Tidak ditemukannya embrio yang mati pasca penyuntikan ekstrak benalu teh ke dalam ruang alantois TAB dengan dosis yang meningkat secara logaritmik

Transkripsi

1 PEMBAHASAN UMUM Telur ayam berembrio (TAB) merupakan salah satu media yang umum digunakan pada propagasi virus. Sejak awal tahun 1990an TAB juga banyak digunakan sebagai media uji suatu toksisitas obat atau bahan kimia, karena pengujian in ovo ini memiliki beberapa keunggulan dibandingkan pengujian in vitro. Telur ayam berembrio juga merupakan suatu sistem biologis yang dinamis sehingga dapat menggambarkan kondisi in vivo. Kondisi in vivo yang dimaksudkan adalah adanya metabolisme dan perkembangan sel sel embrio di dalam telur yang berlangsung terus menerus. Penelitian lain yang juga menggunakan TAB adalah penelitian dalam bidang biomedis. Pada bidang ini telur ayam berembrio banyak digunakan sebagai model untuk mempelajari proses perkembangan tumor dan pengobatan tumor pada manusia dan dampak zat adiktif seperti alkohol pada janin manusia (Becker dan Shibley 1998; Ribatti et al. 2000). Peningkatan kesadaran dan perhatian masyarakat dunia terhadap hak-hak serta kesejahteraan hewan (animal rights and welfare) berdampak pada meningkatnya tekanan kepada para peneliti biomedis agar melakukan berbagai upaya untuk mengurangi jumlah hewan coba dan meminimalkan penderitaan yang dialami hewan akibat pelakuan dalam penelitian. Dalam konsep animal welfare dikenal adanya prinsip 3R (Replacement, Reduction, Refinement) dalam penggunaan hewan coba untuk tujuan penelitian (WSPA 2003). Pemanfaatan TAB dalam penelitian biomedis merupakan salah satu alternatif dari penggunaan hewan coba. Saat ini Uni Eropa (EU/OECD) telah mengakui penggunaan TAB sebagai media alternatif untuk pengujian toksisitas akut bahan kimia secara in vitro (Spielmann 2002). Pada penelitian ini digunakan TAB sebagai media pengujian khasiat anti virus Marek dari ekstrak benalu teh (Scurrula oortiana). Rute pemberian ekstrak benalu teh yang tepat adalah pada ruang alantois, karena pemberian ekstrak benalu teh melalui rute ini tidak menyebabkan kematian embrio. Amannya rute pemberian ekstrak ke ruang alantois tersebut karena mudahnya ekstrak tersebut terlarut dalam cairan alantois. Larutan tersebut akan berdifusi masuk kedalam cairan amnion yang selanjutnya akan diserap secara perlahan ke dalam tubuh embrio melalui mulut dan trakhea sehingga tidak terjadi penumpukan senyawa dalam embrio (Jochemsen dan Jeurissen 2002).

2 Tidak ditemukannya embrio yang mati pasca penyuntikan ekstrak benalu teh ke dalam ruang alantois TAB dengan dosis yang meningkat secara logaritmik antara 0, mg/butir (setara 0, mg/kg BB) memperlihatkan bahwa LD50 ekstrak ini berada jauh di atas 4000 mg/kg BB. Sesuai standar uji toksisitas akut yang dikeluarkan oleh OECD (2001) bahwa zat dengan LD50 > 4000 mg dikategorikan bahan tidak beracun, maka ekstrak benalu teh termasuk dalam golongan bahan tidak beracun dan aman diberikan pada embrio. Pada penelitian awal penggunaan TAB sebagai media uji khasiat benalu teh, ditemukan perbedaan respon bobot badan embrio. Perbedaan respon ini diduga disebabkan oleh perbedaan ras telur ayam yang digunakan yaitu antara TAB dari ayam petelur dan telur ayam pedaging. Ras ayam petelur berbeda dari ras pedaging dalam pengaturan sistem pertumbuhan otot, laju sintesa protein dan aktivitas enzim proteolitik. Ayam petelur diseleksi untuk lebih tinggi kemampuan reproduksinya sebaliknya ayam ras pedaging diseleksi untuk bisa tumbuh lebih cepat, sehingga adanya pengaruh bahan tertentu dalam jumlah sedikit saja akan memberikan pengaruh yang signifikan terhadap pertumbuhan embrio ayam ras pedaging. Ayam ras pedaging memiliki laju pertumbuhan lebih cepat dan laju pendegradasi protein lebih rendah dibanding ayam petelur (Griffin dan Goddar 1994). Untuk menghindari pengaruh ekstrak terhadap laju pertumbuhan embrio maka pada penelitian lebih lanjut digunakan TAB ras petelur Ekstrak benalu teh berkhasiat sebagai imunomodulator, karena mampu meningkatkan rataan jumlah folikel aktif bursa Fabricius maupun jumlah limfosit aktif pada timus. Hasil tersebut tercermin dari tingginya jumlah folikel aktif tiap plika bursa Fabricius dan luas medula tiap lobus timus pada kelompok yang diberi ekstrak benalu teh dibandingkan kelompok kontrol. Proliferasi sel limfosit dapat terjadi akibat rangsangan mitogen tertentu seperti lektin yang merupakan salah satu glikoprotein asal tanaman (Roitt et al. 2000). Di dalam ekstrak benalu teh dari genus Scurrula terkandung tidak kurang dari 16 macam bahan aktif, terdiri dari enam senyawa asam lemak tidak jenuh, dua senyawa xantin, dua senyawa flavonol glikosida, empat senyawa flavonol, satu senyawa lignan glikosida dan satu senyawa monoterpen glikosida (Ohashi et al. 2003). Senyawa-senyawa flavonol glikosida, lignan glikosida dan monoterpen glikosida merupakan glikoprotein asal tanaman yang dapat bersifat sebagai mitogen. Rangsangan mitogen pada embrio ayam berusia 18 hari dapat menginduksi sel-sel timus (timosit) untuk meningkatkan 96

