BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN HEWAN. Penyusun: KholifahHolil, M.Si.

Transkripsi

1 BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN HEWAN Penyusun: KholifahHolil, M.Si. JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) MAULANA MALIK IBRAHIMMALANG 2012

2 KATA PENGANTAR Segala puji syukur kehadirat Allah SWT atas kesempatan yang diberikan untuk selesainya penyusunan buku petunjuk praktikum kultur jaringan hewan ini. Buku petunjuk ini disusun berdasarkan kebutuhan mahasiswa biologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang khususnya untuk para mahasiswa yang menempuh matakuliah kultur jaringan hewan. Buku petunjuk ini terdiri dari beberapa bagian tetapi secara garisbesar buku petunjuk praktikum ini berisi dasar-dasar praktikum yang dilakukan dalam kultur jaringan hewan. Sebagai dasar praktikum maka diharapkan buku petunjuk ini memberikan ketrampilan dasar bagi para mahasiswa khususnya mahasiswa yang menempuh matakuliah kultur jaringan hewan dan umumnya bagi mahasiswa biologi atau mahasiswa yang serumpun. Pada akhirnya tak ada gading yang retak. Saran dan kritik untuk pengembangan lebih lanjut guna penyempurnaan buku petunjuk ini benar-benar sangat diharapkan dan semoga bermanfaat. Malang, Februari 2012 Penyusun

3 DAFTAR ISI Kata Pengantar....i Daftar Isi...ii I. PreparasidanSterilisasiAlatdanBahan....1 II. SterilisasiRuang III. UjiSterilitas..6 IV. Pembuatan Media Stock V. KulturSel Baby Hamster kidney (BHK) VI. PengamatanSelHasilKultur BHK..12 VII. In Vitro Maturation (IVM)

4 PREPARASI DAN STERILISASI ALAT DAN BAHAN A. Pendahuluan Teknik kultur jaringan merupakan teknik untuk mengembangbiakkan sel, jaringan maupun organ di dalam media yang sesuai yang dilakukan di luar tubuh organisme. Keberhasilan teknik ini salah satunya ditentukan oleh teknik sterilisasi yang tepat untuk menghasilkan alat-alat maupun bahan yang steril yang akan digunakan dalam kultur jaringan. Jenis alat dan bahan yang akan disterilisasi didasarkan pada beberapa pertimbangan diantaranya adalah pada ketahanan alat maupun bahan tersebut terhadap perlakuan suhu yang diberikan pada saat sterilisasi, komponen penyusun, dan lain-lain. Alat-alat dari jenis glassware menunjukkan ketahanan yang lebih terhadap panas daripada alat-alat selain itu. Untuk beberapa bahan tertentu didasarkan pada komponen penyusunnya (ada yang dengan menggunakan filter dan ada juga yang menggunakan autoclave). Berikut ini adalah beberapa metode untuk sterilisasi (table 1) yang dapat dijadikan bahan pertimbangan untuk proses sterilisasi. Tabel 1. Metode sterilisasi menurut Freshney (2005) Method Conditions Materials Limitations Dry heat 160 C, 1 h Heat stable: metals, glass, Some charring may occur, PTFE. e.g., of indicating tape and cotton plugs. Moist heat 121 C, min Heat-stable liquids: water, salt solutions, autoclavable media. Moderately heat-stable plastics: silicones, polycarbonate, nylon, Irradiation: γ Irradiation polypropylene 25 kgy Plastics, organic scaffolds, heat-sensitive reagents and pharmaceuticals. Steam penetration requires steam-permeable packaging. Large fluid loads need time to heat up. Chemical alteration of plastics can occur. Macromolecular degradation. Electron beam 25 kgy Plastics, organic scaffolds, heat-sensitive reagents and pharmaceuticals. Microwave 5 min full power Aqueous solutions and gels such as agar. Short-wave UV 254 nm, W, 30 min Flat surfaces, circulating air. Needs high-energy source. Not suitable for average laboratory installation. Only useful for small volumes; usually just for melting agar Will not reach shadow areas. Spores resistant. Chemical: Ethylene oxide 1 h Heat-labile plastics. Items must be ventilated for h; leaves toxic residue. Hypochlorite ppm 30 min Contaminated Plastics. 70% Alcohol Soak for 1 h Dissecting instruments (combined with solutions. Needs extensive washing. May leave residue. Does not kill spores. Fire risk with

