BAB IV METODE PENELITIAN. Post test only control group design (Marczyk dkk., 2005). Bagan rancangan

Transkripsi

1 BAB IV METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Rancangan penelitian ini bersifat eksperimental murni (true experiment), memakai kelompok kontrol dengan menggunakan rancangan Post test only control group design (Marczyk dkk., 2005). Bagan rancangan penelitian sebagai berikut : S RA P 0 O 0 P 1i O 1i P 2 j O 2j P 3k O 3k Gambar 4.1 : Rancangan Penelitian Keterangan S = Sampel Streptococcus mutans ATCC R A = Random Alokasi = Perlakuan yang diberi aquadest steril P 0 O 0 = Observasi P 0 P 1i = Kelompok perlakuan yang diberi larutan garam dapur bermerk (i= 4%, 6%, dan 8%) O 1i = Observasi P 1i (i= 4%, 6%, dan 8%) P 2j = Klompok perlakuan yang diberi larutan garam dapur tidak bermerk (j= 4%, 6%, dan 8%) O 2j = Observasi klompok P 2j (j= 4%, 6%, dan 8%) P 3k = Klompok perlakuan yang diberi larutan iodium yang konsentrasinya dibuat setara dengan konsentrasi garam beriodium bermerk (k= 4%, 6%, dan 8%) O 3k = Observasi klompok P 3k (k= 4%, 6%, dan 8%) 1

2 2 4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Waktu yang diperlukan adalah 2 bulan, yaitu April - Mei Penentuan Populasi dan Sampel Penelitian ini menggunakan bakteri, sehingga penentuan besar sampel ditetapkan sesuai dengan penetapan baku uji bakteri yaitu menggunakan 10 8 bakteri. Untuk mendapatkan data yang valid dilakukan pengulangan sesuai rumus Federer (1977) : (n-1) (t-1) 15 n = banyak pengulangan t = perlakuan, dalam hal ini ada 10 perlakuan P 0, ( P 1i, P 2j, P 3k masingmasing dengan 3 konsentrasi), sehingga: (n-1) (10-1) = 15 (n-1) (9) = 15 n-1 = 159 = 1,667

3 3 n= 1, = Jadi banyaknya pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebanyak 3 kali. 4.4 Variabel Penelitian Variabel bebas Larutan garam dapur beriodium (bermerk dan tidak bermerk) dan larutan iodium yang konsentrasinya dibuat setara dengan konsentrasi garam beriodium bermerk Variabel tergantung Zona hambatan Streptococcus mutans Variabel terkendali a. Suhu dan waktu pengeraman Streptococcus mutans. b. Media pengeraman dan pembuatan Streptococcus mutans. c. Cara penghitungan zona hambat terhadap Streptococcus mutans. d. Sterilisasi alat dan bahan. 4.5 Definisi Operasional Variabel a. Larutan garam dapur tidak bermerk dan bermerk dengan konsentrasi 4%, 6%, dan 8% adalah larutan yang dibuat dengan menimbang masingmasing 4, 6, dan 8 g garamnya dilarutkan masing-masing ke dalam 100 ml

4 4 akuades. Untuk lebih mendapatkan data yang valid masing-masing garam yang dibuat dianalisis kandungan iodiumnya secara iodatometri. b. Larutan iodium adalah larutan iodium murni yang konsentrasi iodiumnya dibuat setara dengan iodium pada garam dapur bermerk konsentrasi 4%, 6%, dan 8% c. Zona hambatan Streptococcus mutans adalah zona bening yang terbentuk karena kemampuan larutan dalam menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans. d. Cara penghitungan zona hambatan terhadap Streptococcus mutans adalah mengukur zona hambat yang tampak dengan menggunakan jangka sorong dengan tingkat ketelitian 0,02 mm. 1) Diameter zona bening 20mm atau lebih berarti mempunyai daya hambat yang sangat kuat 2) Diameter zona bening 10mm-20mm berarti mempunyai daya hambat kuat 3) Diameter zona bening 5mm-10mm berarti mempunyai daya hambat sedang 4) Diameter zona bening < 5mm berarti mempunyai daya hambat lemah (Dewi, 2010). e. Media pengeraman adalah media yang dipakai untuk menumbuhkan Streptococcus mutans dalam hal ini berbentuk agar, yang dipakai adalah Mueller-Hinton (MH) agar + darah kambing.

5 5 f. Sterilisasi alat dan bahan adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam kehidupan, terutama kehidupan mikroorganisme 4.6 Bahan Penelitian. a. Larutan garam dapur beriodium 4%, 6%, dan 8% (bermerk dan tidak bermerk). b. Larutan Iodium yang konsentrasi iodiumnya dibuat setara dengan iodium pada garam dapur bermerk konsentrasi 4%, 6%, dan 8%. c. Akuades steril. d. Streptococcus mutans ATCC e. Mueller-Hinton (MH) agar, kode VL dengan merek dagang MERCK. f. Darah Kambing. g. Streptococcal grouping kit. h. Media untuk test biokimia: Mannitol broth, Sorbitol broth, dan Voges proskauer. i. Reagen Kovaʼc. j. Larutan NaCl 0,9%. k. Larutan amilum.

