/output, proses, analisis 3.3.2 Penelitian Utama Penelitian pendahuluan menunjukan kadar asetat cuka aren adalah 0,8%. Berdasarkan hal tersebut, maka perlakuan pada penelitian utama adalah perbandingan banyaknya cuka aren (volume) dengan jumlah (g) tulang dalam proses perendaman tulang. Perlakuan penelitian adalah 3:1(G1), 5:1 (G2), 7:1 (G3). Jumlah perbandingan ini dipakai karena penggunaan cuka aren sebagai sumber asam untuk merendam tulang ikan merupakan hal yang pertama kali dilakukan sehingga efektivitasnya dapat diketahui. Prosedur pembuatan gelatin dari tulang ikan tuna dalam penelitian ini merupakan modifikasi dari prosedur pembuatan gelatin oleh Wiratmaja (2006) 24
yang pada pembuatannya menggunakan jenis asam anorganik (HCl). Proses pembuatan gelatin diawali dengan preparasi tulang ikan tuna. Tulang ikan tuna diperoleh dari kegiatan industri tuna loin dan pasar lokal yang berada di kota Gorontalo. Pada tahap awal, tulang ikan dicuci dari kotoran seperti darah, pasir dan benda-benda fisik lainnya, kemudian tulang ikan tuna direndam dalam air panas (+80ºC) selama 30 menit dalam keadaan tertutup, proses ini bertujuan untuk menghilangkan komponen non kolagen seperti darah yang terdapat dalam jaringan, lemak, dan komponen lainnya. Kemudian, tulang dibersihkan dari sisasisa daging dan kotoran lainnya yang masih menempel. Tulang ikan kemudian dipotong dengan ukuran 1-3 cm. Tahap selanjutnya adalah proses perendaman ikan menggunakan cuka aren dengan berbagai volume yang berbeda selama 14 hari berdasarkan proses penelitian pendahuluan. Lama perendaman bervariasi bergantung pada jenis asam yang digunakan. Indikator lama perendaman yaitu sampai terbentuk tulang yang relatif lunak (ossein) seperti yang dapat dilihat pada Gambar 6. Kemudian ossein dicuci dengan air yang mengalir untuk menghilangkan sisa-sisa larutan asam sampai ph mendekati netral (mendekati 7). Gambar 2. Ossein hasil perendaman dengan cuka 25
Proses selanjutnya adalah perebusan tulang yang dilakukan dengan menggunakan aquades dengan perbandingan 1 bagian tulang (g) dan 3 bagian aquades (ml), dengan menggunakan suhu 80 ºC selama 6 jam. Hasil dari perebusan adalah larutan gelatin. Larutan gelatin kemudian disaring. Hasil saringan larutan gelatin kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50-60 ºC selama 24 jam sehingga diperoleh gelatin yang padat. Gelatin kemudian dihaluskan sampai membentuk serbuk. Gelatin yang diperoleh kemudian dikarakterisasi fisik dan kimianya. Secara singkat, proses pembuatan gelatin dapat dilihat pada Gambar 7. 26
Tulang Ikan Tuna (Thunnus sp.) Degreasing (80ºC, 30 menit) Pembersihan Pemotongan tulang 1-2 cm Perendaman dalam cuka aren 14 hari Perbandingan volume cuka dan berat tulang 3:1, 5:1, 7:1 Ossein Penetralan ph Perebusan pada suhu 80 ºC, 6 jam* Penyaringan Pengeringan oven 50-60ºC, 24 jam Karakterisasi - Rendemen - Titik gel dan titik leleh - Air - Abu - Protein - Lemak - ph *) modifikasi Gelatin Gambar 3. Alur Penelitian utama Modifikasi Wiratmaja (2006) 3.5 Prosedur pengujian Prosedur pengujian penelitian terbagi atas analisis kadar asetat dari cuka aren, analisis kimia dan analisis fisik gelatin hasil dari perlakuan. Analisis fisik 27
gelatin terdiri atas 3 parameter yaitu rendemen, titik leleh dan titik gel gelatin. Analisis kimia gelatin terdiri atas 5 parameter yaitu analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan ph. 3.5.1 Analisis Kadar Asam Asetat (SNI 01-3711-1995) Sebanyak 5 g contoh ditimbang dalam beaker gelas kemudian dimasukan ke dalam labu ukur 250 ml dan ditambahkan aquades sampai tanda batas. Sebanyak 25 ml larutan dipipet ke dalam elemmeyer 250 ml, ditambahkan 0,5 ml penunjuk fenol flatein, dititar dengan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah muda. Kadar asetat dihitung dengan menggunakan rumus : Keterangan % Asam asetat = V x N x Fp x 60,5 W V adalah volume larutan NaOH yang dibutuhkan untuk menitar contoh N adalah normalitas larutan NaOH baku Fp adalah faktor pengenceran 60,5 adalah bobot ekuivalen asam asetat W adalah bobot contoh (mg) 3.5.2 Analisis fisik gelatin a. Rendemen (Marzuki dkk 2011) Rendemen diperoleh dengan perbandingan berat kering gelatin yang dihasilkan dengan berat bahan segar. Secara metematis dapat dirumuskan dengan: % Rendemen = berat gelatin yang terbentuk berat tulang ikan b. Titik gel dan titik leleh (Suryaningrum dan Utomo 2002 dalam Wiraatmaja 2006 yang dimodifikasi) Gelatin (6,67%) dilarutkan dengan aquades dan dimasukan dalam tabung reaksi yang dihubungkan dengan thermometer digital, kemudian diberikan es pada 28
