BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental. B. Variabel Penelitian Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Variabel bebas : variasi konsentrasi ekstrak kencur terpurifikasi dan ekstrak teh 2. Variabel tergantung : nilai SPF dan aktivitas antioksidan ekstrak kencur terpurifikasi dan ekstrak teh 3.Variabel terkendali : metode penyarian,dpph, alat, kualitas simplisia. C. Definisi Variabel Operasional Penentuan nilai SPF bertujuan untuk melihat kemampuan atau efektifitas tabir surya untuk menyerap, menghamburkan atau memantulkan energi cahaya matahari.nilai SPF ini umumnya berkisar antara 0 sampai 100, dan kemampuan tabir surya dianggap baik apabila berada diatas 15. Aktivitas antioksidan merupakan kemampuan suatu senyawa atau ekstrak untuk menghambat reaksi oksidasi yang dapat dinyatakan dengan persen penghambatan. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah harga konsentrasi efisien atau Efficient Concentration (EC 50 ) atau Inhibition Concentration (IC 50 ) yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan % penghambatan 50%. Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi, akan mempunyai harga EC 50 atau IC 50 yang rendah. D. Bahan dan Alat 14 Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang kencur (Kaempferia galanga L.), daun teh (Camellia sinensis L), etanol 96%, etanol (p.a), parafin

2 cair, setil alkohol, tween 80, span 80, aquades, DPPH (diphenylpicrylhidrazyl), BHT (butilatedhydroxytoluene), vitamin E, akuades. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Ultrasonic bath (Branson 1510), Rotary Evaporator,alat-alat gelas (labu ukur, gelas ukur, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet ukur), mortir dan stamper, timbangan analitik (Shimadzu type AY220), alat perkolasi (Iwaki pyrex), panci infusa, almari pengering, ph meter, viscometer, Spektrofotometer Uv Vis (Shimadzu UV-1201). E. Cara Penelitian 1. Perlakuan Pada Rimpang Kencur (K. galanga) a. Pengambilan Rimpang Kencur Rimpang kencur diperoleh dari Bringharjo Kota Yogyakarta. Rimpang kering lalu diserbuk dan diayak dengan derajat halus serbuk 20/60 atau serbuk agak kasar (Depkes RI,1979). b. Identifikasi Rimpang Kencur Identifikasi dilakukan dengan pengamatan mikroskopik serbuk rimpang kencur. Pengamatan dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika, Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Purwokerto. c. Ekstraksi 1. Pembasahan Sebanyak 250 gram serbuk kencur ditambahkan cairan penyari etanol 96% sebanyak 125 ml sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan hati-hati. Biarkan terendam selama 2 jam. 2. Perkolasi Bagian bawah perkolator diisi dengan kapas, kemudian diberi kertas saring diatasnya.ditambahkan bahan yang sudah dibasahi dan cairan penyari sampai ¾ perkolator (± 750 ml). Kemudian biarkan terbasahi semalam, keesokan harinya kran perkolator dibuka dengan mengatur kecepatan mengalir perkolat (tetesannya tidak terlalu cepat, ± 10 tetes permenit) sambil menampung perkolat yang turun. Monitor cairan penyari diatas serbuk dalam perkolator, jika hampir mencapai permukaan serbuk, tambahkan cairan penyari lagi. Perkolasi dilanjutkan sampai

