MATERI DAN METODE. Materi

Transkripsi

1 MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan mulai September 2011 sampai dengan Februari Materi Alat Alat- alat yang digunakan pada penelitian adalah tabung reaksi, tutup karet, Erlenmeyer, pipet mohr, pipet volumetric, mikro pipet, bulb, gelas ukur, autoclave, tabung fermentor, tutup tabung fermentor, shaker water bath, gelas ukur, hot plate, tabung CO 2, kulkas, freezer, bunsen, spoit, magnetic stirer, sprayer, ph meter, timbangan digital, vortex, cawan porselin, cawan Conway, labu destilasi, press cooker, oven 60 o C, oven 105 o C, tanur listrik 600 o C, buret, vacum, dan alumunium foil. Bahan Pakan yang digunakan sebagai sumber nutrien dalam media tumbuh bakteri pada penelitian ini yaitu Calliandra callotyrsus, Leucaena leucocephala, Indigofera sp., Gliricidia sepium, jagung, onggok, dan urea. Sumber inokulum yang digunakan yaitu enam isolat bakteri (A27, I8, A9, A3, B61, B6) rumen kerbau yang biasa mengkonsumsi hijauan lokal dengan kualitas nutrisi rendah dan berserat kasar tinggi di Jonggol, Bogor, Jawa Barat. Isolat bakteri yang digunakan telah terbukti mampu mendegradasi serat kasar dan termasuk bakteri selulolitik (Astuti, 2010; Gayatri, 2010). Sumber bakteri yang digunakan sebagai pembanding yaitu cairan rumen sapi segar dari rumah potong hewan PT Elders. Disamping cairan rumen segar (fresh rumen fluid) digunakan juga cairan rumen yang telah disterilisasi digunakan sebagai sumber nutrien untuk isolat bakteri rumen. Bahan-bahan kimia yang digunakan untuk peremajaan bakteri adalah Brain Heart Infusion (BHI), glukosa, cellebiosa, pati, cystein-hcl, hemin, resazurin, gas CO 2, larutan McDougall, aquades, larutan HgCl 2, 15

2 larutan pepsin, HCl, Na 2 CO 3 jenuh, asam borat berindikator, H 2 SO 4 0,005N, NaOH 0,5N, H 2 SO 4, indikator fenolftalein (pp), dan HCl 0,5N. Prosedur Kajian 1. Kajian Fermentatif dan Kecernaan Pakan Sumber Protein In Vitro Kajian pertama mengevaluasi sifat fermentatif dan kecernaan bahan pakan sumber protein oleh isolat bakteri pencerna serat asal rumen kerbau. Bahan pakan yang digunakan adalah Calliandra calothyrsus, Leucaena leucocephala, Indigofera sp., dan Gliricidia sepium. Persiapan Sampel Pakan. Sampel leguminosa diperoleh dari laboratorium lapang Agrostologi, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Sampel leguminosa yang sudah diambil di lapangan segera ditimbang untuk mengetahui bobot segarnya, kemudian dilakukan penjemuran dengan sinar matahari dan ditimbang. Sampel dimasukkan ke dalam oven 60ºC hingga bobotnya stabil. Sampel hasil pengeringan ditimbang dan digiling. Sampel yang sudah digiling dinalisis kandungan nutriennya menggunakan metoda proksimat. Gambar 1. Sampel Hijauan Leguminosa Pembuatan Media Brain Heart Infusion (BHI) dan Peremajaan Bakteri. Sebanyak 3,7 g BHI powder, 0,05 g pati, 0,05 g glukosa dan 0,05 g cellebiosa dilarutkan dengan 100 ml aquades dan dihomogenkan. Setelah itu, dipanaskan hingga larut kemudian ditambahkan 0,05 g cystein-hcl, 1 ml resazurin dan 0,5 ml hemin dan dialiri dengan CO 2 selama kurang lebih 20 menit, lalu dimasukkan ke 16

