BAB III METODOLOGI PENELITIAN. menggunakan Post test only control group design diasumsi bahwa semua

Transkripsi

1 BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen murni (True Experiment) karena penelitian ini telah memenuhi tiga prinsip, yaitu: randomisasi, replikasi dan adanya kelompok atau perlakuan atau banding dengan menggunakan Post test only control group design diasumsi bahwa semua karakteristik adalah sama antar unit populasi dengan metode dilusi untuk mengetahui efek antimikroba rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) dengan konsentrasi yang berbeda-beda terhadap bakteri Shigella dysenteriae secara in vitro. P P P P4 P5 O O O O4 O5 Rd P 6 P 7 P 8 P 9 P 0 K 0 K O6 O7 O8 O9 O0 O O Gambar. Skema Design Penelitian (The postest only control group design) 4

2 44 Keterangan : Rd ; Randomisasi P ; perlakuan metode rebusan 0 = pengukuran P ; perlakuan metode rebusan 0 = pengukuran P ; perlakuan metode rebusan 0 = pengukuran P4 ; perlakuan metode rebusan 4 04 = pengukuran 4 P5; perlakuan metode rebusan 5 05 = pengukuran 5 P6; perlakuan metode rebusan 6 06 = pengukuran 6 P7; perlakuan metode rebusan 7 07 = pengukuran 7 P8; perlakuan metode rebusan 8 08 = pengukuran 8 P9; perlakuan metode rebusan 9 09 = pengukuran 9 P0; perlakuan metode rebusan 0 00 = pengukuran 0 K 0 : perlakuan kontrol positif 0 = pengukuran K:perlakuan kontrol negatif 0= pengukuran Penelitian ini menggunakan faktor dan perlakuan kontrol, jumlah ulangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kali ulangan, karena telah memenuhi persamaan (r-)(r-) 5 dimana t= jumlah perlakuan dan r= jumlah ulangan (Hanifiah dan Kemas 99). Adapun denah Rancangan Acak Lengkap disajikan dalam gambar berikut: Gambar. Denah Rancangan Acak Lengkap AB40 AB00 AB60 AB0 AB80 K AB40 AB40 AB00 AB50 AB0 K AB70 AB0 AB50 AB60 K- AB AB70 AB0 AB0 AB60 K- AB90

3 AB70 AB0 AB00 K- K- K AB0 AB0 AB50 AB0 AB90 AB80 Keterangan : AB0 : AB0 : AB0 : AB40 : AB50 : AB60 : AB70 : AB80 : AB90 : AB00 : K (-) K (+) konsentrasi 0%. konsentrasi 0%. konsentrasi 0%. konsentrasi 40%. konsentrasi 50%. konsentrasi 60%. konsentrasi 70%. konsentrasi 80%. konsentrasi 90%. konsentrasi 00%. Media agar yang ditanami bakteri Shigella dysenteriae dan kontrol negatif (Aquades). Media agar yang ditanami bakteri Shigella dysenteriae dan kontrol positif (Tetrasiklin).

4 46. Tempat dan Waktu Penelitian Pembuatan rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) dan pengujian terhadap diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Shigella dysenteriae dilakukan di Laboratorium Biologi Universitas Muhammadiyah Malang yang beralamat di Jl. Raya Tlogomas No. 46 Malang.. Populasi dan Sampel.. Populasi Menurut Sugiyono (0), populasi adalah wilayah generalisasi yang terdiri atas obyek/subyek yang mempunyai kualitas dan karakteristik tertentu yang ditetapkan oleh peneliti untuk dipelajari dan kemudian ditarik kesimpulannya. Populasi bukan hanya orang tetapi obyek dan benda-benda alam yang lain. Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan bakteri Shigella dysenteriae yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang... Sampel Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah simple random sampling, yaitu teknik pengambilan sampel dengan cara acak sehingga setiap satuan sampling yang ada dalam populasi mempunyai peluang yang sama untuk dipilih ke dalam sampel (Rofieq, 05). Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan bakteri Shigella dysenteriae dengan kepadatan yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi MIPA Universitas Negeri Malang. Pengambilan sampel dengan menggunakan teknik random sampling yang merupakan pengambilan sampel acak sederhana dimana seluruh unit populasi mempunyai

