BAB III METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Kerangka Pemikiran Probiotik merupakan mikroorganisme hidup yang sangat penting untuk kesehatan dan memiliki hubungan yang simbiotik dengan manusia. Bakteri probiotik dalam usus akan membantu memecah makanan, menghasilkan vitamin dan mencegah pertumbuhan bakteri patogen penyebab penyakit. Spektrum penggunaan probiotik yang begitu luas mendorong untuk dilakukan penggalian galur potensial yang berasal dari sumber daya lokal. Salah satu potensi yang dikaji bersumber dari keyakinan masyarakat Ponorogo akan manfaat minuman tuak mengkudu bagi kesehatan. Kajian diawali dengan melakukan survey terhadap 10 orang penjaja jamu gendong yang secara rutin menjual tuak mengkudu atau dikenal dengan nama badeg pace. Pada umumnya tuak mengkudu dibuat dengan pengepresan mengkudu matang. Hasil cairan ekstrak ditambah gula aren yang selanjutnya didiamkan selama satu malam untuk mendapatkan aroma kas dan rasa yang sangat masam. Proses terjadinya fermentasi spontan ini menguntungkan bakteri asam laktat yang mampu tumbuh pada lingkungan yang relatif asam. Menurunnya ph selama proses fermentasi spontan akan menyeleksi secara alamiah bakteri-bakteri lain yang tidak mampu tumbuh pada lingkungan ph rendah. Untuk mengetahui lebih spesifik bakteri yang tumbuh pada tuak mengkudu perlu dilakukan isolasi dilanjutkan pengujian katalase negatif dan pewarnaan gram positif terhadap kemungkinan yang tumbuh berupa bakteri asam laktat jenis Lactobacillus sp. Dari data yang diperoleh dapat digunakan sebagai informasi awal untuk pengujian in-vitro sebagai kondidat probiotik. Pengujian in-vitro meliputi pengujian kemampuan hidup pada ph rendah dan pengujian antagonistik terhadap bakteri patogen serta pengujian kemampuan tumbuh pada media yang mengandung garam empedu. Setelah diperoleh isolat yang potensial sebagai kondidat probiotik, maka perlu dilakukan identifikasi mikroba. Identifikasi ini bertujuan untuk mengetahui spesies isolat yang diperoleh dan mempelajari sifat-sifat mikroba serta merunut hubungan genetik terdekat. Identifikasi dapat dilakukan secara molekuler dengan menggunakan PCR yang diperkirakan akan berada pada daerah 16S rrna yang umum untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini memiliki akurasi yang lebih baik dibandingkan dengan metode morfokologi dan identifikasi secara biokimia. Hasil identifikasi secara molekuler dapat membantu mempermudah menyelesaikan permasalahan perancangan teknologi proses produksi probiotik penghasil omega-6 dan penurun kolesterol.