3 dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml dan disterilisasi dalam autoclave selama menit (Schlegel, 1994). Media basal BHI sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian dialiri CO 2, tabung ditutup dengan prote karet dan dilapisi panfix. Isolat bakteri disuntikkan sebanyak 0,25 ml, kemudian dikocok agar bakteri tercampur dan dapat tumbuh pada media yang digunakan. Tabung kemudian disimpan di shaker water bath selama 6 jam dengan suhu 39ºC. Gambar 2. Media BHI Pengukuran Kecernaan Bahan Kering dan Bahan Organik In Vitro. Pengukuran kecernaan bahan kering dan bahan organik dilakukan menurut metode Tilley dan Terry (1963). Sampel cairan rumen diambil dari sapi yang baru dipotong di rumah potong hewan (RPH) PT Elders yang terletak dalam kampus Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Isi rumen diperas dan filtratnya dimasukkan ke dalam termos. Sampel cairan rumen dipertahankan pada suhu 39 o C dalam termos hingga digunakan. Tabung fermentor yang telah diisi dengan 0,5 g sampel, ditambah 40 ml larutan McDougall. Tabung dimasukkan ke dalam shaker water bath dengan suhu 39ºC, kemudian diisi 10 ml cairan rumen. Perlakuan isolat bakteri rumen, cairan rumen segar diganti dengan 5 ml cairan rumen steril dan 5 ml campuran isolat bakteri (50% inokulum). Selanjutnya tabung dialiri CO 2 selama 30 detik, ph dicek (6,5-6,9) kemudian ditutup dengan tutup karet berventilasi dan difermentasi selama 48 jam. 17

4 Gambar 3. Fermentasi dalam Shaker Water Bath Setelah fermentasi 48 jam tutup karet tabung fermentor dibuka dan di cek keasamannya (ph), kemudian ditambahkan 2-3 tetes HgCl 2 untuk membunuh mikroba. Tabung fermentor dimasukkan ke dalam sentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Endapan hasil sentrifuge ditambah 50 ml larutan pepsin-hcl 0,2%. Campuran ini diinkubasi kembali selama 48 jam tanpa tutup karet. Hasil pencernaan hidrolisis (residu) disaring dengan kertas saring Whatman no 41 (yang sudah diketahui bobotnya) dengan bantuan pompa vacum. Endapan yang ada pada kertas saring dimasukkan ke dalam cawan porselen, setelah itu dimasukkan ke dalam oven 105ºC selama 24 jam. Setelah 24 jam, cawan porselen dikeluarkan, dimasukkan dalam eksikator dan ditimbang untuk mengetahui kadar bahan keringnya. Selanjutnya bahan dalam cawan diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam, pada suhu ºC, kemudian ditimbang untuk mengetahui kadar bahan organiknya. Sebagai blanko dipakai residu asal fermentasi tanpa sampel. Rumus perhitungan koefisien cerna bahan kering (KCBK) dan bahan organik (KCBO): % KCBK = BK sampel (g) (BK residu (g) BK blanko (g)) x 100% BK sampel % KCBO = BO sampel (g) (BO residu (g) BO blanko (g)) x 100% BO sampel Uji Kemampuan Fermentatif Isolat Bakteri In Vitro. Uji kemampuan fermentasi isolat bakteri in vitro dilakukan sesuai dengan prosedur Tilley dan Terry (1963) tahap pertama atau tahap fermentasi. Sampel yang sudah kering ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan dalam tabung fermentor. Tabung dimasukkan dalam shaker water bath dan ditambahkan larutan McDougall 40 ml dan 10 ml cairan rumen. 18

5 Perlakuan isolat bakteri rumen, cairan rumen diganti dengan 5 ml cairan rumen steril dan 5 ml campuran isolat bakteri (50% inokulum). Tabung fermentor dialiri dengan gas CO 2 selama 30 detik dan ditutup hingga rapat. Setelah diinkubasi selama 4 jam, sampel dikeluarkan dari shaker water bath dan diberi 2-3 tetes larutan HgCl 2 dan ph media diukur. Kadar NH 3 dan VFA supernatan dari sentrifugasi pada 3500 rpm selama 15 menit diukur. Supernatan dimasukkan ke dalam tabung film dan dapat disimpan di freezer. Gambar 4. Supernatan untuk Analisis NH 3 dan VFA Pengukuran Konsentrasi NH 3. Konsentrasi NH 3 diukur menggunakan teknik Mikrodifusi Conway (Conway, 1958). Bibir cawan conway dan tutupnya diolesi dengan vaselin, kemudian supernatan yang dihasilkan dari pencernaan fermentatif diambil sebanyak 1 ml dan ditempatkan pada salah satu ruang sekat cawan dan larutan Na 2 CO 3 jenuh ditempatkan pada ruang sekat yang lain. Larutan asam borat sebanyak 1 ml berindikator ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan conway. Selanjutnya cawan conway ditutup rapat agar udara tidak dapat masuk. Supernatan dan larutan Na 2 CO 3 jenuh dicampur hingga merata dengan menggoyang-goyangkan cawan dan memiringkannya. Setelah itu cawan dibiarkan selama 24 jam pada suhu kamar, dan setelah 24 jam cawan dibuka. Pada bagian asam borat selanjutnya dititrasi dengan larutan H 2 SO 4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna biru ke warna asam borat (merah jambu). Konsentrasi NH 3 diukur dengan rumus: N NH 3 (mm) = ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 1000 Sampel (g) x BK sampel 19