5 flaming). Some plastics. flaming. Precast Perspex or Lucite may shatter if immersed in alcohol. Filtration 0.1- to 0.2-µm porosity All aqueous solutions; particularly suitable for heat-labile reagents and media. Specify low protein binding for growth factors, etc. Not suitable for some solvents, e.g., DMSO. Slow with viscous solutions B. Tujuan 1. Untuk menyiapkan alat-alat yang akan digunakan dalam kultur jaringan hewan 2. Untuk mengetahui teknik sterilisasi pada berbagai alat dan bahan yang akan digunakan dalam kultur jaringan hewan. C. Alat dan Bahan Disinfectan (300ppm hypoclorit yang diencerkan dengan menggunakan detergen seperti Clorox atau detegen lain yang biasa digunakan) Detergen (7X atau Decon, teepol) Ember Kuas penggosok botol/busa pencuci Keranjang stainless Aluminum Foil Oven Autoclave D. Cara Kerja 1. Rendam alat-alat yang akan digunakan dengan menggunakan air yang ditambah dengan detergen yang mengandung disinfectan (contoh larutan teepol). Biarkan selama 24 jam. 2. Sikat dan bilas alat-alat tersebut di bawah air mengalir lakukan sebanyak 20x. 3. Bilas dengan aquades dan Deionized Water (DI), lakukan sampai tidak ada busa yang menempel pada glassware. 4. Keringkan alat-alat tersebut dalam oven suhu 50 C -60 C. Jika sudah kering bungkus dengan aluminium foil. 5. Sterilisasi kering untuk glassware dan alat-alat stainless lainnya dalam oven pada suhu 125 o C selama 3 jam atau pada suhu 160 C selama 1 jam. 6. Sterilisasi basah untuk alat-alat yang bukan tergolong glassware dan alatalat stainless dalam autoclave pada suhu 121 C selama 15 menit dan selanjutnya keringkan dalam oven suhu 50 C -60 C. 7. Simpan alat-alat yang sudah disterilisasi dalam oven dengan suhu 50 C - 60 C tersebut atau simpan dalam lemari penyimpanan yang disinari dengan bolam dalam ruang steril. 8. Alat-alat siap untuk digunakan (maksimal penyimpanan 48 jam).

6 E. Data Pengamatan No Nama Alat Fungsi Jenis Sterilisasi F. Tugas/Pertanyaan 1. Jelaskan fungsi alat-alat dibilas dengan menggunakan DI? 2. Apa tujuan sterilisasi kering dan sterilisasi basah 3. Sebutkan alat-alat apa saja yang tergolong disterilisasi dengan sterilisasi kering dan yang tergolong disterilisasi dengan sterilisasi basah pada praktikum yang sudah saudara lakukan.

7 STERILISASI RUANG A. Pendahuluan Ruang menjadi salah satu pendukung dalam menunjang keberhasilan dalam kultur jaringan hewan. Ruang yang terbebas dari kontaminan akan menjadi lingkungan yang tepat untuk tumbuhnya sel/jaringan yang dikultur. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan ruangan yang tepat untuk keberhasilan kultur jaringan. Beberapa diantaranya adalah pada prilaku dan penanganan yang dilakukan oleh peneliti. pemilihan teknik sterilisasi, dan intensitas sterilisasi. Ada beberapa teknik sterilisasi ruang yang bisa digunakan mulai dari cara fisik/mekanik, kimiawi dan radiasi. Teknik sterilisasi ruang dengan cara fisik/mekanik yaitu sterilisasi dengan cara membersihkan ruangan dengan melakukan pengepelan atau penyapuan dengan dikombinasi dengan pemakaian disinfektan. Sedangkan teknik sterilisasi cara kimiawi misalnya dengan membersihkan ruangan menggunakan alcohol 70% atau melalui proses fumigasi. Sementara itu teknik sterilisasi dengan cara radiasi adalah dengan cara penyinaran menggunakan sinar UV. Selain teknik sterilisasi di atas maka intensitas sterilisasi juga perlu diperhatikan. Sterilisasi ruang yang dilakukan secara berkala akan meminimalisir kontaminan. B. Tujuan 1. Untuk menyiapkan ruangan yang steril yang akan digunakan dalam kultur jaringan hewan. 2. Untuk mengetahui teknik sterilisasi ruang yang akan digunakan dalam kultur jaringan hewan. C. Alat dan Bahan Sapu Lap