2 27 Perancangan proses dikembangkan dengan tahapan : 1) melakukan analisis peluang dan permasalahan, 2) melakukan kreasi proses atau sintesis proses dan 3) pengembangan proses produksi probiotik, serta 4) analisis kelayakan finansial. Analisis peluang dan permasalahan dilakukan dengan cara menganalisis peluang pasar produksi probiotik, pemilihan proses produksi dan permasalahan penggunaan bahan baku. Berbagai jenis probiotik komersial yang saat ini banyak beredar di pasaran selalu dikaitkan dengan hasil metabolisme yang berupa kandungan lemak rendah yang tercantum dalam label produk. Penelitian ini diharapkan mampu mengungkap hal yang baru dimana bakteri yang ditemukan dapat menghasilkan omega-6 konsentrasi tinggi berupa asam linoleat yang memiliki fungsi untuk menurunkan kolesterol. Apabila manusia sering mengkonsumsi lemak dengan kandungan asam lemak jenuh yang tinggi, maka dapat menyebabkan kadar kolesterol darah mengalami peningkatan, sedangkan semakin tinggi kandungan asam lemak tak jenuh berarti kualitas minyak tersebut semakin baik karena omega-6 (asam linoleat) ternyata mampu mereduksi kolesterol. Kreasi proses dilakukan melalui percobaan skala laboratorium dengan menggunakan substrat standar glukosa, sehingga didapatkan rangkaian proses yang secara teknis paling sesuai. Dari data penelitian fermentasi skala laboratorium dengan media standar dapat digunakan sebagai data untuk pengembangan proses pada skala pilot plant 75 L dan analisa finansial terhadap rancangan yang dikembangkan. Desain produk dalam bentuk krem yang diharapkan mempunyai fungsi yang lebih luas perlu dibuat dalam formulasi media yang mampu menghasilkan viabilitas sel yang tinggi, sedangkan untuk melihat fungsi sebagai probiotik maka perlu dilakukan karakteristik produk dengan melakukan pengujian lanjutan secara in-vivo menggunakan hewan percobaan. Pengujian secara in-vivo diharapkan mampu menggali potensi kondidat probiotik sebagai penurunan kolesterol. Integrasi proses dilakukan bertujuan untuk mengintegrasikan seluruh tahapan proses produksi probiotik sehingga dihasilkan flowsheet yang utuh. Dengan bantuan perangkat lunak Hysis 3.2 dapat disimulasi diagram alir proses produksi probiotik yang utuh, sehingga diperoleh gambaran lengkap proses produksi probiotik dalam bentuk Process Engineering Flow Diagram (PEFD). Perancangan proses produksi dengan menyusun PEFD dilakukan dalam rangka aplikasi teknologi produksi probiotik penghasil omega-6 dan penurun kolesterol dengan menggunakan data-data fermentasi skala pilot plan 75 liter diperkirakan mampu memberikan keuntungan yang maksimal sehingga sangat menarik bagi pelaku bisnis untuk membangun industri probiotik penghasil omega-6 dan penurun kolesterol.

3 Bahan dan Alat Kultur bakteri yang digunakan Lactobacillus sp. isolat dari tuak mengkudu dan buah mengkudu matang asal Ponorogo, Jawa Timur, Lactobacillus bulgaricus (FNCC41, UGM), bakteri patogen Escherichia coli ATCC dan Staphylococcus aureus ATCC Bahan kimia yang digunakan adalah MRS (De Mann, Rogosa Oxoid CM 0361), TSB (Tryptone Soya Broth) Oxoid CM 0129, CMC (Himedia), Cat gram (Merck), Mueller Hinton Agar (Oxoid CM 0337), unsalted Butter (Orchid), bile salt (Oxoid), Icing Sugar, NaOH 0,2 N, Selenium tablet, H 2 SO 4 pekat, HCl 0,05 N, asam borat, CaCO 3 (Merck), HCl dan indikator BTB dan phenoptalein 1%, akuades, alkohol 70%, kapas, dan alumunium foil. Susu jagung, susu sapi, laktosa monohidrat Hewan uji sebanyak 30 ekor tikus putih galur Wistar jantan dalam 6 kelompok. Bobot badan rata-rata g dengan konsumsi pakan 5 g/100 g BB (Fox, J. G. et al., 1984), pakan standar tikus, pakan kolesterol, propil tiourasil, reagent KIT kolesterol total, trigliserida, HDL Kolesterol, EDTA, CMC Na, kertas saring dan aquades. Alat yang digunakan meliputi alat pengepres, blender, kain saring, kertas saring, botol steril, erlenmeyer, labu ukur, tabung reaksi, tabung destruksi, gelas ukur, tabung Eppendorf, cawan petri, pipet ukur, pipet tetes, mikropipet, jarum ose, dugrasky, bunsen, inkubator, laminar air flow, autoklaf, lemari pendingin, vortex, colony counter, haemocytometer, mikroskop, ph meter, spektrofotometer UV, hot plate stirer, destilator Kjeldahl, buret, statif, timbangan analitik, kandang tikus; autoklaf, oven, dan sentrifus sonde lambung. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Balai Pengkajian Bioteknologi, BPPT, Kawasan Puspiptek, Tangerang pada bulan Desember 2006 Desember 2011.

