3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Alat dan Bahan

Transkripsi

1 21 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Juni 2009 sampai November 2010, bertempat di Laboratorium bagian Preparasi Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Penelitian Kimia Organik Departemen Kimia FMIPA IPB. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Cimanggu Bogor. PUSLABFOR BARESKRIM POLRI Jakarta. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat tulis, alat-alat gelas, alat ekstraksi dan uji kimia antara lain : rotari evaporator Buchi Rotavapor R-205, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800, Kromatografi Lapis Tipis silika gel 60 F 254, AAS Shimazu-7000, HPLC Varian 940-LC, GC-MS AGILENT TECHNOLOGIES. Bahan yang digunakan pada penelitian ini berupa lintah laut. Bahan ekstraksi terdiri atas: kloroform, etil asetat dan etanol. Bahan analisis proksimat antara lain: tablet kjeltab, natrium hidroksida, asam borat, larutan bromocresol green 0,1%, larutan metil merah 0,1%, alkohol 96%, asam klorida 0,02 N dan akuades digunakan untuk analisis protein. Asam klorida 6 N, metanol, natrium asetat, trietilamin, pikoitosianat, asetonitril 60% dan buffer fosfat 0,1 M digunakan untuk analisa asam amino. Asam klorida 1 N, asam nitrat, asam sulfat, asam perklorat, molibdat-vanadat, digunakan untuk analisis mineral. Bahan untuk analisis logam berat, seperti merkuri klorida, batu didih, vanadium pentaoksida. Bahan analisis asam lemak berupa natrium hidroksida, metanol, natrium klorida dan heksana. Bahan untuk uji antioksidan berupa DPPH (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil) dan BHT (Butylated Hydroxytoluena).

2 Prosedur Penelitian Penelitian ini dibagi dalam beberapa tahap, yaitu pengambilan dan preparasi sampel, ekstraksi senyawa bioaktif dari lintah laut, fraksinasi senyawa bioaktif, dan identifikasi senyawa bioaktif Pengambilan dan preparasi sampel Tahap pertama penelitian ini dimulai dari pengambilan dan preparasi sampel serta persiapan bahan dan alat untuk pengujian kandungan gizi dan ekstraksi senyawa aktif. Sampel diambil dari pantai dan mangrove dengan tipe sedimen berlumpur di daerah Pamekasan Madura. Lintah laut diambil ketika kondisi air laut mulai surut. Setelah terkumpul, lintah laut dicuci dengan air laut untuk membersihkan dari kotoran lumpur, kemudian dikeluarkan isi perutnya dengan cara membelahnya secara melintang dari oral menuju aboral. Lintah laut dicuci kembali sampai bersih dengan air mengalir, kemudian dikeringkan sekitar 3-4 hari dengan sinar matahari. Setelah kering lintah laut dihaluskan dengan mortal dan blender. Penanganan sampel segar dilakukan dengan membawa lintah laut dalam keadaan hidup yang sudah dicuci dengan air laut, kemudian dibungkus dengan kain basah dan dimasukkan ke dalam wadah. Melalui cara ini, lintah laut bisa bertahan hidup sampai 5-7 hari. Analisis yang dilakukan pada tahap ini adalah: analisis rendemen (Hustiany 2005), analisis proksimat meliputi: kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak dan karbohidrat (AOAC 2005), analisis asam amino (AACC 1994), analisis asam lemak (AACC 1983), analisis mineral dan logam berat (SNI ) Ekstraksi lintah laut kering Ekstraksi lintah laut dilakukan dengan fraksinasi bertingkat dengan berbagai perbedaan kepolaran pelarut. Bubuk lintah yang dihasilkan ditimbang sebanyak 50 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan ditambahkan dengan 100 ml kloroform. Campuran dikocok dengan bantuan shaker selama 24 jam kemudian disaring. Fraksinasi menggunakan pelarut kloroform dilakukan 3 kali atau sampai larutan berwarna jernih. Hasil penyaringan ditampung dalam