3 transkripsi interferon γ (IFNγ) dan tumor growth factor β (TGFβ). Peningkatan transkripsi berlanjut dengan translasi akan menghasilkan peningkatan sitokin-sitokin tersebut diatas. Tingginya induksi transkripsi interferon γ (IFNγ), dan tumor growth factor β (TGFβ) akan meningkatkan jumlah reseptor pada sel T (TCR) yang matang (Peters et al. 2003). Sitokin-sitokin tersebut akan meningkatkan jumlah reseptor pada sel T (TCR) yang matang melalui peningkatan cgmp intraselular. Peningkatan cgmp diduga akibat adanya ikatan antara mitogen pada reseptor CD2 dari sel limfosit T, sehingga dapat menginduksi sel-sel limfosit T yang belum matang untuk berkembang dan mengalami pematangan (Fudenberg et al.1980). Limfosit T yang matang akan memproduksi sitokin, berupa interferon γ (IFN-γ) dan interleukin 2 (IL-2). IFN-γ berperan dalam aktivasi makrofag dan dapat menginduksi molekul MHC kelas II pada makrofag, sehingga membantu fungsi makrofag pada folikel limfoid untuk mengenali substansi asing. Makrofag juga dapat melepas sitokin, yaitu IL-1 yang berperan dalam memacu proliferasi sel T helper dan sel B. IL-2 merupakan faktor pertumbuhan untuk sel T yang teraktivasi oleh antigen dan dapat berperan sebagai faktor pertumbuhan dan diferensiasi bagi sel B, serta dapat mengaktivasi makrofag (Roitt et al. 2000). Kemampuan ekstrak benalu teh dalam memodulasi perkembangan sel-sel limfosit terkait dengan kemampuannya meningkatkan kekebalan nonspesifik embrio sehingga pada saat diinfeksi virus Marek jumlah virus yang berkembang jauh lebih sedikit dibandingkan embrio yang tidak diberi ekstrak. Hal tersebut ditunjukkan dengan jumlah badan inklusi dan pembentukan atau penebalan pock yang lebih sedikit pada membran korioalantois embrio yang diberi ekstrak benalu teh baik sebelum maupun setelah infeksi virus Marek dibandingkan dengan kontrol infeksi virus yang tidak diberi ekstrak benalu teh. Rendahnya jumlah badan inklusi maupun pock yang muncul pada kelompok yang diberi ekstrak benalu teh menunjukkan pengaruh ekstrak benalu teh terhadap pertumbuhan virus (efek antiviral). Efek antiviral diduga akibat adanya modulasi ekstrak benalu teh terhadap mekanisme efektor dari sel radang berupa pelepasan jumlah sitokin yang makin meningkat sehingga menekan proses replikasi virus. Pengaruh pemberian ekstrak benalu teh baik dalam memodulasi pematangan sel limfosit maupun efek antivirus tidak selalu meningkat secara linier seiring peningkatan dosis yang diberikan. Bila digambarkan dengan kurva tampak bahwa 97