4 Tahapan Penelitian Garis besar tahapan penelitian perancangan proses produksi probiotik dari isolat baru Lactobacillus sp. penghasil omega-6 (ω-6) dan penurun kolesterol seperti pada diagram alir Gambar 5. ANALISIS PELUANG DAN PERMASALAHAN Analisis Peluang (Penelusuran data sekunder untuk mengkaji peluang pasar & kebijakan yang mendukung) Analisis Permasalahan Penelusuran data sekunder untuk pemilihan proses produksi. Kajian potensi penggunaan bahan baku yang efisien dan efektif. Kajian pemanfaatan isolat lokal yang potensial. KREASI PROSES Pengumpulan Data base untuk Kreasi Proses Melakukan Percobaan Percobaan dilakukan pada skala laboratorium sebagai penegasan hasil kreasi awal. Percobaan dengan substrat standar (glukosa) Sintesis Proses Melakukan sintesis dari data-data hasil percobaan skala laboratorium. Konfirmasi dengan hasil penelitian lain. Tidak Tolak Apakah ada keuntungan kasar? Ya Lanjutan

5 30 Lanjutan Pembuatan Diagram Alir dan Integrasi Proses (Process Engineering Flow Diagram) PENGEMBANGAN PROSES Pengujian Fermentasi Batch Skala Pilot Plant Substrat terbaik Glukosa percobaan skala laboratorium Karakterisasi Produk (Uji In-vivo) Konsentrasi Sel Konsentrasi Sel + Kaldu Desain & Formulasi Produk Pembuatan Detail Diagram Alir (Proses fermentasi & formulasi) Substrat Komplek Tidak Apakah Proses Menjanjikan? Ya Tolak Penentuan Kapasitas Produksi KELAYAKAN PERANCANGAN PROSES Perhitungan Neraca Massa Disain Peralatan Perhitungan : Biaya investasi Biaya modal kerja IRR, NPV, Net B/C, PBP Cash flow Kelayakan Finansial Proses Terpenuhi Gambar 5. Perancangan proses produksi probiotik penghasil omega-6 (ω-6) dan penurun kolesterol. Ya Tidak Rancangan Lanjutan

6 Penelitian Tahap 1: Analisis Peluang dan Permasalahan. Analisis Peluang Analisis peluang dilakukan dengan mengumpulkan data sekunder. Potensi pasar dikaji dari data sekunder atau data statistik perdagangan jumlah probiotik yang beredar di pasaran, sedangkan peluang pengembangan industri probiotik dikaji dari kebijakan pemerintah yang mendukung. Analisis Permasalahan Pengembangan industri probiotik penghasil omega-6 dan penurun kolesterol dilakukan dengan memanfaatkan isolat lokal dan bahan baku alternatif non laktosa. Solusi dari permasalahan tersebut dilakukan dengan mengisolasi bakteri asam laktat dari badeg pace dan buah mengkudu matang untuk memperoleh isolat lokal Lactobacillus sp. yang potensial sebagai probiotik. Isolat yang diperoleh selanjutnya dilakukan pengujian secara invitro dan identifikasi secara molekuler. Secara garis besar cara kerja isolasi, uji in-vitro dan identifikasi molekuler sebagai berikut : Isolasi Lactobacillus sp. Metode isolasi yang digunakan mengacu pada metode yang digunakan oleh Mincer et al., (2005). Isolasi dilakukan dari badeg pace dan buah mengkudu matang dengan menggunakan metode pengenceran dilanjutkan dengan plating secara pour plate menggunakan media MRS agar pada ph 6,2 yang ditambah CaCO 3. Inkubasi media dilakukan pada suhu 37 o C selama 48 jam. Isolat Lactobacillus sp. adalah isolat yang membentuk koloni dengan zona jernih, sel berbentuk batang, uji katalase negatif dan hasil pewarnaan gram positif. Isolat yang diperoleh selanjutnya dilakukan uji in-vitro, sedangkan isolat belum digunakan disimpan dalam campuran gliserol 20 % dan susu skim 10 % pada suhu 20 o C.