3 23 labu dan dievaporasi sampai pekat. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat kepolaran rendah. Tepung lintah laut 50 g Maserasi dengan kloroform 100 ml, 24 jam, suhu ruang Penyaringan Residu Filtrat Maserasi dengan etil asetat 100 ml, 24 jam, suhu ruang Evaporasi Penyaringan Residu Ekstrak Kloroform Filtrat Maserasi dengan etanol 100 ml, 24 jam, suhu ruang Evaporasi Penyaringan Ekstrak Etil asetat Filtrat Evaporasi Residu Ekstrak Etanol Gambar 4 Bagan kerja ekstraksi lintah laut (Discodoris sp.) (Sherif et al dengan beberapa modifikasi) Residu dari fraksinasi kloroform kemudian dilarutkan dengan pelarut etil asetat. Residu hasil fraksinasi dengan kloroform ditambahkan dengan 100 ml pelarut etil asetat. Selanjutnya campuran dikocok dengan shaker selama 24 jam dan kemudian disaring. Fraksinasi dengan pelarut etil asetat dilakukan sebanyak 3 kali atau hingga larutan menjadi jernih. Hasil penyaringan ditampung dalam

4 24 labu dan dievaporasi sampai pekat. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat kepolaran sedang. Fraksinasi terakhir menggunakan pelarut etanol. Residu hasil fraksinansi dengan etil asetat ditambahkan dengan pelarut etanol sebanyak 100 ml. Campuran dikocok dengan shaker selama 24 jam dan kemudian disaring. Fraksinasi dengan pelarut etanol dilakukan sebanyak 3 kali atau hingga larutan menjadi jernih. Hasil penyaringan ditampung dalam labu dan dievaporasi sampai pekat. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat kepolaran tinggi. Larutan hasil fraksinasi bertingkat tersebut dikeringkan dengan evaporator pada suhu 40 0 C. Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan freezedryer. Kandungan zat aktif pada masing-masing fraksi dihitung bobotnya. Prosedur lengkap dari proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4. Analisis yang dilakukan pada tahap ekstraksi ini meliputi: analisis rendemen, analisis fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995), dan analisis antioksidan (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) Fraksinasi lanjutan Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik kemudian dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254. Pelaksanaan kromatografi preparatif dilakukan dengan mencari pelarut terbaik terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Eluen yang digunakan yaitu heksan, kloroform, etil asetat, metanol dan etanol. Pencarian eluen terbaik dimulai dengan menggunakan eluen tunggal sampai dengan eluen campuran atau perbandingan. Sebanyak 5 ml eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup, kemudian dibiarkan beberapa menit sampai larutan menjadi jenuh. Ekstrak kasar yang terpilih dilarutkan dalam pelarutnya, kemudian ditotolkan pada garis bagian bawah yang ditandai pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler dan dikeringkan beberapa menit. Kemudian dimasukkan ke dalam chamber dengan posisi agak tegak, sampel yang ditotolkan berada pada bagian bawah dan diusahakan tidak terendam oleh eluen. Kemudian chamber ditutup dan ditunggu sampai sampel terbawa eluen pada batas atas. Plat kromatografi

5 25 lapis tipis dikeluarkan dan dikeringkan. Selanjutnya plat dilihat hasilnya dengan menggunakan sinar UV 254 nm. Setelah ditemukan eluen terbaik, dilanjutkan dengan kromatografi preparatif. Prosedur yang dilakukan hampir sama dengan KLT namun dengan ukuran yang lebih besar. Pembuatan preparat dengan menggunakan silika gel 60 F 254 yang dipasang pada lempeng kaca dengan ukuran 20x20 cm. Eluen terbaik yang diperoleh disiapkan sebanyak 20 ml dan dimasukkan ke dalam chamber. Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber, setelah dilihat hasilnya dengan sinar UV 254 nm, kemudian setiap fraksi atau masing-masing Rf (Retardation factor) yang dihasilkan dikerok dan dikumpulkan. Hasil pengerokan dilarutkan dengan pelarut yang sama dengan sampel terpilih. Pada fraksi atau Rf yang diperoleh dicek dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Jika pada lempeng KLT masing-masing fraksi hanya terdapat 1 bercak, maka dimungkinkan pemisahan sudah hampir sempurna dan diharapkan diperoleh senyawa tunggal. Analisis yang dilakukan pada masing-masing fraksi (Rf) yang diperoleh yaitu analisis antioksidan dengan metode DPPH menurut Blois (1958) diacu dalam Hanani et al. (2005) Identifikasi senyawa aktif Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan terbaik dilanjutkan dengan melihat komponen senyawa yang terdapat di dalamnya yaitu menggunakan GC-MS. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa dilakukan untuk mendapatkan bobot molekul dan pola fragmentasi dari senyawa murni tersebut. Kondisi operasi dari GC-MS disajikan pada Tabel 2. Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif ini yaitu memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi dan dicocokkan dengan senyawa yang ada pada library GC-MS dengan kemiripan >90%. 3.4 Analisis Rendemen (Hustiany 2005) Rendemen adalah persentase bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan. Lintah laut utuh ditimbang beratnya baik sebelum maupun sesudah diambil