4 hubungan antara dosis pemberian dengan efek imunomodulator dan jumlah badan inklusi membentuk huruf U. Menurut Calabrese dan Baldwin (1999) kondisi tersebut menunjukkan adanya fenomena yang disebut dengan hormesis. Hormesis adalah gambaran fenomena efek stimulasi dari suatu zat yang muncul pada pemberian dosis sangat rendah atau sangat tinggi. Fenomena hormesis ini biasa terjadi pada percobaan farmakologi dan toksisitas berbagai jenis zat, tidak tergantung jenis bahan kimia dari zat yang diuji. Dengan teknik imunohistokimia menggunakan antibodi terhadap virus Marek dapat diketahui keberadaan antigen virus Marek pada jaringan. Hasil penelitian ini menunjukkan jumlah antigen Marek pada embrio yang diberi ekstrak benalu teh sebelum infeksi lebih sedikit dibandingkan kelompok kontrol virus maupun kelompok embrio yang diberi ekstrak benalu teh setelah infeksi ditandai dengan tingkat imunoreaktivitas yang lebih rendah pada sel-sel bursa maupun CAM dari kelompok tersebut. Dengan dosis infeksi yang sama tetapi jumlah antigen yang ditemukan lebih sedikit menunjukkan bahwa pada kelompok yang diberi ekstrak benalu teh sebelum infeksi jumlah virus yang berbiak lebih sedikit dibandingkan kontrol virus maupun kelompok embrio yang diberi ekstrak benalu teh setelah infeksi. Mekanisme penekanan perkembangan virus ini terjadi melalui peningkatan jumlah makrofag dan sel-sel limfosit serta produksi sitokin kedua sel tersebut. Peningkatan jumlah makrofag dan sel-sel lmfosit maupun sitokin yang diproduksinya terjadi akibat adanya modulasi dari benalu teh, sehingga proses fagositosis serta lisis sel yang terinfeksi meningkat. Pemberian ekstrak benalu teh dapat meningkatkan kepekaan sel-sel tumor terhadap TNF alpha (TNFa) dan efektivitas proses eleminasi sel tumor ataupun sel target yang terinfeksi virus seperti makrofag dan sel T (Murwani 2003). Sitokin lain yang diduga meningkat akibat adanya modulasi dari benalu teh adalah interferon-gamma (IFNγ). IFNγ sendiri maupun kombinasinya dengan TNFa dapat menstimulasi makrofag untuk memproduksi inducible Nitric Oxide synthase (inos) yang akan mengkatalisa L-arginin menjadi NO dan L-citrulin dengan kofaktor tetrahyroboipterine, calmodulin, NADPH dan O 2. NO merupakan senyawa radikal bebas yang dapat menghambat replikasi virus Marek (Xing dan Schat 2000a). Inducible NOS (tipe II inos) tidak diekspresikan pada kondisi fisiologis normal. Produksi inos diinduksi oleh adanya sitokin atau endotoksin selama proses 98

5 peradangan ataupun dalam proses infeksi. inos dapat diproduksi oleh berbagai jenis sel seperti hepatosit, makrofag, neutrofil, sel-sel otot polos serta chondrosit. NO yang diproduksi oleh inos memiliki aktivitas antimikrobial dan terlibat dalam proses pembunuhan sel-sel tumor (Moshage 1997). Studi ini mengeksplorasi peranan NO dalam mekanisme penghambatan replikasi virus Marek oleh ekstrak benalu teh dengan mengukur ekspresi inos pada sel makrofag di hati dan limfosit di limpa embrio. Pengamatan terhadap sel-sel makrofag dan limfosit di limpa menunjukan bahwa embrio yang diberi ekstrak benalu teh tersebut mengekspresi inos lebih tinggi dibandingkan kelompok embrio yang diinfeksi virus Marek saja. inos merupakan bagian dari sistem fagositosis oksida makrofag yang diproduksi oleh makrofag aktif. Hipotesa mekanisme pengaturan kerja NO dalam menghambat replikasi virus Marek pada embrio yang diberi benalu teh tersaji pada Gambar 20. Tingginya jumlah inos pada kelompok embrio yang diberi ekstrak benalu teh terjadi akibat induksi limfosit maupun makrofag yang sebelumnya tidak aktif (resting makrofag) menjadi makrofag aktif sehingga dapat menghasilkan inos (Xing dan Schat 2000a; Djeraba et al. 2000). MDV Penghambatan replikasi virus Sel limfosit/makrofag IFN-g ONOO - inos NO Makrofag inaktif Makrofag aktif inos Protein p 53 Benalu teh Gambar 20. Hipotesa mekanisme kerja ekstrak benalu teh dalam menghambat replikasi virus Marek pada telur ayam berembrio 99