7 32 Uji in-vitro uji ketahanan Lactobacillus sp. pada ph rendah. Metode dikembangkan dari modifikasi Zavaglia et al., (1998). Satu ose isolat Lactobacillus sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media MRS broth, inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kemudian 1 % inokulum dimasukkan ke dalam 5 ml MRS cair yang diatur phnya dengan variasi ph 3,5; ph 3,0; ph 2,5; dan ph 2,0. Pengaturan ph digunakan HCl. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 24 jam. Penghitungan jumlah bakteri dalam inokulum pada awal dan akhir inkubasi dilakukan dengan metode plating menggunakan media MRS agar. Uji in-vitro kemampuan tumbuh Lactobacillus sp. pada garam empedu. Metode dikembangkan dari modifikasi Zavaglia et al., (1998). Satu ose isolat Lactobacillus sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media MRS broth, inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kemudian 1 % inokulum dimasukkan ke dalam media MRS cair dengan penambahan garam empedu dengan variasi konsentrasi 0,5 %; 1,0 %; 5,0 %; dan 10,0 %. Setelah diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37 o C dilakukan pengukuran Optical Density (OD) pada panjang gelombang 660 nm. Uji in-vitro seleksi Lactobacillus sp. yang bersifat antimikroba. Uji antimikroba dilakukan dengan metoda difusi sumur. Satu ose isolat Lactobacillus sp. diinokulasikan ke dalam 5 ml media MRS broth, inkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Satu ose bakteri penguji Escherichia coli ATCC dan Staphylococcus aureus ATCC masing-masing diinokulasikan ke dalam 5 ml media Tryptone Soya Broth, inkubasi pada suhu 29 o C selama 24 jam. Sebanyak 0,1 % inokulum bakteri penguji dimasukkan ke dalam medium Mueller Hinton agar steril suhu 45 o C, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan sampai padat. Kemudian dibuat lubang-lubang sumur (diameter 8 mm), lalu ke dalam masing-masing lubang dimasukkan 0,05 ml inokulum Lactobacillus sp., diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Kemudian diukur area bening (zone panghambatan) yang terjadi.

8 Identifikasi molekuler Lactobacillus sp. 33 Tahapan kerja identifikasi molekuler Lactobacillus sp. secara umum dimulai dari ekstraksi genom DNA, kemudian amplifikasi PCR. Setelah itu, identifikasi molekuler dilanjutkan dengan elektroforesis produk PCR dan purifikasi gel produk PCR. Setelah purifikasi gel produk PCR, diteruskan dengan amplifikasi PCR cycle sekuensing dan selanjutnya sekuensing dan yang terakhir adalah tahapan analisis blast. Cara kerja identifikasi molekuler secara lengkap disajikan pada Lampiran Penelitian Tahap 2 : Kreasi Proses Pengumpulan data sekunder Pengumpulan data sekunder dilakukan melalui penelusuran publikasi untuk mendapatkan data proses hasil dari penelitian yang telah dilakukan. Data-data hasil penelusuran pustaka seperti konsentrasi substrat, suhu fermentasi, kecepatan pengadukan, dan galur untuk fermentasi selanjutnya digunakan sebagai referensi didalam melakukan kreasi proses pada percobaan skala laboratorium 250 ml. Percobaan proses fermentasi galur Lactobacillus sp. pada skala laboratorium 250 ml. Proses fermentasi menggunakan isolat Lactobacillus sp. yang diperoleh dilakukan dengan tahapan peremajaan isolat (Fardiaz, 1989), pembuatan