3 cairan diatas serbuk jernih. Perkolat yang diuapkan dalam cawan porselen dengan pemanasan di atas penangas air disertai pengurangan pengurangan tekanan hingga diperoleh ekstrak kental yang kemudian dibiarkan semalam sampai terbentuk kristal (Depkes RI, 1986). d. Rekristalisasi Ekstrak kencur terpurifikasi yang didapatkan dari proses ekstraksi dilarutkan kembali dalam etanol 96% kemudian didesak dengan air agar sampai terbentuk endapan, kemudian direndam dengan bongkahan es sampai terbentuk ekstrak kristal. Ekstrak kencur terpurifikasi yang terbentuk kemudian disaring.fungsi dari rekristalisasi adalah memisahkan kristal dari senyawa target dengan zat ballast yang ikut terekstraksi sehingga memaksimalkan kemurnian senyawa aktif yang diinginkan. e. Uji Organoleptik Ekstrak Kencur Terpurifikasi Setelah didapatkan ekstrak kencur terpurifikasi maka dilakukan uji organoleptik mengenai bentuk, warna dan bau sebagai tahap awal evaluasi ekstrak (Depkes RI, 2000). f. Uji Titik Leleh Ekstrak Kencur Terpurifikasi Uji titik leleh ekstrak kencur terpurifikasi untuk memastikan bahwa kristal yang didapatkan adalah benar kristal Etil p-metoksisinamat dengan membandingkan titik leleh Etil p-metoksisinamat standar. Pengujian dengan cara mengambil sedikit ekstrak kencur terpurifikasi menggunakan pipa kapiler, kemudian pipa tersebut dimasukkan ke dalam heater dan alat dijalankan, kemudian diamati sampai kristal melebur habis dan dicatat suhu yang ditunjukkan oleh temperatur. 2. Perlakuan Pada Daun Teh (Camellia sinensis L) a. Pengambilan Daun Teh Daun teh (Camellia sinensis L) diperoleh dari Bringharjo kota Yogyakarta. b. Identifikasi Daun Teh Identifikasi dilakukan dengan pengamatan mikroskopik serbuk daun teh. Pengamatan dilakukandi Laboratorium Botani dan Genetika, Jurusan Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Purwokerto. c. Ekstraksi

4 Pembuatan ekstrak dengan metode infusa yaitu 250 g bahan (simplisia kering) ditimbang dengan seksama kemudian simplisia tersebut dimasukkan dalam panci infusa dan tambahkan akuadestilata 500 ml, kemudian dipanaskan sambil diaduk dan pemanasan dihentikan setelah suhu kurang lebih 90 0 C. Hasil pemanasan kemudian disaring dengan menggunakan kain flannel sewaktu masih panas dan diuapkan sampai menjadi ekstrak kental. d. Uji Organoleptik Ekstrak Setelah didapatkan ekstrak kental maka dilakukan uji organoleptik mengenai bentuk, warna dan bau sebagai tahap awal evaluasi ekstrak (Depkes RI, 2000). 3. Preparasi Formulasi Krim Tabel 3. Formulasi krim ekstrak kencur terpurifikasi dan teh Jumlah (%) Bahan FI FII FIII Ekstrak kencur terpurifikasi Ekstrak the Parafin cair Setil alkohol Tween 80 3,25 3,25 3,25 Span 80 1,75 1,75 1,75 Akuades ad 100 ad 100 ad 100 Ekstrak kencurterpurifikasidan teh ditambah span 80 di atas penangas air (diatur suhunya 75 o C), dicampur dengan parafin cair dan setil alkohol kemudian diaduk hingga homogen (fase minyak).tween 80 dicampur dengan akuades secukupnya, diaduk hingga homogen (fase air).fase air dituangkan ke dalam fase minyak aduk hingga homogen. 4. Evaluasi Sifat Fisik Krim

5 a. Pengamatan Organoleptis Pengamatan organoleptis meliputi pengamatan perubahan bentuk, warna dan bau yang terjadi pada tiap rentang waktu tertentu selama 30 hari.pengamatan organoleptis dilakukan pada hari ke-1, 6, 12, 18, 24, 28 dan hari ke-30. Pengamatan ini dilakukan replikasi 3 kali pada masing-masing formulasi krim. b. Pengukuran ph Pengukuran ph menggunakan alat ph stick (Merck). ph stick dicelupkan ke dalam sediaan krim. Kemudian didiamkan sesaat dan dilihat warna yang terjadi pada ph stick yang disesuaikan pada warna dalam range di ph stick untuk mengamati phnya. ph krim diukur tiap rentang waktu tertentu selama 30 hari. Dilakukan pada hari ke-1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 dan hari ke-30.pengukuran ini dilakukan replikasi 3 kali untuk masing-masing formulasi sediaan krim. c. Pengukuran Viskositas Krim Viskositas sediaan krim diukur menggunakan ViskosimeterBrook Field LV. Sediaan sebanyak 25 gram dimasukkan kedalam cup, kemudian dipasang spindle ukuran 4 dan rotor dijalankan dengan kecepatan 60 rpm.hasil viskositas dicatat setelah viskotester menunjukan angka yang stabil dan hasilnya dikalikan dengan faktor (100). Pengukuran viskositas dilakukan di awal dan di akhir jalannya penelitian, yaitu pada minggu ke 1 dan minggu ke 4. Pengukuran ini dilakukan replikasi pada masing masing formulasi sediaan krim. d. Uji Homogenitas Krim Krim dioleskan pada plat kaca, lalu digosokan dan diraba. Bila homogen maka massa krim tidak tersisa bahan padatnya atau teksturnya rata. e. Uji Daya Sebar Krim Uji daya sebar krim dilakukan dengan cara, sebanyak 0,5 gram krim diletakkan di atas kaca bulat, kemudian ditutup dengan kaca lain yang telah ditimbang dan dibiarkan selama 1 menit, ukur diameter sebarnya. Setelah 1 menit, tambahkan beban 50 gram, biarkan 1 menit kemudian diukur diameter sebarnya. Lakukan hal yang sama tiap 1 menit hingga total beban yang ditambahkan sebesar 150 gram. 5. Penentuan nilai SPF

