DETEKSI KEMATIAN SEL KANKER PAYUDARA T47D OLEH FRAKSI DCM KULIT BATANG ASAM KANDIS (Garcinia Cowa Roxb.) DENGAN METODE DOUBLE STAINING

Transkripsi

1 DETEKSI KEMATIAN SEL KANKER PAYUDARA T47D OLEH FRAKSI DCM KULIT BATANG ASAM KANDIS (Garcinia Cowa Roxb.) DENGAN METODE DOUBLE STAINING Elidahanum Husni*, Fatma Sri Wahyuni, Rizka Yunadia Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Padang ABSTRAK Breast cancer is a common malignancy in women and the highest cause of death from cancer among women in the world. It has been known that stem bark of asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) contain on xanthone which has potential as anticancer. On previous study, DCM stem bark fraction of Garcinia cowa Roxb. showed cytotoxic effect in T47D cells with 4 µg/ml of IC50. This study aims to determine the effect of DCM stem bark fraction of Garcinia cowa Roxb. in cell death induction (apoptosis) of breast cancer cells T47D using double staining method. Double staining method based on the DNA fluorescence differentiation of viable and death cells after binding two DNA fluorochrome, propidium iodide (PI) and acridine orange (AO). The result of this study shows that viable cells are green fluorescence, the cell undergoes apoptosis in green mixed yellow, and the cell undergoing necrosis is colored orange mix red. The average percentage of apoptotic cells in variable DCM stem bark fraction of Garcinia cowa Roxb. induction is higher than the average percentage of apoptotic cells in variable control (induction = 29,9233 ± 3,23117 and control = 3,4333 ± 3,28221). The result of statistics analysis by Independent Sample Test shows apoptosis significance value (2-tailed) = 0,005 (< 0,025). Kata Kunci: Steam bark of asam kandis (Garcinia cowa Roxb.), T47D cells, apotosis PENDAHULUAN Kanker merupakan suatu penyakit yang terjadi melalui proses transformasi. Proses ini akan berlangsung apabila sel mengalami perubahan genetik dan mendapat kemampuan untuk melepaskan diri dari mekanisme regulator. Kanker dapat mengenai seluruh jaringan tubuh manusia termasuk payudara (Baratawidjaja, 2010). Kanker payudara merupakan salah satu kanker penyebab kematian tertinggi pada wanita di berbagai belahan dunia. Dua pertiga dari penderita kanker payudara di dunia berada di negara-negara yang sedang berkembang termasuk Indonesia (Amalina, 2008). Kanker payudara dapat terjadi pada pria maupun wanita, hanya saja prevalensi pada wanita jauh lebih tinggi (CCRC, 2009). Data terbaru dari American Cancer Society telah menghitung bahwa di tahun 2013, ada kasus baru kanker payudara pada pria dengan angka kematian sebesar 410 kasus. Sementara sekitar wanita meninggal dunia setiap tahunnya karena kanker payudara. Di perkirakan jumlah kasus kanker payudara akan meningkat kasus per tahun (Rasjidi, 2010). Perkembangan payudara normal dikontrol oleh keseimbangan antara proliferasi dan apoptosis 110