starter Lactobacillus sp. (modifikasi Sulandari dkk., (2001) dan proses fermentasinya. Prosedur peremajaan isolat dan pembuatan starter Lactobacillus sp. disajikan pada Lampiran 4. Proses fermentasi dilakukan pada skala laboratorium 250 ml dengan menggunakan substrat glukosa sebagai sumber karbon terdiri atas tiga taraf konsentrasi (20 g/l, 30 g/l, 40 g/l). Komposisi media fermentasi dengan kandungan unsur mikro diantaranya : 5 g/l Sodium asetat, 2 g/l Amonium asetat, 2 g/l Na2HPO4, 1 g/l Tween 80, 0,1 g/l MgSO4.7H2O dan 0,05 g/l MnSO4.5H, selanjutnya media ditambah air hingga ml untuk setiap volume satu liter. Setelah dilakukan inokulasi maka kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0 C. Selama fermentasi dihitung jumlah sel bakteri dan penimbangan bobot sel kering, kadar asam laktat, gula reduksi, protein dan asam linoleat pada jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, dan jam ke 48.

9 34 Prosedur kerja yang digunakan untuk pengukuran kadar asam linoleat seperti pada Lampiran 2, sedangkan prosedur kerja pengukuran gula reduksi (Miller, 1959) dan asam laktat seperti pada Lampiran 3. Prosedur kerja pengukuran kadar protein metode Kjelhdal (Sudarmadji et al., 1996) yang selanjutnya dikonversi menjadi kadar nitrogen, perhitungan jumlah sel bakteri secara SPC (Fardiaz, 1989) yang dikonversi menjadi bobot sel (g/l) dan pengukuran kadar asam laktat (AOAC, 1970) serta pengukuran ph (Fardiaz, 1989) seperti pada Lampiran 5. Sintesis proses fermentasi galur Lactobacillus sp. pada skala laboratorium 250 ml. Sintesis proses dilakukan dengan cara mengkonfirmasi hasil penelitian yang pernah dilakukan oleh peneliti lain yang mempunyai kemiripan. Hasil dari sintesis proses diharapkan dapat menentukan proses fermentasi yang terbaik dari hasil percobaan skala laboratorium 250 ml Penelitian Tahap 3 : Pengembangan Proses Pembuatan diagram alir dan integrasi proses Pembuatan diagram alir disusun berdasarkan hasil tahapan proses dari percobaan skala laboratorium 250 ml untuk kemudian dilakukan integrasi proses dari tahapan awal hingga akhir. Hasil dari integrasi proses yang merupakan hasil percobaan terbaik selanjutnya di uji pada skala pilot plant 75 L. Pengujian proses fermentasi curah dengan substrat glukosa skala pilot plant 75 L. Proses fermentasi menggunakan isolat Lactobacillus sp. yang diperoleh dilakukan dengan tahapan peremajaan isolat (Fardiaz, 1989), pembuatan starter Lactobacillus sp. (modifikasi Sulandari dkk., (2001) dan proses fermentasinya. Prosedur peremajaan isolat dan pembuatan starter Lactobacillus sp. disajikan pada Lampiran 4. Proses fermentasi dilakukan pada skala pilot plant 75 L dengan menggunakan substrat glukosa sebagai sumber karbon. Konsentrasi dipilih dari hasil percobaan skala laboratorium 250 ml yaitu 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l. Komposisi media fermentasi dengan kandungan unsur mikro diantaranya : 5 g/l Sodium asetat, 2 g/l Amonium asetat, 2 g/l Na2HPO4, 1 g/l Tween 80, 0,1 g/l MgSO4.7H2O dan 0,05 g/l MnSO4.5H, selanjutnya