5 47 kesempatan untuk menjadi sampel. Dimana untuk mengetahui jumlah sampel, maka harus mengetahui berapa jumlah ulangan. Menurut Sufianto (009), cara menghitung jumlah ulangan yang diperlukan pada penelitian yaitu dengan menggunakan rumus sebagai berikut: (r-)(t-) 5 keterangan t : Treatment (perlakuan) r : Replikasi (ulangan) (r-) (t-) 5 (r-) (-) 5 (r-) () 5 r 5 r 5+ r 6 r,6 atau dibulatkan r Jadi ulangan yang digunakan peneliti adalah sebanyak kali ulangan dalam setiap metode rebusan. Dalam penelitian ini sekelompok subyek yang diambil dari populasi tertentu di kelompokkan secara acak adalah kali metode rebusan dengan kali ulangan, sehingga unit sampel yang digunakan untuk penelitian ini adalah 6 unit biakan Shigella dysenteriae dalam cawan petri..4 Variabel Penelitian.4. Variabel Bebas Variabel bebas adalah variabel yang mempengaruhi atau yang menjadi sebab perubahannya atau timbulnya variabel dependen (Sugiyono, 0). Variabel

6 48 bebas adalah variabel yang sengaja dipilih dan direncanakan dengan sengaja diukur variasinya untuk diketahui pengaruhnya terhadap variabel yang diamati. Variabel bebas dari penelitian ini adalah rebusan daun sirih (Piper betle L.) dengan berbagai konsentrasi 0%, 0%, 0%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 00%..4. Variabel Terikat Variabel terikat adalah variabel yang dipengaruhi atau yang menjadi sebab akibat, karena adanya variabel bebas (Sugiyono, 0).Variabel terikat adalah sejumlah faktor yang diukur untuk mengetahui dampak adanya perubahan dari variabel bebas. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat antimikroba rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) terhadap bakteri Shigella dysenteriae.4. Variabel kontrol Variabel kontrol adalah unsur atau gejala yang sengaja dikendalikan supaya tidak mempengaruhi variabel bebas maupun variabel terikatnya. Variabel kontrol dalam penelitian ini yaitu meliputi dua jenis kontrol positif (tetrasiklin) dan () kontrol negatif (aquades) dengan lama inkubasi (4) suhu 7 0 C..5 Definisi Operasional Variabel Memperjelas maksud dari penelitian ini, maka setiap variabel perlu didefinisikan sebagai beirkut: ) Merebus daun sirih hijau (Piper betle L.) adalah cara yang digunakan untuk memperoleh cairan dari daun sirih hijau (Piper betle L.) dan aquades yang dipanaskan pada suhu 90 o C selama 5 menit, dengan

7 49 ketentuan sebanyak 00 gr daun sirih hijau (Piper betle L.) kemudian dicampur dengan 00 ml aquades, ketentuan ini diambil dari dosis yang biasa dilakukan masyarakat dalam menakar, sekitar 0-0 gram simplisia segar (daun sirih hijau segar) dengan penambahan air gelas yakni sebanyak 600 ml (Sundari dkk, 05). ) Konsentrasi adalah banyaknya zat terlarut yang dibandingkan dengan jumlah pelarut pelarut (Laksono, 04). Konsentrasi dalam penelitian ini memakai perhitungan %. Konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0% (kontrol) dan 0%, 0%, 0%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, dan 00%. ) Daun sirih hijau (Piper betle L.) merupakan jenis tumbuhan perdu merambat dan bersandarkan pada batang pohon lain, batang berkayu, berbuku-buku, beralur, warna hijau keabu-abuan, daun tunggal, bulat panjang, warna hijau, perbungaan bulir, warna kekuningan, buah buni, bulat, warna hijau keabu-abuan (Damayanti dkk, 006). 4) Suhu inkubator adalah temperatur didalam alat inkubator yang sudah diatur agar tetap stabil pada suhu 7 o C, supaya bakteri Shigella dysenteriae yang ditanam pada media perbenihan dapat tumbuh dengan baik. 5) Lama inkubasi dalam inkubator adalah waktu yang diperlukan supaya bakteri Shigella dysenteriae dapat tumbuh optimal yaitu sekitar 4 jam.