8 Kain Pel Disinfektan Alkohol 70% D. Cara Kerja 1. Laminar Air Flow (LAF) Bersihkan permukaan LAF dengan menggunakan lap bersih atau tissue. Semprotkan area kerja dengan menggunakan alkohol 70% dan lap dengan menggunakan tissue. Semprotkan kembali area kerja dengan menggunakan alkohol 70% dan biarkan kering sendiri. Lakukan penyinaran dengan menggunakan UV minimal 1 jam. Lakukan langkah ini sebelum maupun sesudah digunakan. Jika LAF tidak sedang digunakan hindari meninggalkan alat maupun bahan di atas area kerja yang ada di dalam LAF. 2. Inkubator Nonaktifkan incubator, keluarkan rak incubator. Bersihkan rak incubator dari lemak, kotoron media yang tumpah, debu, dan lain-lain yang bisa menjadi sumber kontaminan. Lakukan dengan menggunakan tissue yang ditetesi alcohol 70%. Jika perlu rendam dengan air hangat terlebih dahulu. Rendam dengan menggunakan detergen yang telah ditambah disinfektan (minimal 1 jam), gosok dengan menggunakan busa pembersih, bilas di bawah air mengalir dan bilas kembali dengan menggunakan deionized water (DI). Keringkan. Masukkan rak ke dalam incubator dan semprot dengan menggunakan alcohol 70%. Inkubator siap untuk digunakan. 3. Ruang Kultur Bersihkan lantai dari debu dan kotoran lain dengan menggunakan sapu. Lakukan pengepelan dengan detergen yang ditambah dengan disinfektan (misal wipol). Lakukan penyinaran dengan sinar UV (minimal seminggu sekali dengan durasi minimal 1 jam). E. Data Pengamatan Alat/Ruang disterilisasi LAF Inkubator Ruangan yang Metode sterilisasi (cara fisik, kimia, radiasi) Hasil Uji Sterilitas

9 F. Tugas/Pertanyaan 1. Apakah ada perbedaan hasil uji sterilitas pada berbagai alat/ruang yang saudara sterilisasi? 2. Jika terdapat perbedaan jelaskan mengapa demikian? UJI STERILITAS A. Dasar Teori Salah satu factor penentu keberhasilan dalam teknik kultur jaringan adalah tersedianya lingkungan yang steril yang terbebas dari kontaminan baik jamur, bakteri maupun kontaminan lain. Teknik sterilisasi yang tepat akan mendukung penyediaan lingkungan yang dibutuhkan oleh sel/ jaringan yang ditumbuhkan. Uji sterilitas adalah uji ada tidaknya kontaminan pada alat, bahan, maupun lingkungan tempat sel/jaringan tersebut ditumbuhkan. Dengan menggunakan medium yang dibutuhkan oleh kontaminan tertentu (contoh media NA, PDA) maka akan dapat diketahui keberadaan dari kontaminan seperti jamur, bakteri, dan lain-lain. B. Tujuan Untuk mengetahui sterilitas dari alat, bahan, dan lingkungan yang akan dikultur. C. Alat dan Bahan

10 Medium NA Medium PDA D. Cara Kerja 1. Siapkan medium nutrient agar (NA) dan medium Potato Dextrose Agar (PDA) steril. 2. Letakkan medium tersebut pada bagian pinggir kiri, tengah, dan pinggir kanan pada bagian LAF, Inkubator, dan lantai (lihat tabel pengamatan). 3. Buka medium dan biarkan selama 5 menit kemudian tutup. 4. Inkubasi dalam inkubator suhu 37 C dan lakukan pengamatan setiap 2x24 jam (lakukan pengamatan selama 6 hari). Jika pada medium yang digunakan terdapat kontaminan dari bakteri, jamur, protozoa maupun kontaminan lain, lakukan sterilisasi ulang sampai steril dan siap digunakan. 5. Lakukan hal yang sama pada alat dan medium yang sudah disterilkan dan akan digunakan E. Data Pengamatan Medium yang Tempat digunakan pengambilan sampel NA LAF kiri atas LAF kanan atas LAF tengah LAF kiri bawah LAF kanan bawah Kontrol Inkubator rak atas Inkubator rak tengah Inkubator rak bawah Kontrol Lantai kiri atas Lantai kanan atas Lantai tengah Lantai kiri bawah Lantai kanan bawah Jumlah Koloni Yang Terbentuk Keterangan (Jenis Kontaminan: misal bakteri, jamur, dll)