2 sel payudara. Pertumbuhan tumor dapat terjadi karena proliferasi yang tak terkontrol dan berkurangnya apoptosis (Parton et al., 2001). Apoptosis merupakan program bunuh diri dari sebuah sel. Program ini memiliki peran yang penting untuk menjaga homeostatis perkembangbiakan sel dan dengan adanya disregulasi apoptosis ini bisa berakibat timbulnya bermacam-macam penyakit (Evan and Litlewood,1998). Modalitas terapi kanker payudara secara umum meliputi operasi, kemoterapi, radioterapi, terapi hormonal, dan terapi target (Suyatno, 2010). Kemoterapi merupakan pengobatan kanker dengan menggunakan bahan kimia yang mempunyai efek menghambat atau mematikan sel kanker. Namun karena biaya yang tinggi, hasil yang tidak memuaskan, dan multi drugs resistance maka penelitian baru tentang antikanker sangat diperlukan (Suyatno, 2010). Selain itu, terapi tersebut seringkali tidak terjangkau oleh masyarakat, maka dicari obat tradisional untuk pengobatan kanker. Ada beberapa kelebihan penggunaan obat tradisional, harganya lebih murah karena dapat dibudidayakan, mudah didapat dan diharapkan efek samping lebih minimal dibanding obat antikanker sintetik (Rosmarilin, 2006). Garcinia cowa Roxb. atau yang dikenal dengan nama daerah asam kandis sudah lama digunakan masyarakat terutama untuk manisan atau penyedap masakan atau rempah-rempah (Heyne, 1987). Berdasarkan hasil penelitian, spesies ini mengandung golongan santon, benzofenon dan flavonoid. Golongan senyawa ini diketahui memiliki berbagai aktivitas seperti antimikroba, antimalaria, antioksidan, antiimflamasi, antitumor, dan antikanker (Komguem et al., 2005). Wahyuni et al. (2004) telah berhasil mengisolasi senyawa rubrasanton (aktivitas antioksidan) dan tetrapreniltoluquinon (aktivitas antikanker) dari kulit batang G. cowa. Dari penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa ekstrak etanol kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 5,1 µg/ml (Faras, 2013). Uji efek sitotoksik dari hasil fraksinasi kulit batang asam kandis juga telah dilakukan dan memperoleh hasil fraksi DCM sebagai fraksi paling aktif terhadap sel kanker payudara T47D denga nilai IC50 4 µg/ml. Metode pengujian yang digunakan untuk mendeteksi kematian selnya adalah dengan metode double staining. Metode double staining berdasarkan pada perbedaan fluoresensi DNA pada sel yang hidup dan mati karena pengikatan dua fluorokrom, yaitu propidium iodida - akridin oranye. Dengan melihat perbedaan warna di bawah mikroskop fluorescence, dapat dibedakan sel yang hidup dan sel yang mengalami kematian secara apoptosis dan nekrosis (CCRC, 2009). METODE PENELITIAN Alat Alat-alat yang digunakan untuk uji apoptosis berupa sarung tangan karet, botol semprot, labu Erlenmeyer (Iwaki ), flask T-25 (Iwaki ), botol Duran, tabung Appendorf (Iwaki ), pipet mikro (Ecopipette ), hemasitometer, timbangan analitik, autoklaf (Hirayama ), lemari es (Nasional ), inkubator 37 0 C/5% CO2 (Thermo Scientific ), microbiological safety cabinet air flow kelas II (Thermo Scientific ), vortex (Etech ), penangas air (Memert ), sentrifus (Thermo Scientific ), tabung sentrifugal, mikroskop inverted (Zeiss ), mikroskop Imager.A2 (Zeiss ), 24 well plate, dan cover slip. 111

3 Bahan Bahan yang digunakan untuk deteksi kematian sel adalah fraksi DCM dari kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb). Bahan-bahan yang digunakan untuk deteksi mekanisme kematian sel yaitu sel kanker payudara manusia T47D, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol 70%, air ultrapurifikasi, Medium Komplit (MK) Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, Tripsin-EDTA, Phosphate Buffer Saline (PBS), reagen Propidium Iodida - Akridin Oranye. Ibuprofen 200 mg dari PT Pharos (No. Batch BN C4G580B), metanol p.a (Emsure ), kloroform p.a (Emsure ), aseton p.a (Emsure ) dan etil asetat p.a (Emsure ) dari PT Merck. Kultur Sel a. Penyiapan Alat Alat alat yang digunakan untuk pengujian harus dalam keadaan bersih dan steril. Wadah plastik dipersiapkan hanya untuk satu kali pemakaian, dan sterilitasnya terjamin selama kemasan tidak rusak. Untuk alat-alat berbahan gelas, wadah dicuci bersih dan dikeringkan. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu C tekanan 15 lbs selama 15 menit. Sedangkan microbiological safety cabinet air flow kelas II disterilkan dengan cara disemprot dengan etanol 70%. b. Penyiapan Sel Sel kanker payudara yang digunakan yaitu sel T47D merupakan koleksi dari Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC) Universitas Gajah Mada (UGM). Sel kanker dikeluarkan dari freezer (-80 0 C), dihangatkan dalam penangas air pada suhu 37 0 C selama 2-3 menit. Setelah mencair, sel dipindahkan ke dalam flask yang telah berisi 15 ml media, diinkubasi selama 3-4 jam pada suhu 37 0 C, 5% CO2, kemudian diamati di bawah mikroskop untuk melihat apakah sel melekat di dasar flask dan membentuk lapisan monolayer. Medium pertumbuhan diganti sekali dalam dua hari dan bila jumlah sel di dalam flask mencapai 70-85%, lakukan sub kultur sel. c. Penghitungan Sel Tambahkan 2 ml tripsin-edta ke dalam flask yang berisi kultur sel, kemudian inkubasi 5-10 menit. Kemudian larutan tripsin-edta yang berisi sel disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Buang supernatan, lalu pelet disuspensikan dalam 1 ml medium RPMI. Ambil 10 µl suspensi sel, letakkan pada masingmasing kotak penghitungan sel hemasitometer. Lakukan penghitungan di bawah mikroskop dan rata-rata jumlah sel ditentukan untuk membuat suspensi sel ribu sel dalam setiap sumur 24 well plate dilakukan untuk analisis deteksi kematian sel. d. Peletakan Sel Suspensi sel dalam medium dibuat jumlah dan volume terukur. Siapkan 24 well plate dan cover slip. Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer 1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel kembali. Kolom pertama merupakan kontrol yang berisi suspensi sel dalam medium, sedangkan kolom kedua berisi suspensi sel diperlakukan dengan fraksi DCM kulit batang asam kandis. Amati keadaan sel di bawah mikroskop untuk melihat distribusi sel. Inkubasi pada suhu 37 0 C, 5% CO2 selama 24 jam. Pembuatan Larutan Uji a. Larutan Stok Timbang fraksi DCM kulit batang asam kandis sebanyak 100 mg. Larutkan dalam 1 ml pelarut 112

4 DMSO untuk mendapatkan konsentrasi larutan 100 mg/ml. Fraksi ini harus dapat larut sempurna dalam pelarut yang digunakan. b. Larutan Uji Untuk Deteksi Kematian Sel Satu tabung appendorf disiapkan untuk masingmasing sampel, diberi label sesuai dengan konsentrasi yang akan dibuat. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi yang akan diuji dalam media RPMI Uji Deteksi Kematian Sel Viabilitas, nekrosis, dan apoptosis sel dihitung menggunakan 2 jenis intercalating agents yaitu Propidium Iodida (PI) dan Akridin Oranye (AO). Ambil 24 well plate yang telah berisi sel dari inkubator. Buang semua medium komplit dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahanlahan. Cuci sel dalam sumuran dengan PBS masing-masing 500 μl. Buang PBS dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Masukkan sampel dengan konsentrasi tertentu sebanyak 1000 μl ke dalam sumuran. Masukkan media ke dalam sumuran untuk kontrol sel. Inkubasi plate di dalam inkubator. Amati kondisi sel setelah inkubasi 24 jam, dokumentasikan. Konsultasikan