8 50 6) Jenis media adalah media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba yang mengandung bahan makanan dan nutrisi bagi mikroba. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Shigella dysenteriae. 7) Diameter zona hambat adalah suatu area bening yang ada disekitar paper disk yang menunjukkan kemampuan rebusan dalam menghambat bakteri Shigella dysenteriae. Pengukuran diameter zona hambat menggunakan alat yang disebut jangka sorong dengan pengukuran yang berawal dari tepi daerah zona hambat yang terpanjang lainnya. Sedangkan satuan pengukurannya digunakan mm..6 Prosedur Penelitian Prosedur penelitian ini memerlukan tahap, yaitu: tahap persiapan, tahap pelaksanaan, dan tahap pengamatan..6. Persiapan Penelitian Persiapan sebelum melakukan kegiatan penelitian dilaboratorium ada beberapa hal yang harus dipersiapkan, yaitu: Alat A. Pembuatan Rebusan Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) ) Saringan buah ) Kertas saring secukupnya ) Kompor gas buah 4) Panci buah 5) Beaker Glass 5 buah 6) Timbangan analitik buah

9 5 B. Alat Pengujian Daya Antimikrobial Sterilisasi dan Pembuatan Media ) Autoclave buah ) Timbangan Analitik buah ) Magnetik Stirrer buah Erlenmeyer 4) 500 ml buah 5) Beaker Glass 50 ml buah 6) Gelas Ukur 00 ml buah 7) Cawan Petri D-0 cm 6 buah 8) Tabung reaksi 6 buah 9) Rak Tabung Reaksi buah 0) Pipet Tetes 5 buah C. Pembuatan Suspensi Bakteri Shigella dysenteriae dan Mac Farland ) LAF buah ) Cawan Petri 6 buah ) Bunsen buah 4) Jarum Ose buah 5) Tabung Reaksi 6 buah 6) Rak Tabung Reaksi buah D. Inokulasi dan Perlakuan ) Inkubator buah ) Batang Sebar buah ) LAF buah

10 5 4) Fortex buah 5) Pinset buah 6) Bunsen buah E. Pembacaan Hasil (Pengukuran Diameter Zona Hambat) ) Jangka Sorong buah.6. Bahan A. Bahan Pembuatan Rebusan Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) ) Daun segar hijau (Piper betle L.) 00 gram ) Aquades 00 gram B. Bahan Pembuatan Suspensi Bakteri Shigella dysenteriae ) Isolat murni bakteri Shigella dysenteriae ) Larutan Barium Clorida (BaCl ) % 0,05 ml ) Asam Sulfat (H SO 4 ) % 9,95 ml C. Bahan Pembuatan Media dan Inokulasi ) Media Nutrient Agar ) Isolat Bakteri Shigella dysenteria tabung ) Aquadest 00 ml 4) Paper Disk 6 lembar 5) Alkohol 70% (dalam botol semprot) 00 ml 6) Spirtus 00 ml 7) Kertas Label secukupnya 8) Plastik Warb secukupnya 9) Kapas DAN Alumunium Foil secukupnya