6 26 jeroannya, kemudian dijemur menggunakan panas matahari. Daging dan jeroan lintah laut yang telah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan berat setelah dikeringkan. Rendemen merupakan persentase perbandingan antara bagian yang digunakan dengan berat utuh lintah laut segar. Kondisi GC Berat bagian yang digunakan (gram) % Rendemen = x 100% Berat utuh lintah laut (gram) Tabel 2 Kondisi dan spesifikasi operasi alat GC-MS Spesifikasi dan program pengaturan Tipe kolom Agilent 19091J-433, tipe HP-5, 0,25 mm x 30 m x 0,25 µm Diameter 250 µm Suhu maksimum C Film thickness: 0,25 µm Model aliran: konstan Kecepatan aliran: 1 ml/menit Instrumen GC-MS Agilent 19091J-433 Gas pembawa: helium Injektor Pompa sampel: 6 Volume: 1 µl Ukuran Springe: 10 µl Inlet Mode split Suhu C Kecepatan split: 19,8 ml/menit Total aliran: 23,8 ml/menit Gas: helium Tekanan: 8,67 psi Oven Suhu awal 70 0 C Suhu akhir 70 0 C Suhu maksimum C Waktu operasi 34,67 menit Analisis proksimat (AOAC 2005) Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu dengan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein menggunakan metode kjedahl. (1) Analisis kadar air (AOAC 2005) Analisis kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven. Prinsipnya adalah menguapkan molekul air (H 2 O) bebas yang ada dalam sampel. Kemudian sampel ditimbang sampai didapat bobot konstan yang diasumsikan

7 27 semua air yang terkandung dalam sampel sudah diuapkan. Selisih bobot sebelum dan sesudah pengeringan merupakan banyaknya air yang diuapkan. Prosedur analisis kadar air sebagai berikut: cawan yang akan digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B) kemudian dioven pada suhu C selama 6 jam lalu didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (C). Tahap ini diulangi hingga dicapai bobot yang konstan. Kadar air dihitung dengan rumus: B C % Kadar air = x 100% B A (2) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnya adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi air (H 2 O) dan karbondioksida (CO 2 ) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat anorganik ini disebut abu. Prosedur analisis kadar abu sebagai berikut: cawan yang akan digunakan dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B) kemudian dibakar di atas nyala pembakar sampai tidak berasap dan dilanjutkan dengan pengabuan di dalam tanur bersuhu C sampai pengabuan sempurna. Sampel yang sudah diabukan didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pembakaran dalam tanur diulangi sampai didapat bobot yang konstan. Kadar abu dihitung dengan rumus: C A % Kadar abu = x 100% B A (3) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode sokhlet. Prinsipnya adalah lemak yang terdapat dalam sampel diekstrak dengan menggunakan pelarut lemak non polar.

8 28 Prosedur analisis kadar lemak sebagai berikut: labu lemak yang akan digunakan dioven selama 30 menit pada suhu C, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 2 gram (B) lalu dibungkus dengan kertas saring, ditutup dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi sokhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dioven dan diketahui bobotnya. Pelarut heksan atau pelarut lemak lain dituangkan sampai sampel terendam dan dilakukan refluks atau ektraksi lemak selama 5-6 jam atau sampai palarut lemak yang turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut lemak yang telah digunakan, disuling dan ditampung setelah itu ekstrak lemak yang ada dalam labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu C selama 1 jam, lalu labu lemak didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pengeringan labu lemak diulangi sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar lemak dihitung dengan rumus: C A % Kadar lemak = x 100% B (4) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Analisis kadar protein dilakukan dengan metode kjeldahl. Prinsipnya adalah oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi nitrogen menjadi amonia oleh asam sulfat, selanjutnya amonia bereaksi dengan kelebihan asam membentuk amonium sulfat. Amonium sulfat yang terbentuk diuraikan dan larutan dijadikan basa dengan NaOH. Amonia yang diuapkan akan diikat dengan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan larutan baku asam. Prosedur analisis kadar protein sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 0,1-0,5 g, dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100 ml, ditambahkan dengan 1/4 buah tablet kjeltab, kemudian didekstruksi (pemanasan dalam keadaan mendidih) sampai larutan menjadi hijau jernih dan SO 2 hilang. Larutan dibiarkan dingin dan dipindahkan ke labu 50 ml dan diencerkan dengan akuades sampai tanda tera, dimasukkan ke dalam alat destilasi, ditambahkan dengan 5-10 ml NaOH 30-33% dan dilakukan destilasi. Destilat ditampung dalam larutan 10 ml asam borat 3% dan beberapa tetes indikator (larutan bromcresol green 0,1% dan