sekeliling luar bagian tabung reaksi. Titik gel adalah suhu ketika larutan gelatin mulai menjadi gel. Gelatin (6,67%) dilarutkan dengan aquades. Sampel didinginkan pada suhu antara 10ºC-14ºC selama 17 ± 2 jam. Pengukuran titik leleh dilakukan dengan cara memanaskan gel gelatin dalam penangas air. Diatas gel gelatin tersebut diletakkan gotri dan ketika gotri jatuh ke dasar gel gelatin,maka suhu tersebut merupakan suhu titik leleh. 3.5.3 Analisis Kimia Gelatin a. Analisis kadar air (AOAC 2005) Cawan petri dikeringkan pada suhu 105 ºC selama 1 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang (A g). 2 g contoh ditimbang diatas cawan yang telah diketahui beratnya (B g). Cawan yang berisi contoh dipanaskan di dalam oven 105 ºC selama 18 jam kemudian didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan kemudian ditimbang (C g). Kadar air dihitung dengan persamaan berikut. B C % Kadar air = B A Keterangan A adalah berat cawan kosong (g) B adalah berat cawan + contoh basah (g) C adalah berat cawan + contoh kering (g) b. Analisis kadar abu (AOAC 2005) Sampel yang telah diuapkan airnya dimasukkan ke dalam tanur bersuhu 600 ºC, sebelumnya berat cawan kering dan berat contoh telah diketahui. Proses penguapan dilakukan sampai semua bahan berubah warna menjadi abu-abu, kemudian contoh ditimbang. Kadar abu dihitung dengan rumus berikut % Kadar abu = Berat abu yang terbentuk (g) berat awal contoh (g) 29
c. Analisis kadar protein (AOAC 2005) Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode mikrokjeldahl. Proses penentuan protein meliputi beberapa tahapan yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Sampel ditimbang sebanyak 0.5 g, kemudian dimasukan dalam labu kjeldahl lalu ditambahkan 5 gram garam kjeldahl sebagai katalis yang berupa campuran CuSO 4. 5 H 2 O dan K 2 SO 4, lalu ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 pekat. Kemudian didestruksi sampai larutan berwarna jernih, labu kjeldahl diangkat dan didinginkan, setelah dingin dilakukan destilasi dengan menggunakan kjeltech sistem yang sebelumnya larutan sampel diberi penambahan NaOH sampai batas tanda 50 ml, destilasi dihentikan jika larutan asam standar berupa asam borat dan indikator metilenred telah berubah warna menjadi kuning dan mencapai volume 100 ml. Setelah larutan mencapai 100 ml, dititrasi dengan HCl 0,2 N sampai warna berubah menjadi ungu. Kadar protein ditentukan dengan rumus berikut. % kadar N = (ml HCL- ml blanko)x N HCl x 14.007 W x 1000 % kadar protein = % kadar nitrogen x 6,25 Keterangan 14.007 adalah bobot ekuivalen nitrogen 6,25 adalah bobot ekuivalen protein N adalah normalitas HCl W adalah berat sampel (g) d. Analisis kadar lemak ( AOAC 2005) Analisis lemak diperoleh dengan metode ekstraksi sokhlet. Labu alas bulat ditimbang dihitung sebagai berat A. Sample ditimbang sebanyak 2 g sebagai berat B, kemudian dimasukan kedalam selongsong lemak. Sampel dan 200 ml klorofom dimasukan kedalam rangkaian labu sokhlet kemudian dipanaskan sample pada suhu 60 ºC selama 5 jam. Labu alas bulat dimasukan ke dalam oven 30
105 ºC selama 2 jam. Labu kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang sebagai berat konstan (C). kadar lemak diperoleh dengan rumus berikut. % Kadar lemak = Keterangan : A = berat awal labu (g) B = berat sampel (g) C = berat akhir labu (g) e. Analisis ph (Marzuki dkk 2011) C A B Sampel sebanyak 0,2 g ditimbang dan didispersikan ke dalam 20 ml aquades yang bersuhu 80ºC. Sampel lalu dihomogenkan dengan pengadukan kemudian ph diukur pada suhu kamar dengan ph meter. 3.6 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Secara matematis, metode rancangan yang digunakan (Daha 2012) adalah Yij = µ + Aij + ε Keterangan Y μ A ε adalah nilai pengamatan pada perlakuan ke i ulangan ke j adalah rata-rata nilai perlakuan adalah pengaruh volume asam cuka perlakuan ke i ulangan ke j adalah faktor kesalahan (galat) Apabila berbeda nyata, maka selanjutnya diuji lanjut menggunakan Beda Nyata Terkecil (BNT) dimana nilai tengah dihitung dengan rumus BNT = t (, ) 2 KT galat r 31
Keterangan : t (db,α) r = nilai t-student pada taraf α, db (galat) = ulangan perlakuan 32