11 PDA Kontrol LAF kiri atas LAF kanan atas LAF tengah LAF kiri bawah LAF kanan bawah Kontrol Inkubator rak atas Inkubator rak tengah Inkubator rak bawah Kontrol Lantai kiri atas Lantai kanan atas Lantai tengah Lantai kiri bawah Lantai kanan bawah Kontrol F. Tugas/Pertanyaan 1. Jelaskan masing-masing kegunaan jenis medium yang digunakan pada praktikum di atas? 2. Sebutkan komponen penyusun medium yang digunakan dalam praktikum di atas dan bagaimana pula cara pembuatannya? 3. Apa yang bisa saudara simpulkan dari praktikum yang sudah saudara lakukan? PEMBUATAN MEDIA STOCK

12 A. Dasar Teori Kultur sel/jaringan hewan adalah salah satu usaha menumbuhkan sel/jaringan secara in vitro. Usaha ini memerlukan kondisi aseptis yang tinggi yang menyangkut mulai dari persiapan alat dan bahan, persiapan media, pelaksanaan sampai pada pemeliharaan. Kondisi yang tidak aseptis memungkinkan tumbuhnya kontaminan-kontaminan tertentu seperti bakteri, protozoa, dan jamur. Tumbuhnya kontaminan ini akan merusak lingkungan untuk tumbuhnya sel itu sendiri. Oleh karenanya diperlukan kehati-hatian dan kecermatan bekerja serta pemahaman yang tinggi dalam menjaga sterilitas dalam teknik kultur sel/jaringan. Sebagai sumber nutrisi maka sel atau jaringan yang ditumbuhkan membutuhkan media tumbuh. Media tersebut harus mengandung karbohidrat, asam amino, vitamin, garam, lemak, faktor penumbuh, hormone, zat-zat bioaktif, mineral, dan serum. Masing-masing komponen tersebut terkandung pada beberapa media yang tersedia. B. Tujuan 1. Untuk mengetahui macam-macam media yang digunakan dalam kultur jaringan hewan 2. Untuk mengetahui komponen-komponen yang terkandung dalam media yang digunakan dalam kultur jaringan hewan 3. Untuk mengetahui cara pembuatan media pada kultur jaringan hewan. C. Alat dan Bahan DMEM TCM 199 HEPES NaHCO 3 Oven Autoklaf Bunsen Korek Api Erlenmeyer Botol Tutup Ulir Selotip Kertas Sprayer Laminar Air Flow (LAF) Sendok Timbang Timbangan Analitik Aluminium Foil Parafilm Mikropipet Blue Tip Yellow Tip Masker Sarung Tangan Filter Millipore Alkohol 70% Spiritus Tissue Kertas Label Deionized Water (DI) Aquades NaCl Penicillin Streptomycin

13 D. Cara Kerja 1. Medium Pencuci/Washing Medium (NaCl 0,9%) 1000 ml aquades ditambah dengan 9 gram NaCl. Homogenkan dengan magnetic stirer. Masukkan ke dalam botol steril (masing-masing 100ml) dan kemudian tutup dengan aluminium foil. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 o C dengan tekanan 1 atm. Simpan dalam suhu ruang, jika ingin digunakan tambah dengan 0,006g/100ml penicillin dan 0,01g/100ml streptomycin. 2. Medium Pencuci/Washing Medium (PBS, ) 100 ml aquades ditambah dengan 0.96 gram PBS atau sesuai dengan kandungan yang tertera di label berapa gram yang harus ditambahkan dalam setiap liter pelarut. Homogenkan dengan magnetic stirer. Masukkan ke dalam botol steril (masing-masing 100ml) dan kemudian tutup dengan aluminium foil. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 o C dengan tekanan 1 atm. Simpan dalam suhu ruang, jika ingin digunakan tambah dengan 0,006g/100ml penicillin dan 0,01g/100ml streptomycin. 3. Medium Kultur (Stock) Timbang 1.35g DMEM, 0,37g NaHCO 3, 0,006g penicillin, 0,01 gram streptomycin, dan 0,238g Hepes. Selanjutnya bahan-bahan tersebut dilarutkan dalam 100 ml deionized water (DI) steril. Homogenkan dengan magnetic stirrer. Filter dengan menggunakan Millipore ukuran 0,22µm. Simpan stock pada suhu 4 o C dan siap untuk digunakan. E. Data Pengamatan Medium Komponen Fungsi Keterangan F. Tugas/Pertanyaan Jika ingin membuat medium sebanyak 250 ml, hitung berapa kebutuhan masing-masing komponen yang diperlukan dalam pembuatan ketiga medium tersebut.