9 29 larutan metil merah 0,1% dalam alkohol 95% secara terpisah dan dicampurkan antara 10 ml bromcresol green dengan 2 ml metil merah) kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai larutan berubah warnanya menjadi merah muda. Kadar protein dihitung dengan rumus: Keterangan: (B A) x C x 14, 007 x 100 % Kadar nitrogen = x 100% D % Kadar protein = % kadar nitrogen x FK A = volume HCl untuk titrasi blanko B = volume HCl untuk titasi sampel (ml) C = normalitas HCl yang digunakan (0,02374 N) D = bobot sampel (mg) FK = faktor konversi (6,25 untuk produk perikanan) Analisis asam amino (AACC 1994) Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Analisis asam amino menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu (1) tahap pembuatan hidrolisat protein; (2) tahap pengeringan; (3) tahap derivatisasi; dan (4) tahap injeksi serta analisis asam amino. (1) Tahap pembuatan hidrolisat protein Tahap preparasi sampel adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 ml, kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu C selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan milipore berukuran 45 mikron. (2) Tahap pengeringan Hasil saringan diambil sebanyak 30 µl larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan dengan larutan pengering,

10 30 dilakukan pengeringan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi. (3) Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya dilakukan pegenceran dengan cara menambahkan 10 ml asetonitil 60% atau buffer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali menggunakan milipore berukuran 0,45 mikron. (4) Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil sebanyak 20 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan kromatogram sampel dengan standar, pembuatan kromatogram standar menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino: Temperatur : 27 0 C (suhu ruang) Jenis kolom : pico tag 3,9 m x 150 µm Kecepatan alir eluen : 1 ml/menit Tekanan : 3000 psi Fasa gerak : - Asetoniril 60% - Buffer fosfat 0,1 M Detektor Panjang gelombang Derivatisasi Tipe injeksi Program : UV : 256 nm : pre-column derivatization : on column injection tanpa septum : isokratik (kecepatan aliran eluen konstan) Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus: Luas area sampel Konsentrasi asam amino = Luas area standar x C x FB x BM x 100 Bobot sampel ( µ g)

11 31 Keterangan : C FP BM = konsentrasi standar asam amino (5 µg) = faktor pengenceran (10 ml) = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol) Analisis asam lemak (AACC 1983) Analisis asam lemak dilakukan melalui tahap ekstraksi, derivatisai, injeksi dan pembacaan sample melalui kromatogram. Pada tahap ekstraksi, sampel dilarutkan dengan heksan. Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan metode sokhlet dan ditimbang sebanyak 0,02 g lemak dalam bentuk minyak. Tahap derivatisasi dilakukan dengan cara menambahkan NaOH sebanyak 5 ml ke dalam metanol lalu dipanaskan selama 20 menit pada suhu 80 0 C, setelah itu larutan didinginkan. Larutan yang telah dingin ditambahkan sebanyak 5 ml pada sampel. Sampel dipanaskan pada suhu 80 0 C selama 20 menit, diangkat dan didinginkan. Sampel ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 5 ml heksan dihomogenkan kemudian dipipet lapisan heksan dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau eppendorf. Sebanyak 2-5 µl sampel diinjeksikan ke dalam kromatografi gas. Asam lemak yang ada dalam metil-ester akan diidentifikasi oleh flame ionization detector dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram. Kondisi alat GC pada saat analisis adalah sebagai berikut: Temperatur kolom : C Temperatur initial : C Temperatur final : C Kecepatan alir : H 2 = 2,5 Kgf/cm 3 dan N 2 = 50 Kgf/cm 3 Batas tekanan : 3000 psi Fase gerak : N 2 Fase stasioner : serbuk diethyl glicol sukcinat (DEGS) Detektor : flame ionization detector (FID) suhu C Jenis kolom : pico tag 4 m x 5 mm Kecepatan suhu : 5 0 C/menit Analisis kuantitatif asam lemak dapat dihitung dengan rumus: Konsentrasi sampel Asam lemak (mg/lemak) = x (Konsentrasi pelarut)