6 6 4.7 Instrumen Penelitian a. Labu erlenmeyer untuk pembuatan media, larutan garam dapur beriodium (bermerk dan tidak bermerk) dan larutan iodium. b. Cawan petri untuk tempat media padat datar atau agar. c. Tabung reaksi untuk tempat media. d. Tabung durham untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. e. Inkubator untuk suasana pertumbuhan optimal bakteri. f. Ose/sengkelit untuk mengambil koloni bakteri. g. Autoclaf untuk sterilisasi alat-alat dan media. h. Lampu spiritus/bunsen untuk flamber bahan dan sterilkan ose. i. Lidi kapas steril. j. Stop watch merk Citizen buatan Jepang untuk mengukur waktu perendaman. k. Jangka sorong merk Vernier Caliper buatan Tricle Brand, Shanghai-China untuk mengukur diameter zona bening. l. Kamera merk Sony buatan Jepang untuk mendokumentasikan kegiatan yang berkaitan dengan penelitian ini. 4.8 Prosedur dan Alur Penelitian Pembuatan media MH agar darah Pembuatan media MH agar darah dilakukan dengan menimbang 6,8 gram bubuk media MH agar, dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi 200 ml akuades lalu diaduk, kemudian di autoclave pada tekanan 121 atm selama 15

7 7 menit. Selanjutnya media ditaruh dalamwater bath hingga suhu ± 50 0 C dan ditambahkan 10 cc darah kambing dan dihomogenkan. Media MH agar yang sudah diproses tersebut dituangkan pada cawan petri steril untuk 10 cawan petri lalu didinginkan hingga beku. Kita ambil 5% dari jumlah total cawan petri yang berisi media dalam hal ini diambil 2 cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 0 C. Keesokkan harinya kita kontrol sterilitas daripada media, jika bening berarti steril bisa kita pakai untuk media penanaman Streptococcus mutans Peremajaan isolat Streptococcus mutans Dari stok Streptococcus mutans kita ambil dengan ose steril beberapa koloni kemudian kita goreskan ke media MH agar darah, lalu masukkan ke dalam inkubator untuk diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 0 C keesokan harinya akan terlihat koloni kecil-kecil, lembut berwarna bening Uji grup Streptococcus mutans Memakai Streptococcal grouping kit, sebelumnya enzim dipipet 0,4 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi steril, kemudian koloni Streptococcus mutans pada MH agar darah diambil dengan ose steril dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian dihomogenkan agar tidak menggumpal lalu di inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 0 C selama 10 menit. Dikeluarkan dari inkubator lalu di pipet kemudian ditaruh pada 6 lubang slide grouping kit masing-masing sebanyak 50 µ dan 50 µ lagi untuk kontrol positip dimana selanjutnya pada masing-masing

8 8 lubang ditetesi : lubang 1 serum latex A, lubang 2 serum latex B, lubang 3 serum latex C, lubang 4 serum latex D, lubang 5 serum latex F, lubang 6 serum latex G dan satu lubang untuk kontrol. Masing-masing dihomogenkan dengan batang pengaduk kayu dan digoyang, hasil pengamatan terjadi aglutinasi menunjukkan positip (+) sedangkan bila homogen berarti negatip (-) Identifikasi Streptococcus mutans Pada penelitian ini dilakukan identifikasi Streptococcus mutans menggunakan uji biokimia meliputi: Pembuatan media Mannitol Broth Ditimbang 2 g bubuk Mannitol Broth, dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer yang telah berisi 100 ml akuades steril kemudian dilarutkan, lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan volume ± 5 ml yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik dengan tabung reaksi gunanya untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. Selanjutnya di autoklaf. Kita ambil 5% dari jumlah total tabung reaksi yang berisi media dalam hal ini diambil 4 tabung reaksi dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 0 C. Keesokkan harinya kita kontrol sterilitas daripada media, jika bening berarti steril bisa kita pakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans Pembuatan media Sorbitol Broth

9 9 Ditimbang 2 g bubuk Sorbitol Broth dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer yang telah berisi 100 ml akuades steril kemudian dilarutkan, lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan volume ± 5 ml yang telah berisi tabung Durham dengan posisi terbalik dengan tabung reaksi gunanya untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh bakteri. Selanjutnya di autoklaf, diambil 5% dari jumlah total tabung reaksi yang berisi media, dalam hal ini diambil 4 tabung reaksi dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 0 C. Keesokkan harinya, dilihat sterilitas media, jika bening berarti steril bisa dipakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans Pembuatan media Voges Proskauer Ditimbang 1,7 g bubuk Voges Proskauer, dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer yang telah berisi 100 ml akuades steril kemudian dilarutkan, lalu dituang ke dalam tabung reaksi dengan volume ± 5 ml. Selanjutnya di autoklaf. Kita ambil 5% dari jumlah total tabung reaksi yang berisi media dalam hal ini diambil 4 tabung reaksi dimasukkan ke dalam inkubator untuk di inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 0 C. Keesokkan harinya kita kontrol sterilitas media, jika bening berarti steril bisa kita pakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans. Media uji biokimia di atas siap dipakai untuk media identifikasi Streptococcus mutans. Koloni Streptococcus mutans pada MH agar darah diambil dengan ose steril dimasukkan ke masing-masing media di homogenkan kemudian di inkubasi pada