14 KULTUR SEL BABY HAMSTER KIDNEY (BHK) A. Pendahuluan Teknologi kultur jaringan hewan adalah salah satu teknik mengembangbiakkan sel/jaringan hewan dalam kondisi in vitro. Teknik ini memiliki beberapa manfaat diantaranya dapat digunakan sebagai bahan dasar untuk mempelajari toksisitas bahan kimia tertentu, mekanisme dan fungsi sel, rekayasa genetika, produksi hormone, produksi vaksin, dan lain-lain. Keberhasilan kultur jaringan hewan bergantung pada beberapa factor diantaranya pada pemilihan jenis medium yang tepat, penggunaan serum, sterilitas bahan dan pengerjaan, jenis eksplan (sel atau jaringan yang akan dikultur) dan lain-lain. Dengan memperhatikan factor-faktor di atas maka akan didapatkan stock sel yang bagus dan selanjutnya dapat digunakan untuk keperluan lebih lanjut. Prinsip dasar teknik kultur jaringan ini adalah menumbuhkan eksplan (sel atau jaringan) pada medium tertentu dengan lingkungan yang terkendali sampai didapatkan biakan yang konfluen. Tingkat keberhasilan dari teknik ini dapat dilihat dari beberapa parameter diantaranya adalah persentase konfluen, viabilitas sel, abnormalitas sel, dan lain-lain. B. Tujuan 1. Untuk mengetahui teknik kultur sel BHK 2. Untuk mengetahui peran serum terhadap pertumbuhan sel BHK secara in vitro. C. Alat dan Bahan Mikropipet 1 ml Mikropipet µl Tissue culture dish (TC dish) Erlenmeyer 25 ml dan 50 ml Tabung reaksi 10 ml Petri dish Sentrifus Pipet Pasteur dan karet hisap Blue tip Yellow tip Tabung sentrifus Rak tabung Seperangkat alat bedah Aluminium foil Spuit 10 ml dan 2.5ml Medium DMEM stock

15 Penicillin Streptomycin Serum FBS Tripsin NaCl 0.9% PBS Fetus Hamster umur 2 hari (belum berbulu) D. Cara Kerja Pembuatan medium 1. Medium Washing: medium washing yang digunakan terdiri dari medium NaCl 0.9% steril, PBS steril, dan medium DMEM 0%. 2. Medium inkubasi: medium inkubasi yang digunakan adalah medium DMEM 10 % FBS. Catatan: semua medium di atas harus ditambah antibiotic (penicillin dan streptomycin). Isolasi dan Penanaman eksplan 1. Semprot fetus hamster dengan menggunakan alcohol 70%. Masukkan ke dalam LAF yang telah diberi alas aluminium foil. 2. Lakukan dislokasi dengan cara menekan bagian leher dengan menggunakan pinset dan menarik bagian ekor. 3. Gunting abdomen bagian posterior ke arah anterior sampai kemudian selaput yang menyelubungi abdomen terbuka. Ambil bagian ginjal. 4. Masukkan ke dalam beaker glass kecil yang berisi NaCl 0.9%. Lakukan sekali lagi. 5. Masukkan ke dalam beaker glass kecil yang berisi PBS. 6. Masukkan ke dalam petri dish yang berisi tripsin 0.25% sebanyak 500µl, cacah. Tambahkan 250µl PBS, homogenasi dengan menggunakan spuit 2.5 ml. 7. Masukkan ke dalam tabung sentrifus steril, bilas petridish dengan cara menambahkan 250µl PBS dan masukkan PBS bilasan tersebut ke dalam tabung sentrifus yang sama. Inkubasi dalam incubator selama 30 menit. 8. Keluarkan dari incubator dan tambah dengan 1 ml PBS. 9. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 10. Buang supernatant dan tambah pellet dengan 2 ml DMEM 0%. 11. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 12. Buang supernatant dan tambah pellet dengan 2 ml DMEM 0%. 13. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 14. Buang supernatant dan tambah dengan 1 ml DMEM 10%. 15. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 16. Buang supernatant dan sisakan pellet sebanyak 500µl.