12 Analisis mineral dan logam berat (SNI ) Mineral yang dianalisis pada sampel lintah laut (Discodoris sp.) meliputi: kalsium, kalium, magnesium, besi, fosfor, selenium, seng, kadmium, merkuri dan timbal yang dianalisis dengan metode spektrofotometer serapan atom. (1) Analisis mineral kalsium, magnesium, kalium dan seng (SNI ) Prinsip penentuan kadar kalsium, magenesium, kalium dan seng adalah dengan proses pelarutan sampel dengan asam klorida, kemudian diukur absorbansinya dengan AAS. Prosedur analisis kadar mineral kalsium adalah sebagai berikut: sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 g, kemudian dihancurkan dan dimasukkan ke dalam gelas beaker 100 ml yang telah dibilas dengan HCl 1 N. Sampel ditambahkan dengan 25 ml HCl 1 N dan disimpan selama 24 jam. Setelah penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dan disaring dengan kertas whatman no 1. Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 ml, ditambahkan 2 ml larutan lantanium oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 ml, kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 ml. Larutan diukur absorbansinya dengan AAS masing-masing pada panjang gelombang 422,7 nm untuk kalsium, 285,2 untuk magnesium, 766,5 nm untuk kalium dan 213,9 nm untuk seng. (2) Analisis mineral besi (SNI ) Prinsip penentuan kadar besi adalah proses pelarutan bahan dengan larutan asam campur terdiri dari asam nitrat, asam sulfat, dan asam perklorat, kemudian dilanjutkan dengan proses pemanasan. Prosedur analisis mineral besi adalah sebagai berikut: sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram kemudian dihancurkan. Larutan asam campuran disiapkan yang dibuat dari HNO 3, H 2 SO 4, dan HClO 4 dengan perbandingan 5:1:2. Sampel yang telah hancur ditambah 10 ml larutan asam campuran, kemudian dipanaskan di dalam ruang asam menggunakan api kecil selama 2 jam. Kemudian api dibesarkan sampai larutan menjadi jernih dan

13 33 didinginkan. Larutan ditambahkan akuades sampai volume 50 ml dan disaring dengan kertas saring pencucian asam whatman no 1. Ekstrak dipipet sebanyak 10 ml, ditambahkan 1 ml hidrokuinon dan 1 ml orto-phenatrolin kemudian ditambahkan sodium sitrat sampai ph 3,5. Larutan diencerkan dengan akuades sampai volume 50 ml dan dipanaskan dalam water bath selama 1 jam. Larutan deret standar diperlukan dengan pereaksi yang sama dengan ekstrak sampel. Absorbansinya diukur dengan AAS pada panjang gelombang 248,3 nm. (3) Analisis mineral tembaga (SNI ) Prinsip penentuan kadar tembaga adalah dengan proses pengabuan pada suhu C dengan penambahan asam nitrat (HNO 3 ). Prosedur analisisnya sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 25 g dalam gelas piala 250 ml yang terlebih dahulu dicuci dengan HNO 3 6 N. Sampel dikeringkan di dalam oven pada suhu C selama 8-24 jam. Selanjutnya sampel dipindahkan ke dalam tungku pada suhu C selama 1-2 jam untuk mencegah terjadinya proses pembakaran cepat yang menyebabkan sampel dapat terhambur ke luar. Suhu dinaikkan hingga C selama jam. Apabila sampel abu belum putih sempurna, maka ditambah 0,25-1 ml HNO 3 pekat, kemudian diuapkan di atas hot plate. Sampel dipanaskan kembali pada suhu C di dalam tungku selama menit sampai abu benar-benar putih. Abu dilarutkan dalam 2 ml HNO 3 pekat, kemudian diencerkan dengan akuades hingga 25 ml dan dididihkan di atas hot plate. Larutan disaring dengan kertas saring no 42 yang terlebih dahulu dicuci dengan HNO 3 10% dan akuades, filtratnya ditampung dan diencerkan dengan akuades hingga 50 ml. Absorbansinya diukur dengan AAS pada panjang gelombang 324,7 nm. (4) Analisis mineral merkuri (SNI ) Prinsip dari penentuan kadar merkuri mengikat sampel dengan campuran H 2 SO 4 dan HNO 3 dan dioksidasi dengan H 2 O 2. Merkuri yang teroksidasi dikembalikan lagi ke valensi dasarnya melalui penambahan larutan pereduksi dengan cara mereaksikan merkuri dengan SnCl 2 dalam keadaan asam untuk membentuk gas atomik merkuri. Merkuri dalam keadaan dasar ini diaerasikan ke udara dan dibentuk dengan AAS tanpa nyala pada panjang gelombang 256,3 nm.