6 a. Penyiapan Larutan Sampel 1) Larutan Sampel Ekstrak Kencur Terpurifikasi Penyiapan larutan sampel 10 ppm yaitu dengan menimbang 0,04 gr ekstrak kencur terpurifikasi dilarutkan dalam 10 ml etanol dan diaduk sampai homogen. Kemudian diencerkan dengan mengambil 5 ml larutan tersebut yang dilarutkan dalam 10 ml etanol dan diencerkan lagi dengan mengambil 5 ml larutan tersebut yang dilarutkan dalam 10 ml etanol. Lalu dari larutan tersebut diambil lagi 1 ml dilarutkan dalam 10 ml etanol dan diencerkan lagi dengan mengambil 1 ml dilarutkan dalam 10 ml etanol sehingga didapatkan konsentrasi larutan sampel ekstrak kencur terpurifikasi 10 ppm. 2) Larutan Sampel Krim Formula Optimum Penyiapan larutan sampel krim 10 ppm yaitu dengan menimbang 1 gram krim dilarutkan dalam 10 ml pelarut etanol dan diaduk sampai homogen. Setelah itu diencerkan dengan mengambil 1 ml larutan tersebut yang dilarutkan dalam 10 ml etanol dan diencerkan lagi dengan mengambil 1 ml larutan tersebut yang dilarutkan dalam 10 ml etanol. Dari larutan tersebut diambil lagi 1 ml dilarutkan dalam 10 ml etanol dan diencerkan lagi dengan mengambil 1 ml dilarutkan dalam 10 ml etanol sehingga didapatkan konsentrasi larutan sampel krim 10 ppm. b. Pembacaan Absorbansi Larutan Sampel Penentuan efektifitas sediaan tabir surya dilakukan secara in vitro dengan cara mengukur serapan 10 ppm larutan sampel menggunakan spektrofotometer UV dan dicari panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi 0,05. Pemeriksaan dilakukan dalam pelarut etanol dan pengukuran diawali dengan panjang gelombang 290 nm kemudian secara bertahap ditingkatkan hingga di atas 320 nm dimana mempunyai serapan minimal 0,05. c. Perhitungan Nilai SPF Metode Petro mempersyaratkan bahwa untuk menghitung SPF kadar sampel dalam kuvet harus ekivalen dengan 0,001% atau 0,01 g/l atau 10 mg/l bahan aktif. Dengan demikian nilai serapan yang diperoleh diubah ke dalam bentuk serapan dalam 10 ppm.selanjutnya angka dimasukkan dalam rumus AUC, yaitu jumlah serapan pada

7 λn dan serapan λn-1 dibagi 2. Nilai SPF dihitung dengan rumus seperti pada persamaan: log SPF AUC = x 2 λn λ 1 Keterangan : SPF : Faktor proteksi cahaya AUC : Jumlah serapan pd λn dan serapan λn-1 dibagi 2 Λn : Panjang gelombang yang menghasilkan serapan 0,05 λ1 : 290 nm Yaitu membagi jumlah seluruh area dibawah kurva dengan selisih panjang gelombang terbesar dan terkecil lalu dikalikan dua, selanjutnya nilai log SPF diubah menjadi nilai SPF (Petro, 1981). 6. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH a. Pembuatan larutan DPPH 0,4 mm Larutan DPPH 0,4 mm dibuat dengan melarutkan 15,8 mg serbuk DPPH dalam etanol p.a. pada labu takar 100,0 ml, kemudian divorteks. b. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0,4 mm untuk uji aktivitas antioksidan dilakukan sebagai berikut: 5 ml larutan DPPH 0,4 mm diamati serapannya pada rentang panjang gelombang nm dengan menggunakan blangko etanol p.a. c. Penyiapan Larutan Ekstrak Teh Ekstrak teh dilarutkan dalam etanol p.a dalam konsentrasi 1000 ppm dan dilakukan seri pengenceran hingga diperoleh konsentrasi 5ppm, 10ppm, 15ppm, 20 ppm, 25ppm. d. Penyiapan Larutan Ekstrak Kencur Terpurifikasi Ekstrak kencur terpurifikasi dilarutkan dalam etanol p.a dalam konsentrasi 1000 ppm dan dilakukan seri pengenceran hingga diperoleh konsentrasi 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80 ppm, 100ppm.