6 IFNγ merupakan sitokin yang dapat memblokir replikasi virus (Xing dan Schat 2000a) bersama NO yang dihasilkan oleh kerja inos penghambatan replikasi akan meningkat. NO selain mampu menghambat replikasi virus Marek juga dapat menghambat replikasi beberapa virus herpes lainnya seperti virus Herpes Simpleks (HSV-1), Epstein-Barr Virus dan Murine Cytomegalovirus (Croen 1993; Karupiah et al. 1993; Mannick et al 1994; Tay dan Welsh 1997; Xing dan Schat 2000b). NO dapat merusak asam inti (Deoxyribonucleic acid/ DNA) virus secara langsung (Esumi dan Tannenbaum 1994). Disamping itu NO dapat merusak enzim ribonucleotide reductase yang diproduksi oleh kelompok Herpesvirus. Enzim ribonucleotide reductase adalah enzim yang bekerja mengkatalisis reaksi yang mengubah ribonukleotida menjadi deoksiribonukleotida. Deoksiribonukleotida ini merupakan prekusor pada sintesa DNA dan perbaikan DNA (Dong et al. 2005). Enzim tersebut merupakan salah satu enzim yang menjadi target perusakan NO sehingga produksi enzim ini dapat dihambat oleh NO (Kwon et al.1991). NO juga dapat berikatan dengan ion logam pada bagian protein virus yang merupakan protein esensial dalam replikasi virus. Penelitian Rice et al. pada tahun 1993 menggunakan virus human immunodeficiency virus (HIV) membuktikan bahwa komponen nitroso dapat mereduksi infektivitas virus HIV dengan cara mengikat dan memindahkan ion zink yang merupakan faktor transkripsi virus (Xing dan Schat 2000a). Dengan cara melakukan oksidasi pada gugus sulfhydril protein-protein virus, NO diduga juga mempengaruhi sinyal berbagai lintasan pengaturan perkembangbiakan virus dalam sel (Mannick 1994). NO juga dikenal sebagai faktor penting dalam sistem kekebalan nonspesifik karena memiliki aktivitas anti mikroba terutama terhadap protozoa, cendawan (kapang dan khamir) bakteri dan virus. NO merupakan mediator penting penghambatan replikasi virus di dalam sel yang berdampak pada penurunan jumlah virus yang dihasilkan serta peningkatan efisiensi pembersihan infeksi dalam tubuh induk semang yang mengarah pada penyembuhan (Staeheli 1990) Disamping sebagai senyawa yang berguna dalam mekanisme penyingkiran mikroba dalam sel, NO juga berperanan dalam kerusakan jaringan terutama bila terjadi aktivasi sejumlah besar makrofag untuk memproduksi NO. NO dapat menyebabkan kerusakan DNA dan menyebabkan kematian berbagai macam sel. NO juga memiliki kemampuan untuk memodifikasi target intraseluler seperti protein dan 100

7 produk-produk peroksidasi lipid. Produksi NO dengan konsentrasi tinggi dalam tubuh menyebabkan kerusakan sel namun pada konsentrasi rendah senyawa ini sangat efektif melindungi sel dari berbagai kerusakan, sehingga pengaturan produksi NO dalam tubuh sangat penting. Pengaturan transkripsi gen inos dalam tubuh dikontrol oleh protein p53 yang memegang peranan penting dalam menekan ekspresi gen penyandi inos in vivo dan mengurangi NO yang berlebihan melalui suatu mekanisme umpan balik negatif (Ambs et al. 1998). Kejadian kerusakan jaringan akibat kerja NO juga dapat diatasi oleh tubuh karena didalam tubuh tersedia senyawa inhibitornya (Reiss dan Komatsu 1998). Berbagai jenis senyawa yang bekerja menghambat aktivitas inos dan sintesa NO adalah S-methylisothiourea dan N-onomethyl L- arginin (Akerstorm 1998; Xing dan Schat 2000b). Studi ini telah mengembangkan suatu model pengujian khasiat antivirus dari suatu sediaan senyawa alami in vivo menggunakan telur ayam berembrio. Model pengujian ini juga dapat digunakan untuk mempelajari aspek keamanan sediaan senyawa alami yang diujikan. Kajian khasiat ekstrak benalu teh sebagai bahan antivirus in vivo menggunakan telur ayam berembrio membuktikan bahwa ekstrak benalu teh memiliki kemampuan menghambat replikasi virus Marek. Temuan ini memperkaya pengetahuan kita tentang berbagai khasiat ekstrak benalu teh sebagai bahan antivirus serta mekanisme kerjanya. Penggunaan virus Marek yang merupakan salah satu kelompok Herpesviridae dapat menjadi model untuk mengeksplorasi pemanfaatan ekstrak benalu teh dalam pengendalian penyakit yang disebabkan oleh kelompok Herpesviridae lainnya. Pada manusia virus-virus dari kelompok Herpesviridae menyebabkan penyakit yang bersifat laten seperti herpes simpleks. Infeksi virus tersebut akan memperlihatkan gejala klinis pada saat penderita mengalami penurunan kondisi tubuh. Gejala klinis ini mungkin dapat dicegah dengan mengkonsumsi ekstrak benalu teh pada saat kondisi tubuh sedang menurun. 101