untuk menentukan akhir waktu inkubasi. Setelah inkubasi selesai, keluarkan plate dari inkubator. Buang semua media dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan. Cuci sel dalam sumuran dengan PBS masingmasing 500 ml. Buang PBS dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan. Ambil cover slip menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Letakkan cover slip di atas object glass (kaca obyek). Beri label pada object glass. Teteskan masing-masing 10 μl reagen propidium iodida dan akridin oranye di atas cover slip. Ratakan dengan cara menggoyang secara perlahan. Amati di bawah mikroskop fluorescence. Jika pewarnaan belum optimal, tunggu beberapa menit dan amati kembali. Dokumentasikan. Set kamera dengan setting khusus untuk fluorescence. Setelah selesai, buang cover slip dan cuci kembali object glass. Lakukan sanitasi laboratorium. Analisa Data Masing-masing sel yang viabel, apoptosis atau nekrosis dihitung jumlahnya secara manual. Dengan menggunakan data jumlah sel dari hasil penghitungan tersebut, dapat ditentukan persentase sel yang mengalami apoptosis atau nekrosis. Dari hasil pengamatan, data diuji dengan uji parametrik analisis variansi Independent Sample T-test. Uji Independent Sample T-test dilakukan untuk mengetahui apakah ada pengaruh perlakuan terhadap setiap parameter yang diamati dan perbedaan bermakna antara variabel kontrol dan perlakuan. HASIL DAN DISKUSI Setelah dilakukan penelitian mengenai deteksi kematian sel fraksi DCM kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) dengan IC50 sebesar 4 µg/ml terhadap sel kanker payudara T47D menggunakan metode double staining, maka didapatkan hasil terjadinya perbedaan fluoresensi warna antara sel yang hidup (viabel) dengan sel yang mengalami kematian sel secara apoptosis dan nekrosis. Perbedaan warna ini dapat dilihat dibawah mikroskop fluorescence 113

5 menggunakan dua jenis intercalating agents yaitu propidium iodida dan akridin oranye. Pengamatan kematian sel dilakukan dengan membandingkan gambaran fluoresensi warna antara sel kontrol (tanpa perlakuan) dan sel yang diberi perlakuan dengan fraksi DCM kulit batang asam kandis (Gambar 1). Gambar 1. (a) Fluoresensi warna sel kontrol (tidak diberikan perlakuan dengan fraksi DCM kulit batang asam kandis) pada inkubasi setelah 24 jam, sel viabel berfluoresensi hijau seragam. (b) Fluoresensi warna dari efek perlakuan fraksi DCM kulit batang asam kandis dengan IC 50 4 µg/ml terhadap sel viabel, apoptosis dan nekrosis sel kanker payudara T47D pada inkubasi 24 jam ( sel viabel berflouresensi hijau seragam, sedangkan sel yang mengalami kematian sel secara apoptosis yang berflouresensi hijau kekuningan, dan sel yang mengalami kematian sel secara nekrosis berflouresensi oranye sampai kemerahan). Pada pengamatan kematian sel juga dilakukan perhitungan jumlah dan rata-rata persentase sel yang hidup (viabel), apoptosis, dan nekrosis (Tabel 1, Gambar 2). Tabel 1. Rata-rata persentase sel yang hidup (viabel), apoptosis, dan nekrosis Persentase ( % ) Kelompok Cover slip Viabel Apoptosis Nekrosis Kontrol ,46 6,54 2, ,69 3,76 0,53 Rata-rata 95,38 3,43 1,17 Perlakuan 1 61,05 32,84 6, ,11 30,48 9, ,77 26,45 5,78 Rata-rata 62,97 29,92 7,09 Gambar 2. Grafik Persentase Sel Viabel, Apoptosis, dan Nekrosis pada variabel kontrol dan perlakuan dengan fraksi DCM kulit batang asam kandis 114