10 10 inkubator dengan suhu 37 0 C selama 24 jam, hasil pengamatan menunjukkan adanya kekeruhan dan perubahan warna (kuning) pada media Mannitol Broth dan Sorbitol Broth, sedangkan pada media Voges Proskauer terjadi kekeruhan yang ditambah dengan reagent Kovaʼc berubah menjadi merah anggur. Perubahanperubahan tersebut menunjukkan bahwa koloni tersebut benar Streptococcus mutans Membuat suspensi Streptococcus mutans Dari koloni yang tumbuh pada media MH agar darah, diambil 1-2 koloni dimasukkan ke dalam media NaCl 0,9%, dibuat kekeruhan setara dengan 0,5 Mac-Farland. Lidi kapas steril kita celupkan ke dalam suspensi di atas, lidi kapas steril yang sudah dicelupkan tadi diperas pada dinding tabung supaya cairan yang diambil tidak berlebihan. Kemudian dioleskan secara merata 3 radian pada media MH agar darah Pembuatan larutan garam dapur beriodium Pada penelitian ini digunakan dua jenis garam yaitu; garam rakyat yang diproduksi secara tradisional selanjutnya disebut garam tanpa merk dan garam dapur bermerk serta larutan iodium yang konsentrasi iodiumnya disetarakan dengan konsentrasi iodium garam bermerk. Masing-masing garam tersebut dibuat dengan konsentrasi 4, 6, dan 8%. Hal ini dilakukan dengan menimbang masing-

11 11 masing 4, 6, dan 8 g garamnya dan dilarutkan masing-masing ke dalam 100 ml akuades. Untuk lebih mendapatkan data yang valid masing-masing garam yang dibuat dianalisis kandungan iodiumnya secara iodatometri Mengukur efektifitas larutan garam dapur beriodium terhadap Streptococcus mutans. Siapkan 9 cawan petri yang berisi Mueller-Hinton (MH) agar darah kambing dan 40 paper disk dengan diameter 5mm. Pada masing - masing larutan garam dapur beriodium dengan konsentrasi 4%, 6% dan 8% (bermerk dan tidak bermerk) juga larutan iodium dengan konsentrasi yang setara dengan larutan garam dapur beriodium yang bermerk dimasukkan 3 paper disk sedangkan untuk kontrol negatifnya dipakai akuades steril selama 60 detik, lalu paper disk dikeluarkan dan dikeringkan pada petri disk steril selama ± 10 menit agar jangan terlalu kering, kemudian dish tersebut kita tempelkan di atas media Mueller- Hinton (MH) agar darah kambing, selanjutnya diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 0 C selama 24 jam. Keesokan harinya kita lihat dan ukur zona bening yang terbentuk. 4.9 Alur Penelitian Untuk lebih memudahkan dalam pelaksanaan penelitian, maka dibuat alur penelitian, seperti ditunjukkan dengan Gambar 4.8.

12 12 Isolat Streptococcus mutans Peremajaan Streptococcus mutans Kontrol Aquadest steril Klompok 1 Larutan garam dapur ber-merk 4%, 6%, dan 8% Klompok 2 Larutan garam dapur tidak bermerk 4%, 6%, dan 8% Klompok 3 Larutan iodium dg konsentrasi iodiumnya setara dg konsentrasi iodium garam dapur bermerk 4%, 6%, dan 8% Mengukur Diameter Zona Hambat Data Zona Hambat

13 13 Analisis Data Simpulan Penelitian Gambar 4.8 : Alur Penelitian 4.10 Analisis Data Untuk menganalisis data hasil penelitian dilakukan langkah-langkah: semua data dideskripsikan untuk memberikan gambaran tentang karakteristik data yang didapatkan dari hasil penelitian. Analisis perbedaan perlakuan dilakukan menggunakan SPSS sesuai dengan berikut ini: Uji normalitas dan homogenitas : a. Uji Normalitas dengan uji Kolmogorov-Smirnov (KS) oleh karena sampelnya > 30 b. Uji Homogenitas dengan uji Levene s test Uji efek perlakuan Dalam penelitian ini didapatkan bahwa data tidak berdistribusi normal maka digunakan uji non parametrik yaitu uji Kruskal-Wallis. Dilakukan untuk membandingkan rerata data hasil pengukuran pada post test yaitu antara O 0, O 1i, O 2j, dan O 3 (Handoko, 2007; Anonim, 2008).

14 14 Pada penelitian ini, juga dilakukan analisis regresi linier untuk menentukan apakah peningkatan konsentrasi garam dapat digunakan sebagai prediktor peningkatan zona hambat Streptococcus mutans.