14 34 Prosedur analisisnya sebagai berikut: sampel yang telah dihomogenkan ditimbang sebanyak 5 g dan dimasukkan ke dalam labu. Leher labu dibilas dengan 5 ml akuades. Ditambahkan 20 buah batu didih, mg V 2 O 5, dan 20 ml H 2 SO 4 dengan HNO 3 dengan perbandingan 1:1. Labu dihubungkan dengan kondensor dan digoyang-goyang hingga tercampur. Air dingin dialirkan melalui kondensor selama pencampuran dilakukan, kemudian dipanaskan dengan api kecil sampai mendidih (sekitar 6 menit) dan diakhiri dengan pemanasan kuat (api besar) selama 10 menit. Selama reaksi berlangsung, labu terus digoyang-goyang. Alat pemanas dimatikan dan kondensor dicuci dengan 15 ml akuades. Ditambahkan 2 tetes H 2 O 2 melalui kondensor ke dalam labu dan dicuci dengan 15 ml akuades. Larutan dalam labu didinginkan pada suhu kamar dengan cara menempatkan dalam gelas yang berisi air. Labu diangkat dari kondensor dan leher labu dibilas dengan akuades. Labu dibilas hati-hati dengan akuades kemudian ditera sampai volume 50 ml. Larutan blanko dan kurva standar disiapkan lalu ditambahkan 100 ml larutan pengencer ke dalam masing-masing labu. Larutan pengencer dibuat dengan cara sebanyak 50 ml HNO 3 dan 67 ml H 2 SO 4 dipipet ke dalam labu ukur 1000 ml yang berisi ml akuades kemudian ditera sampai volume 1000 ml. Out put pompa diatur sampai mencapai kira-kira 2 liter udara/menit dengan mengatur kecepatan pompa lalu ditambahkan 20 ml larutan pereduksi ke dalam masing-masing labu. Larutan pereduksi dibuat dengan cara dipipet 50 ml H 2 SO 4 dan ditambahkan 300 ml akuades kemudian didinginkan pada suhu kamar. Sebanyak 15 g NaCl, 25 g SnCl 2, dan 15 g hidroksil aminasulfat ditimbang, kemudian semua bahan dilarutkan dalam larutan H 2 SO 4 sampai volume 500 ml. Gas inlet adapter dihubungkan dan dilakukan aerasi selama 1 menit. Absorpsi larutan blanko dan larutan standar dicatat lalu diplotkan dalam kurva. Larutan sampel dipipet 25 ml dari labu, kemudian ditambahkan dengan 75 ml larutan pengencer. Out put pompa diatur sampai mencapai kira-kira 2 liter udara/menit dengan mengatur kecepatan pompa lalu ditambahkan 20 ml larutan pereduksi yang telah dibuat ke dalam larutan yang akan diperiksa. Gas inlet adapter dihubungkan dan dilakukan aerasi selama 1 menit. Absorpsi larutan sampel dicatat. Berdasarkan kurva tersebut dapat ditentukan konsentrasi merkuri