6 Pengolahan data hasil penelitian diuji secara statistik menggunakan uji Independent Sample T-test sebagai berikut : 1. Rata-rata persentase sel viabel ± SD (kontrol = 95,3833 ± 4,77739 dan perlakuan = 62,9767 ± 4,17767), rata-rata persentase sel apoptosis ± SD (kontrol = 3,4333 ± 3,28221 dan perlakuan = 29,9233 ± 3,23117), dan rata-rata persentase sel nekrosis ± SD (kontrol = 1,1733 ± 1,59544 dan perlakuan = 7,0933 ± 2,00403). 2. Dari uji homogenitas variansi dengan Levene s Test for Equality of Variances diperoleh nilai sel viabel dengan Sig. = 0,962 (P > 0,05), sel apoptosis dengan Sig. = 0,985 (P > 0,05), dan sel nekrosis dengan Sig. = 0,565 (P > 0,05) yang berarti bahwa masing-masing variansi dari persentase sel viabel, apoptosis, dan nekrosis antara variabel kontrol dan perlakuan adalah sama, maka untuk membandingkan rata-rata persentase sel viabel, apoptosis, dan nekrosis digunakan data Equal Variance Assumed. 3. Hasil uji T-test menunjukkan sel viabel dengan Sig. (2-tailed) = 0,005 (< 0,025), sel apoptosis dengan Sig. (2-tailed) = 0,005 (< 0,025), dan nekrosis dengan Sig. (2-tailed) = 0,008 (< 0,025). Ini berarti bahwa terjadi perbedaan yang bermakna dari masingmasing persentase sel viabel, apoptosis, dan nekrosis antara variabel kontrol dan perlakuan. Penelitian ini mendeteksi kematian sel kanker payudara T47D oleh fraksi DCM kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) sebagai fraksi paling aktif efek sitotoksiknya terhadap sel kanker payudara T47D dengan menggunakan metode double staining. Pada penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa ekstrak etanol kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 5,1 µg/ml (Faras, 2013). Selanjutnya juga telah dilakukan uji efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dari empat jenis hasil fraksinasi, yaitu fraksi DCM, etil asetat, heksan dan etanol sehingga diperoleh fraksi DCM sebagai fraksi paling aktif yang berpotensi sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan IC50 4 µg/ml. Maka dari itu, penelitian ini merupakan penelitian lanjutan yang bertujuan untuk mendeteksi jenis kematian sel yang terjadi pada sel kanker payudara T47D oleh induksi fraksi DCM kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb.). Pada penelitian ini terdapat dua variabel uji, yaitu variabel kontrol dan variabel yang diberi perlakuan dengan fraksi DCM kulit batang asam kandis pada konsentrasi IC50 4 mg/ml. Pada sel kontrol, umumnya terdapat sel yang berfluoresensi hijau terang seragam dan sedikit oranye. Fluoresensi hijau terang yang seragam pada nukleus dimiliki oleh sel hidup yang masih memiliki membran sel yang utuh (McGahon et al., 1995). Sel berfluoresensi hijau menandakan bahwa sel masih hidup. Sedangkan sel berfluoresensi oranye merupakan sel yang mati akibat nekrosis. Nekrosis dapat terjadi pada kontrol karena faktor lingkungan. Mungkin selama preparasi sel dengan double staining terjadi stres yang menyebabkan sel-sel kemudian mati (Meiyanto dan Septisetyani, 2005). 115