8 e. Penyiapan Larutan Krim Formula Optimum 1) Pembuatan Larutan Stok Krim Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,05 gram krim dilarutkan dalam 50 ml etanol p.a. 2) Pembuatan Seri Konsentrasi Krim Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 ml dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan dengan etanol p.a sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100ppm. f. Penyiapan Larutan Kontrol Positif 1) Pembuatan Larutan Stok BHT Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,05 gram BHT dilarutkan dalam 50 ml etanol p.a. 2) Pembuatan Seri Konsentrasi BHT Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 ml dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan dengan etanol p.a sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25 ppm. 3) Pembuatan Larutan Stok Vitamin E Konsentrasi 1000 ppm Larutan stok dibuat dengan cara menimbang seksama 0,05 gram Vitamin E dilarutkan dalam 50 ml etanol p.a. 4) Pembuatan Seri Konsentrasi Vitamin E Dari larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm dipipet sebanyak 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 ml dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan dengan etanol p.a sampai dengan tanda sehingga diperoleh konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25 ppm. g. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan terhadap ekstrak daun teh dan sampel krim dengan seri konsentrasi 20 ppm, 40 ppm, 60 ppm, 80 ppm, dan 100 ppm. Pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak daun teh dan sampel krim dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Atom hidrogen atau kemampuan mendonorkan elektron dari ekstrak daun teh dan sampel krim. diukur dari hilangnya warna ungu dari

9 larutan DPPH dalam etanol menjadi warna kuning yang jernih. Pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometri. Reagen yang digunakan adalah senyawa radikal stabil DPPH (diphenylpicrylhidrazyl) (Gulluce et al, 2006). Sebanyak 1,0 ml DPPH 0,4 mm dimasukkan ke dalam labu takar, ditambahkan 100 µl bahan uji kemudian ditambahkan etanol p.a sampai volume 5,0 ml, divorteks selama 1 menit hingga campuran homogen dan didiamkan selama 30 menit. Larutan ini kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum. Penghambatan radikal bebas dari DPPH dalam persen (I%) dihitung menggunakan rumus : % % Data absorbansi yang diperoleh dibuat persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi bahan uji (x) dengan aktivitas antioksidan rata-rata (y) dari suatu seri replikasi pengukuran sehingga diperoleh harga IC50 yaitu konsentrasi bahan uji yang diperlukan untuk menangkap 50% radikal DPPH selama 30 menit (operating time), atau jeda waktu yang dibutuhkan oleh bahan uji untuk mereduksi radikal DPPH dengan sempurna. Setelah 30 menit akan didapatkan absorbansi yang konstan. F. Analisis Data Data ph, viskositas, homogenitas, daya sebar dan SPF yang didapat kemudian dianalisis secara deskriptif. Data sifat fisik krim yang meliputi ph, viskositas dan daya sebar diuji dengan metode Simplex Lattice Design (SLD).Berdasarkan dari data sifat fisik krim (ph, viskositas dan daya sebar) maka didapatkan masing-masing persamaan SLD. Dari persamaan tersebut dihitung responnya (R) dan R total sehingga didapatkan rancangan formula yang optimum. Data yang diperoleh berupa persen penghambatan (I%) dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui harga IC 50 -nya, yaitu menggunakan persamaan regresi linier pada kurva hubungan antara persen hambatan dengan konsentrasi (Gulluce et al, 2006). G. Bagan Penelitian Pengambilan rimpang kencur dan daun teh

10 Identifikasi serbuk kencur dan teh Ekstraksi serbuk kencur dan teh Evaluasi ekstrak kencur terpurifikasi dan ekstrak teh Pembuatan krim Evaluasi sifat fisik krim Penentuan formula optimum dengan metode Simplex Laticce Design Pembuatan krim formula optimum Penentuan nilai SPF Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Analisis data