16 17. Homogenasi, ambil 100µl pelet dan masukkan ke dalam TC dish yang telah berisi 3.5 ml DMEM 10%. 18. Inkubasi dalam incubator CO 2 5% pada suhu 37 C. Lakukan sampai sel konfluen. Amati pada hari ke 3 dan ke Jika sel pada hari ke 3 sudah nempel pada dasar TC dish lakukan penggantian medium dengan cara membuang medium lama dan menggantinya dengan medium DMEM 10% yang baru. E. Pertanyaan 1. Hitung total kebutuhan masing-masing medium pada kultur sel BHK yang telah dilakukan. 2. Sebutkan kesulitan-kesulitan yang dihadapi pada saat kultur sel BHK tersebut di atas dan bagaimana cara mengatasinya. PENGAMATAN SEL HASIL KULTUR BHK A. Pendahuluan Sel adalah unit struktural terkecil dari penyusun makhluk hidup. Sebagai unit terkecil sel mempunyai kemampuan untuk berproliferasi. Proses proliferasi ini dilakukan dalam rangka untuk menggantikan sel yang telah rusak dan untuk keperluan lain yang diperlukan untuk kehidupan sel. Secara in vitro sel pada perkembangannya mengalami 3 fase yaitu fase lambat (adaptasi), fase eksponensial dan fase menetap. Pada fase lambat (adaptasi), sel mengalami adaptasi dengan media kultur sehingga proses yang terjadi pada fase ini pelekatan atau penempelan sel pada substrat dan penyebaran sel. Fase selanjutnya adalah fase eksponensial yaitu sel yang sudah beradaptasi akan berproliferasi, sehingga pada fase ini terjadi peningkatan jumlah sel secara eksponensial dan pertumbuhan mencapai konfluen. Fase terakhir yaitu fase menetap yang merupakan fase terjadinya penurunan dan berkurangnya kemampuan sel untuk tumbuh. Tingkat perkembangan dari sel secara in vitro dapat dilihat dari beberapa parameter yaitu persentase konfluen, jumlah sel, viabilitas sel, abnormalitas sel, ukuran sel, dan lain-lain. Dengan mengamati beberapa parameter tersebut maka akan dapat diketahui bagaimana pertumbuhan eksplan (sel) yang telah dikultur. B. Tujuan

17 1. Untuk mengetahui teknik pengamatan berbagai parameter sel hasil kultur. 2. Untuk mengetahui pertumbuhan sel BHK hasil kultur. C. Alat dan Bahan Mikropipet 1 ml Mikropipet µl Tissue culture dish (TC dish) Erlenmeyer 25 ml dan 50 ml Tabung reaksi 10 ml Aluminium foil Spuit 10 ml dan 2.5ml PBS Biakan sel BHK yang telah konflue Blue tip Yellow tip Tabung sentrifus Rak tabung Petri dish Sentrifus Tripsin EDTA (Versen) Tripan Blue Hemocytometer D. Cara Kerja 1. Amati TC dish yang berisi biakan di bawah mikroskop. Tentukan berapa persen ekspansi yang dilakukan oleh sel dengan cara 25% jika menutupi ¼ dari total area TC dish, 50% jika menutupi ½ dari total area TC dish, 75% jika menutupi ¾ total area TC dish, dan 100% jika menutupi semua area TC dish. Data persentase tersebut merupakan data persentase konfluen. 2. Buang medium kultur dan cuci biakan dengan PBS. Lakukan sebanyak 3 kali atau sampai benar-benar bersih dan terbebas dari medium DMEM 10%. 3. Beri 1 ml tripsin EDTA atau sampai biakan tergenang oleh tripsin EDTA. Inkubasi dalam incubator selama 30 menit. 4. Keluarkan dari incubator dan homogenasi dengan spuit 2.5 ml. Masukkan dalam tabung sentrifus dan tambahkan 1 ml PBs. 5. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 6. Buang supernatant dan tambahkan 2 ml PBS. 7. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 8. Buang supernatant dan tambahkan 2 ml PBS. 9. Sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 1500rpm. 10. Buang supernatant dan sisakan pellet sebanyak 1 ml, homogenasi. 11. Ambil hemositometer bersih dengan gelas penutup diambil dan diletakkan pada tempatnya. 12. Teteskan 1 suspensi sel pada 1 tetes pewarna pada gelas objek yang masih terbuka, di aduk dan di ambil kemudian diteteskan pada