7 Pada kelompok perlakuan, hampir semua sel menunjukkan fluoresensi warna yang tidak seragam yaitu fluoresensi hijau bercampur kuning yang mengindikasikan terjadinya apoptosis dan fluoresensi oranye kemerahan yang menandakan bahwa sel mengalami nekrosis. Hal tersebut terjadi karena sel mulai mengalami membran blebbing, sehingga propidium iodida mulai masuk ke dalam sel (Sekti et al., 2010). Perubahan morfologi pada sel yang mengalami apoptosis ditandai dengan terjadinya kondensasi dan fragmentasi kromatin, fragmentasi DNA, menyusutnya volume sel, karioreksis, dan pembentukan badan-badan apoptosis (Kerr et al., 1970). Seperti yang terlihat pada gambar fluoresensi kelompok perlakuan, sel yang apoptosis memiliki bentuk bulat yang tidak utuh dan terdapat fragmen-fragmen seperti badan apoptosis. Sementara nekrosis yang terjadi di sekitar sel ditandai dengan pembengkakan sel, rusaknya organel, dan pecahnya membran sel, sehingga seluruh kandungan sel keluar ke cairan ekstraseluler, sehingga kerusakan jaringan yang meluas pada nekrosis ini dapat menyebabkan inflamasi (Guimaraes dan Linden, 2004). Berdasarkan hasil fluoresensi warna diatas, secara kualitatif dapat dilihat bahwa terjadi perbedaan warna antara variabel kontrol dan perlakuan yang menandakan telah terjadinya apoptosis. Dari hasil penghitungan diperoleh persentase rata-rata sel pada variabel kontrol (viabel = 95,38 %, apoptosis = 3,43 %, nekrosis = 1,17 %) dan pada variabel perlakuan (viabel = 62,97 %, apoptosis = 29,92 %, nekrosis = 7,09 %). Hal ini menunjukkan bahwa setelah sel diberi perlakuan dan diinkubasi selama 24 jam terjadi pengurangan viabilitas sel dan peningkatan jumlah apoptosis dan nekrosis. Berbeda dengan variabel kontrol, setelah diinkubasi selama 24 jam tanpa diberi perlakuan viabilitas sel jauh lebih tinggi dan hanya sedikit sel yang mengalami apoptosis dan nekrosis. Ini menandakan bahwa fraksi DCM kulit batang asam kandis memiliki potensi dalam menginduksi apoptosis. Dari hasil analisa uji statistik menggunakan Independent Sample T-test menunjukkan nilai Sig. (2-tailed) dari sel viabel = 0,005 (< 0,025), sel apoptosis dengan Sig. (2-tailed) = 0,005 (< 0,025), dan nekrosis dengan Sig. (2-tailed) = 0,008 (< 0,025). Hal ini berarti bahwa terjadi perbedaan yang bermakna dari masing-masing persentase sel viabel, apoptosis, dan nekrosis antara variabel kontrol dan perlakuan. Kulit batang asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) mengandung metabolit sekunder, seperti senyawa flavonoid, terpenoid, steroid, saponin, dan fenolik. Salah satu senyawa golongan fenolik adalah xanthone dengan beberapa turunannya seperti rubraxanthone, alfa mangostin, cowanin, cowanol, cowasanton, tetrapreniltolouquinon, β-mangostin dan xanthone terprenilasi (Likhitwitayawuid et al., 1997; Wahyuni, et al., 2004). Senyawa-senyawa ini diketahui memiliki berbagai aktivitas seperti antimikroba, antimalaria, antioksidan, antiimflamasi, antitumor, dan antikanker. Salah satu turunan xanthone, α-mangostin, diketahui mampu menginduksi apoptosis melalui jalur intrinsik (mitokondria) dengan cara mengaktivasi caspase 9 dan caspase 3 pada sel HL60. Hal ini ditandai dengan terjadinya disfungsi mitokondria seperti pembengkakan sel, hilangnya potensial membran, penurunan

8 ATP, akumulasi ROS, dan pelepasan sitokrom C menuju sitosol (Matsumoto et al., 2004). Berdasarkan data hasil penelitian ini, fraksi DCM kulit batang asam kandis memiliki aktivitas dalam memacu kematian sel kanker payudara T47D melalui mekanisme apoptosis, sehingga berpotensi untuk dikembangkan sebagai chemopreventif dan antikanker dengan target aksi spesifik. Namun, masih perlu dilakukan penelitian lebih lanjut guna mengetahui senyawa aktif dalam fraksi DCM kulit batang asam kandis yang bertanggung jawab terhadap mekanisme pemacuan