11 5.6. Pelaksanaan Penelitian. Sterilisasi Alat a. Mencuci semua alat yang terbuat dari gelas dengan sabun sampai bersih dan membiarkan sampai kering. b. Membungkus semua peralatan dengan kertas sampul c. Semua alat disterilkan dengan autoklaf dengan suhu o C dengan tekanan 5 atm selama 5 menit.. Pembuatan media. Pembuatan rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) a. Mencuci bersih daun sirih hijau (Piper betle L.) b. Menimbang daun sirih hijau (Piper betle L.) yang masih segar sebanyak 00 gram c. Memasukkan daun sirih hijau (Piper betle L.) kedalam panci yang sudah mendidih airnya kurang lebih 5 menit dengan suhu 90 o C d. Mendiamkan sampai dingin e. Menyaring dengan kerta saring f. Melakukan pengenceran sesuai dengan konsentrasi perlakuan yaitu 0%, 0%, 0%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 00%.. Pembuatan NA (Nutrient Agar) ) Menimbang bubuk NA Perhitungan pembuatan Nutrient Agar 6 cawan petri = 6 cp x 5 ml = 540 ml Gram NA =

12 54 = = 0,8 gram ) Menambahkan aquadest steril pada bubuk NA sesuai dengan kebutuhan. ) Mengaduk bahan hingga homogen. 4) Menghomogenkan larutan NA hingga tercampur menggunakan magnetic stirrer dengan suhu 00 o C dan kecepatan 8 rpm. 5) Mendinginkan hasil larutan kemudian dituang kedalam cawan petri sebanyak 5 ml. 6) Membiarkan suspensi padat dan menyimpannya ke dalam LAF selama 4 jam (dalam ruangan steril dengan menyemprotkan desinfektak alkohol 70%). 4. Pembuatan Suspensi Larutan Mac Farland nomor tabung 0,5 digunakan dengan membandingkan kekeruhan biakan bakteri dalam media cair dengan kepadatan,5 x 0 8 sel/ml dengan langkah sebagai berikut: ) Membuat larutan dengan memasukan 0,05 ml Barium Clorida (BaCl ) %. ) Membuat larutan dengan memasukkan 9,95 ml Asam Sulfat (H SO 4 ) %. ) Mencampur kedua larutan pada tabung reaksi, dengan perbandingan 0,05 ml BaCl % dan 9,95 ml H SO 4 %. 4) Menyimpan larutan dalam suhu kamar dan tempat gelap serta tidak terkena sinar matahari langsung. 5) Mengambil -7 koloni biakan Shigella dysenteriae dan diencerkan dengan aquades 0 ml sampai tercapai larutan homogen untuk mendapatkan kepadatan bakteri yaitu,5 x 0 8 sel/mm. 6) Membandingkan dengan larutan standar Mac Farland 0,5. Jika biakan bakteri

13 55 Shigella dysenteriae belum sama dengan larutan pembanding, maka ditambahkan bakteri dengan jarum ose hingga sama kekeruhannya. Tabel. Standar Mac Farland No. Tabung BaCl % (ml) H SO 4 % (ml) Jumlah Koloni (08/ml) 0,5 0,05 9,95,5 0, 9,9 0, 9,8 6 0, 9, ,4 9,6 5 0,5 9, ,6 9, ,7 9,4 8 0,8 9, 4 9 0,9 9, 7 0 0,0 9,0 0 (Sumber: Riyanto, 0 dalam Maslikah, 04) 5. Inokulasi Bakteri Shigella dysenteriae ) Mendinginkan selama beberapa saat media NA untuk menghilangkan uap air pada cawan petri. ) Mengambil suspensi Shigella dysenteriae yang telah diencerkan dengan cara menuangkan pada cawan petri, kemudian menginokulasi secara merata pada permukaan NA dengan teknik sinambung menggunakan swap hal ini dapat dilihat pada gambar. di bawah ini:

14 56 Gambar. Teknik Sinambung ) Merendam paper disk pada botol flakon yang sudah terdapat berbagai konsentrasi rebusan daun sirih hijau selama 5 menit. 4) Memasukan paper disk ke dalam cawan petri yang telah terisi media NA dan ditanam tepat ditengah-tengah media. 5) Menutup cawan petri, kemudian dipanaskan 80 C diatas api bunsen dengan memutar-mutar agar cawan petri lebih steril. 6) Membungkus dan melapisi bagian tepi cawan petri menggunakan plastic wrap, kemudian membungkus kembali menggunakan kertas yang disterilkan dengan alkohol 70%. 7) Menginkubasi pada suhu 7 C selama x 4 jam dengan posisi terbalik..7 Pengamatan Penelitian a. Setelah diinkubasi selama 4 jam dengan suhu 7 0 kemudian meletakkan cawan-cawan petri berderet diatas meja sesuai dengan perlakuannya. b. Meletakkan cawan petri secara terbalik, dalam hal ini tutup cawan petri tidak dibuka. c. Mengukur zona hambat pada masing-masing perlakuan dengan sorong setelah x 4 jam.

15 57.8 Teknik Pengambilan Data Penelitian ini menggunakan teknik pengumpulan data dengan observasi hasil eksperimen, yaitu teknik pengambilan data secara langsung dengan prosedur yang melibatkan kegiatan melihat dan mencatat aktivitas. Observasi dilakukan dilaboratorium terhadap obyek perlakuan. Observasi eksperimen yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu variabel terikat yang sebelumnya telah diberi perlakuan, kemudian data yang diperoleh dicatat ke dalam tabel. Tabel. mencakup pengukuran rerata diameter daerah hambat yang dibentuk oleh Shigella dysenteriae setelah diberi perlakuan dengan berbagai konsentrasi air rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) kemudian dokumentasi merupakan teknik mengumpulkan data setelah kegiatan observasi berhasil dilakukan, kemudian melakukan pengamatan dan memotret. Tabel. Data Rerata Diameter Zona Hambat Perlakuan konsentrasi (%) 0% 5% 0% 5% 0% Kontrol (+) Ulangan I II III Rerata.9 Teknik Analisis Data Analisis data yang dilakukan dalam penelitian ini adalah perhitungan SPSS menggunakan uji One Way ANOVA untuk melihat apakah ada perbedaan efektif dari masing-masing konsentrasi rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.). Syarat ketentuan uji One Way ANOVA adalah data berdistribusi normal dan varians data

16 58 sama atau homogen, sehingga dapat dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA, uji ini digunakan untuk menguji apakah Ho ditolak atau diterima dan menguji suatu efek, akibat atau pengaruh dari suatu variabel tertentu yang diteliti. Uji lanjut setelah ANOVA yaitu dengan Uji Beda Jarak Duncan s. Uji ini dilakukan untuk menentukan atau memilih perlakuan yang terbaik atau paling efektif dari sejumlah dan perlakuan dengan berdasarkan pada nilai rerata. Perbedaan perlakuan yang diikuti notasi huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata, sedangkan perlakuan yang diikuti dengan notasi huruf yang tidak sama menunjukkan berbeda nyata.

17 59.0 Alur Kerja Pelaksanaan Penelitian Mensterilkan alat dan bahan yang digunakan Mengencerkan rebusan daun sirih hijau dengan macam konsentrasi Siapkan suspensi bakteri Shigella dysenteriae Membuat media NA dan masukkan ke cawan petri Merendam paper disk selama 5 menit didalam setiap konsentrasi rebusan daun sirih hijau Mengoleskan secara merata suspensi bakteri Shigella dysenteriae pada media NA Meletakan paper disk yang telah direndam dalam rebusan daun sirih hijau diatas media NA Inkubasi selama 8-4 jam di dalam inkubator dengan suhu 7 o C Melakukan pengukuran diameter zona hamba (daerah bening)) disekitar cakram. Analisis hasil Gambar.4 Bagan Alur Pelaksanaan Pengujian Daya Antimikroba Rebusan Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) terhadap Pertumbuhan Bakteri Shigella dysenteriae secara in vitro