18 hemositometer ditepi gelas penutup, sehingga cairan masuk dibawah gelas penutup. 13. Diamkan selama 1-2 menit, tidak boleh terlalu lama, sel yang rusak/tidak viable/mati akan menyerap warna sedangkan sel yang tidak dapat menyerap warna adalah sel yang viable (hidup). 14. Jumlah sel yang hidup dan yang mati selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan rumus (Freshney, 2010) : C= n x 5 x 10 4 Keterangan : C = Konsentrasi sel (sel/ml) n = Jumlah sel yang dihitung dalam 5 kotak hemocitometer = Volume chamber hemocytometer pada kedalaman 0.1mm E. Data pengamatan Tabel 1. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap persentase konfluen sel BHK secara in vitro Perlakuan % konfluen pada hari ke 3 6 FBS 5% FBS 10% Tabel 2. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap jumlah sel BHK secara in vitro Perlakuan Jumlah sel pada hari Selisih ke. 0 6 FBS 5% FBS 10% Tabel 3. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap viabilitas sel BHK secara in vitro pada hari ke 6 kultur. Perlakuan Total Hidup Mati FBS 5% FBS 10%

19 Tabel 4. Efek konsentrasi FBS yang berbeda terhadap abnormalitas sel BHK secara in vitro pada hari ke 6 kultur. Perlakuan Jumlah sel yang.. Normal Abnormal FBS 5% FBS 10% F. Pertanyaan Apakah terdapat perbedaan efek dari kedua perlakuan di atas terhadap berbagai parameter pertumbuhan sel BHK tersebut? Mengapa demikian? IN VITRO MATURATION (IVM) A. Pendahuluan Kultur sel dan jaringan merupakan teknik yang digunakan secara luas dalam berbagai disiplin ilmu mulai ilmu-ilmu dasar tentang sel dan biologi molekuler sampai bidang aplikasi bioteknologi yang sedang berkembang dengan pesat. Di bidang biologi, teknologi ini dapat bermanfaat untuk mempelajari interaksi sel, mekanisme control intraseluler untuk diferensiasi dan perkembangan sel, fungsi-fungsi sel, analisa kromosom, perkembangan embrio, serta perkembangan sel-sel spesifik. Di bidang farmasi dan kedokteran teknologi ini dimanfaatkan untuk memproduksi vaksin antivirus dan untuk pengobatan lainnya (contoh teknik stem cell untuk pengobatan luka bakar, kanker darah dll). Sedangkan di bidang peternakan teknologi ini bermanfaat untuk menghasilkan ternak-ternak unggul (melalui cloning), melestarikan hewan-hewan langka dan lain-lain. Sementara itu di bidang

20 reproduksi, teknik kultur sel dan jaringan dimanfaatkan dalam in vitro fertization (IVF), in vitro maturation (IVM), dan lain-lain. IVM merupakan salah satu teknik dalam kultur sel yang dilakukan untuk mendapatkan oosit/ovum yang matang yang kemudian oosit tersebut nantinya digunakan untuk kepentingan lebih lanjut. Oosit hasil IVM selanjutnya digunakan sebagai bahan dasar untuk keperluan penelitian parthenogenesis, IVF, dan untuk keperluan sebagai sel resipien pada teknik transfer inti (cloning). B. Tujuan 1. Untuk mengetahui dan memahami tahap-tahap yang dilakukan dalam IVM. 2. Untuk mengetahui dan memahami perkembangan oosit yang dimaturasi secara in vitro. C. Alat dan Bahan Tabung Reaksi Rak Tabung Bunsen Korek Api Erlenmeyer Botol Tutup Ulir Petridish Besar Selotip Kertas Sprayer Botol Koleksi Laminar Air Flow (LAF) Gunting Aluminium Foil Falcon Parafilm Spuit 10 ml Mikropipet Blue Tip Yellow Tip Inkubator CO2 Hematokrit Selang Infus Masker Sarung Tangan Filter Millipore Petridish kecil Alkohol 70% Spiritus Tissue Kertas Label Deionized Water (DI) NaCl 0,9% TCM 199 (Stock) FBS Penicillin Parafin Oil Streptomycin D. Cara Kerja 1. Pembuatan Medium IVM a. Ambil 9 ml medium stok dan tambahkan 1 ml serum FBS, masukkan ke dalam tabung reaksi (tabung 1: medium berserum 10%). Sedangkan pada tabung lain ambil 9,5 ml medium stok dan tambahkan 500µl serum FBS (tabung 2: medium berserum 5%). Sementara itu tabung 3 berisi 5 ml medium stok.