apoptosis sel kanker payudara T47D. KESIMPULAN Dari penelitian yang dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa fraksi DCM kulit batang asam kandis dapat memicu kematian sel kanker payudara T47D melalui mekanisme kematian sel secara apoptosis. Terjadinya perbedaan nilai rata-rata persentase yang signifikan antara sel viabel, apoptosis, dan nekrosis pada variabel kontrol dengan variabel yang diberi perlakuan fraksi DCM kulit batang asam kandis. Dari hasil perhitungan Independent Sample T-test didapatkan nilai signifikansi 2-tailed < 0,025. DAFTAR PUSTAKA Amalina N Uji sitotoksik ekstrak etanol 70% buah merica hitam (piper nigrum L.) terhadap sel HeLa. Surakarta: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadaiyah Surakarta. American Cancer Society Cancer Facts and Figures Atlanta: American Cancer Society. Baratawidjaja KG, Rengganis I Imunologi Dasar edisi 9. Jakarta: FK UI. Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC) Mekanisme dan Regulasi Apoptosis. Yogyakarta: Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Press. Evan G, Littlewood TD A Matter of Life and Cell Death. Science 281: Guimaraes CA, Linden R Programmed Cell Death: Apoptosis and Alternative Deathstyles. Eur j Biochem 271: Heyne K Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta : Yayasan SaranaWana Jaya. Komguem J, AL Meli, RN Manfouo, David Lontsi, FN Ngounou, V Kuete, Hippolyte W. Kamdem, Pirre Tane, Bonaventure T. Ngadjui, Beiben L. Sondengam and Joseph D. Connolly Xanthones from Garcinia smeathmannii (Oliver) and their antimicrobial activity. Phytochemistry 66: Kerr JFR, Wyllie AH, and Currie AR Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. BJ C. 26: Likhitwitayawuid K, Phadungcharoen T, Mahidol C, Ruchirawat S O-Methylgarcinone E from Garcinia cowa. Phytochemistry 45: Matsumoto K, Akao Y, Yi H, Ohguchi K, Ito T, Tanaka T, Kobayashi E, Iinuma M, and Nozawa Y Preferential target is mitochondria in α-mangostininduced apoptosis in human leukemia HL60 cells. Bioorg. Med. Chem 12: McGowan CH Regulation of the eukaryotic cell cycle. Progress in Cell Cycle Research 5: 1-4. Meiyanto, Edi dan Endah P. Septisetyani Efek Antiproliferatif dan Apoptosis Fraksi Fenolik Ekstrak Etanolik Daun Gynura Procumbens (Lour.) Merr. terhadap Sel Hela. Majalah Artocarpus (5) 2: Nahari, Faras Uji Efek Sitotoksik Ekstrak Etanol Kulit Batang Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D Dengan Metoda MTT. (Skripsi). Padang : F.Farmasi, UNAND. Parton M, Dowsett M, and Smith I Studies of apoptosis in breast cancer. BMJ 322: Rasjidi, Imam Epidemiologi Kanker pada Wanita. Jakarta: Sagung Seto. Rosmarilin H Anti-cancer activity of local alpinia galangal L(SW) rhizome extracts on cancer cell linee of human and mice transplanted with primary tumor cell. USU reporitary 2006 (cited 2007 feb 14). Available from: Sekti DA, Muhammad Fithrul Mubarok, Inna Armandani, Sendy Junedy dan Edy Meiyanto Ekstrak Etanolik Daun Awar Awar (Ficus Septicaburm F.) Memacu Apoptosis Sel Kanker Payudara Mcf-7 Melalui Penekanan Ekspresi Bcl-2. Majalah Obat Tradisional 15(3)

9 Suyatno, Pasaribu ET Bedah Onkologi Diagnosis dan Terapi Edisi I. Jakarta: CV Sagung Seto. Wahyuni FS, Lajis NH, Stanslas J, Ali DAI, Shaari K, and Dachriyanus Isolation of bioactive compounds from Garcinia cowa Roxb. 14 th Indonesian National Symposium on Natural Products Chemistry. Bandung th December