15 35 pasa sampel yang diperiksa. Bila didapat konsentrasi merkuri dalam sampel yang diperiksa menyimpang dari kurva, maka dilakukan penentuan kembali dengan memakai volume larutan standar yang lebih kecil. Kadar masing-masing mineral dalam bahan dihitung dengan rumus: Abs x V Kadar mineral (ppm) = Slope x W Keterangan : Abs : absorbansi yang terbaca pada AAS V : Volume pengenceran Slope : slope regrsi kurva dari masing-masing mineral W : bobot sampel (g) Analisis fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995) Analisis fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada serbuk ekstrak kasar lintah laut. Analisis fitokimia yang dilakukan terdiri dari alkaloid, steroid/triterpenoid, saponin, flavonoid, fenol hidrokuinon, molisch, benedict, biuret, ninhidrin. (1) Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi dragendorf, meyer dan wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi meyer terbentuk endapan putih kekuningan, dengan pereaksi wagner membentuk endapan coklat dan dengan pereaksi dragendorf membentuk endapan merah sampai jingga. Pereaksi meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl 2 dengan 0,5 g kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 g iodin dan 2 g kalium iodida, kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi dragendorf dibuat dengan cara 0,8 g bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum

16 36 digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi berwarna jingga. (2) Steroid/triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. (3) Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan sampel mengandung saponin. (4) Flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume sama) dan 4 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. (5) Fenol hidrokuinon Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5%. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru. (6) Molisch Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif sampel mengandung karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan. (7) Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif

17 37 sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata. (8) Biuret Larutan sampel sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu. (9) Ninhidrin Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif sampel mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru Analisis aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) Ekstrak lintah laut dari hasil ekstraksi bertingkat dan hasil pemurnian dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi yang sama dengan sampel. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mm. Masing-masing sampel uji dan pembanding diambil 4,50 ml dan direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mm dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,50 ml pelarut metanol dengan 500 µl larutan DPPH 1 mm dalam tabung reaksi. Nilai persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus: Absorbansi blanko - Absorbansi sampel % Inhibisi = x 100% Absorbansi blanko

18 38 Nilai persentase inhibisi diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear untuk mencari nilai IC 50 (inhibitor concentration 50%). 3.5 Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah menggunakan rancangan acak lengkap faktorial untuk aktivitas antioksidan ekstrak kasar dengan 2 perlakuan yaitu jenis pelarut (kloroform, etil asetat dan etanol) dan bagian lintah laut (daging dan jeroan) dengan 2 kali ulangan. Model matematis rancangan percobaan tersebut menurut Steel dan Torrie 1995 adalah: Y ijk = µ + α + β + ( αβ ) + ε ij Keterangan : Y ijk : Nilai pengamatan pada suatu percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ke-i dan ke-j µ : Nilai tengah populasi α i : Pengaruh perlakuan jenis pelarut ke-i (kloroform, etil asetat, dan etanol) β ij : Pengaruh perlakuan bagian lintah laut ke-j (daging dan jeroan) (αβ)ij: Pengaruh interaksi jenis pelarut ke-i, dengan bagian lintah laut ke-j ε ijk : Pengaruh galat pada percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan jenis pelarut dan bagian lintah laut ij Rancangan yang digunakan pada analisis aktivitas antioksidan hasil fraksinasi, yaitu menggunakan rancangan acak lengkap biasa. Perlakuan yang digunakan adalah fraksi dengan 2 kali ulangan. Model matematis rancangan percobaan tersebut. Model matematis rancangan percobaan tersebut menurut Steel dan Torrie 1995 adalah: Y ij = µ + Keterangan : Y ij : Nilai pengamatan (respon) dari faktor perlakuan fraksi ke-i dan ulangan ke-j µ : Nilai rata-rata yang sesungguhnya Pi : Pengaruh perlakuan fraksi ke-i ε ij : Pengaruh galat pada perlakuan fraksi ke-i dan ulangan ke-j P i + ε ij ij ijk

19 39 Lintah laut Pemisahan Daging Jeron Pengeringan Pengeringan Daging lintah laut kering Jeroan lintah laut kering Analisis Proksimat Kadar air, abu, protein, lemak, karbohidrat Analisis Mineral dan logam berat Analisis asam amino dan asam lemak Ekstraksi Ekstrak kasar Analisis: Antioksidan Fitokimia Antioksidan terbaik Fraksinasi lanjut KLT Antioksidan terbaik Antioksidan terbaik Identifikasi GC-MS Senyawa aktif Gambar 5 Diagram penelitian