21 b. Filter medium pada masing-masing tabung reaksi dengan menggunakan Millipore ukuran 0,22µm. c. Ambil 25 µl medium berserum 10% masukkan dalam falcon (buat bentuk drop), tambahkan paraffin oil. Tambahkan kembali 25 µl medium berserum dan berikutnya tambahkan kembali paraffin oil. Lakukan hal yang sama sampai drop yang dibentuk berisi 100µl medium berserum 10%. Sisa medium yang dibuat drop tuang pada petridish kecil (bagi menjadi 3 petridish). d. Inkubasi dalam incubator CO 2 sampai saat digunakan. 2. IVM a. Koleksi ovarium dari RPH Potong jaringan ikat yang melekat pada ovarium dan cuci sampai bersih dengan menggunakan NaCl 0,9% yang sudah ditambah dengan penicillin dan streptomycin. Jika sudah bersih masukkan dalam botol koleksi yang juga berisi NaCl 0,9% dan penicillin serta streptomycin. Masukkan botol koleksi ke dalam termos yang berisi air hangat. Bawa ke laboratorium. b. Aspirasi oosit Di laboratorium masukkan ovarium hasil koleksi dari RPH ke dalam waterbath pada suhu 38 o C, Dalam kondisi steril aspirasi oosit melalui folikel antral yang berdiameter 3-7mm dengan menggunakan disposable syringe 10ml dan jarum berukuran 21 G (spuit diisi dengan 0,5-1ml washing medium). Tempatkan hasil aspirasi dalam tabung reaksi yang berada dalam waterbath yang sama. Tambahkan 5 ml medium tidak berserum. c. Washing oosit Endapkan hasil aspirasi dalam tabung reaksi selama 10 menit. Buang supernatant (bagian atasnya) sisakan 1-2ml, tambahkan 5 ml medium berserum 5%, biarkan selama 10 menit. Buang kembali supernatant (bagian atasnya) sisakan 1-2ml, tambahkan 4 ml medium berserum 5%, biarkan selama 10 menit. Buang supernatant (bagian atasnya) sisakan 1 ml. Tuang pellet ke dalam petridish kecil dan bilas sisa pellet pada tabung dengan 1 ml medium berserum 5% dan hasilnya tuang pada petridish kecil tadi. d. Seleksi oosit Dengan menggunakan hematokrit yang telah dihubungkan dengan selang infus, seleksi oosit di bawah mikroskop dengan cara memindahkan dan memilih hanya oosit yang memiliki cumulus

22 oophorus dan corona radiata yang kompak ke dalam petridish kecil yang berisi medium berserum 10%. Lakukan proses pemindahan tersebut sampai 3x. e. Maturasi dan Evaluasi Oosit Dengan menggunakan hematokrit maka oosit yang sudah diseleksi dipindahkan ke dalam drop medium maturasi yang telah diinkubasi minimal 2 jam sebelum. Masing-masing drop isi 5-10 oosit. Inkubasi dalam inkubator CO 2 5%, suhu 38,5 o C selama 1x24 jam. Amati perkembangan sel-sel kumulusnya. Perkembangan sel-sel kumulus dikelompokkan menjadi 3 yaitu kualitas 0 (oosit dengan sel-sel kumulus yang tidak berkembang sama sekali), kualitas 1 (oosit dengan sel-sel kumulus yang berkembang hanya sebagian), dan kualitas 2 (oosit dengan sel-sel kumulus yang berkembang seluruhnya). E. Data Pengamatan Tabel perbedaan jumlah oosit yang matur pada berbagai jam pengamatan Perlakuan Jumlah oosit pada. Jumlah Polar Body (PB) KO K1 K2 Jam ke 26 Jam ke 30 F. Pertanyaan Apakah ada perbedaan jumlah oosit yang berekspansi pada hasil IVM yang sudah dilakukan. Mengapa demikian? Berikan penjelasan.