6 Gambar 5. Pengukuran Konsentrasi NH 3 Pengukuran Vollatile Fatty Acid (VFA). Konsentrasi VFA diukur dengan menggunakan teknik destilasi uap (Steam destilation) (General Laboratory Procedure, 1966). Sebanyak 5 ml supernatan (berasal dari tabung yang sama dengan supernatan untuk analisa NH 3 ) dimasukkan kedalam tabung destilasi, lalu ditambahkan 1 ml H 2 SO 4 15%. Dinding tabung dibilas dengan aquadest dan secepatnya ditutup dengan sumbat karet yang telah dihubungkan dengan pipa destilasi berdiameter ± 0,5 cm. Kemudian ujung pipa yang lain dihubungkan dengan alat pendingin Leibig. Tabung destilasi dimasukkan kedalam labu didih yang telah berisi air mendidih tanpa menyentuh permukaan air tersebut. Uap air panas akan mendesak VFA dan akan terkondensasi di dalam pendingin. Hasil destilasi ditampung dengan labu erlenmeyer 500 ml yang telah diisi 5 ml NaOH 0,5 N. Proses destilasi selesai pada saat jumlah destilat yang tertampung mencapai 300 ml. Destilat yang tertampung ditambah indikator fenolftalein (pp) sebanyak 2-3 tetes, lalu dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai terjadi perubahan dari warna merah jambu menjadi tidak berwarna (bening). Perhitungan produksi VFA total adalah sebagai berikut: VFA total = (volume titran blanko volume titran sampel) x N HCl x 1000/5 mm Sampel (g) x BK sampel Kajian 2. Kemampuan Isolat Bakteri Rumen Kerbau dalam Memanfaatkan Urea Bahan pakan yang digunakan adalah jagung sebagai sumber pati dan onggok sebagai sumber serat. Bahan pakan dipersiapkan dengan menimbang bahan pakan masing-masing sebanyak 100 g. Bahan pakan sumber pati atau sumber serat dicampur dengan urea pada taraf 3%, 4,5% dan 6% BK. 20

7 Gambar 6. Sampel Bahan Pakan Sumber Pati Sumber: Dokumentasi Penelitian (2012) Isolat bakteri rumen segar diremajakan seperti pada kajian pertama. Setelah itu dilanjutkan dengan fermentasi bahan yang diuji. Sampel ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung fermentor dan ditambahkan 40 ml McDougall, 5 ml cairan rumen steril dan 5 ml isolat bakteri rumen kerbau, dan dialiri gas CO 2 selama 30 detik. Setelah 2 jam dan beberapa jam inkubasi selanjutnya tabung diangkat dan diukur ph, kemudian ditetesi HgCl 2. Sampel hasil inkubasi disentrifuse dan diambil supernatannya untuk analisis NH 3. Analisis NH 3 dilakukan dengan metode difusi cawan Conway (Conway, 1958). Rancangan dan Analisis Data Pada kajian pertama digunakan empat sampel leguminosa sebagai individu percobaan yang difermentasi dengan dua sumber inokulum berbeda. Perlakuan berupa dua jenis sumber inokulum yaitu cairan rumen segar dan isolat bakteri rumen pencerna serat. Analisis data menggunakan uji-t berpasangan (Steel dan Torrie, 1997). Peubah yang diukur adalah ph fermentasi, fermentabilitas in vitro (konsentrasi NH 3 dan VFA), dan kecernaan bahan kering dan bahan organik (KCBK dan KCBO). Pada kajian kedua digunakan sampel pakan berupa jagung dan onggok dengan taraf pemberian urea 3%, 4,5%, dan 6% yang difermentasi dengan isolat bakteri pencerna serat dan dilakukan pengukuran peubah pada jam ke 2, 4, 6 dan 8. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Peubah yang diukur pada kajian kedua adalah konsentrasi NH 3 dan ph. 21