10 35 media ditambah air hingga ml untuk setiap volume satu liter. Setelah dilakukan inokulasi maka kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0 C. Selama fermentasi dihitung jumlah sel bakteri dan penimbangan bobot sel kering, kadar asam laktat, gula reduksi, protein dan asam linoleat pada jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, dan jam ke 48. Pengujian proses fermentasi curah dengan media ekstrak jagung pada skala pilot plant 75 L. Proses fermentasi menggunakan isolat Lactobacillus sp. yang diperoleh dilakukan dengan tahapan peremajaan isolat (Fardiaz, 1989), pembuatan starter Lactobacillus sp. (modifikasi Sulandari dkk., (2001) dan proses fermentasinya. Prosedur peremajaan isolat dan pembuatan starter Lactobacillus sp. disajikan pada Lampiran 4. Pada proses fermentasi diperlukan ekstrak jagung dan ekstrak mengkudu serta susu segar. Susu segar dipasteurisasi pada suhu 121ºC selama 5 menit dan suhu diturunkan sampai mencapai 37 40ºC yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan starter. Kemudian campuran ekstrak jagung dan ekstrak mengkudu, lalu diinokulasi dengan starter 5% dari volume media dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Selama inkubasi dihitung jumlah sel bakteri/ bobot sel kering, kadar asam laktat, gula reduksi, protein dan asam linoleat pada jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, dan jam ke 48. Pada percobaan dengan menggunakan medium kompleks perbandingan ekstrak jagung dengan ekstrak mengkudu 8 : 2 sebagai medium. Selanjutnya medium ditambahkan susu murni dengan perbandingan 8 : 2. Komposisi media dengan kandungan unsur mikro diantaranya : 5 g/l Sodium asetat, 2 g/l Amonium asetat, 2 g/l Na2HPO4, 1 g/l Tween 80, 0,1 g/l MgSO4.7H2O dan 0,05 g/l MnSO4.5H, selanjutnya media ditambah air hingga ml untuk setiap volume satu liter. Dari hasil perhitungan sel bakteri asam laktat, kadar asam laktat, gula reduksi, protein dan asam linoleat, selanjutnya ditentukan periode yang paling baik untuk dilanjutkan pada proses pembuatan formulasi krem. Data-data yang diamati selama fermentasi adalah menghitung jumlah sel Lactobacillus sp. dengan cara standar plate count (SPC), mengukur ph, kadar asam laktat, kadar asam linoleat, gula reduksi, kadar nitrogen dari media kultivasi selama inkubasi 48 jam dengan suhu 37 0 C. Prosedur kerja yang digunakan untuk pengukuran kadar asam linoleat seperti pada Lampiran 2, sedangkan prosedur kerja pengukuran gula reduksi (Miller, 1959) dan asam

11 36 laktat seperti pada Lampiran 3. Prosedur kerja pengukuran kadar protein metode Kjelhdal (Sudarmadji et al., 1996) yang selanjutnya dikonversi menjadi kadar nitrogen, perhitungan jumlah sel bakteri secara SPC (Fardiaz, 1989) yang dikonversi menjadi bobot sel (g/l) dan pengukuran kadar total asam (AOAC, 1970) serta pengukuran ph (Fardiaz, 1989) seperti pada Lampiran 5. Desain dan formulasi produk probiotik krem Desain dan formulasi produk probiotik krim dilakukan dengan tahapan pembuatan krim probiotik (modifikasi Susilorini, 2006) Prosedur kerja desain dan formulasi produk probiotik krem disajikan pada Lampiran 6. Karakterisasi produk dengan pengujian in-vivo Lactobacillus sp. Uji aktifitas asimilasi kolesterol Pengujian asimilasi kolesterol dengan metode yang digunakan oleh Usman dan Hasono (1999). Adapun prosedur kerja secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 7. Pengujian in-vivo Lactobacillus sp. terhadap penurunan kolesterol Tahap adaptasi Tikus jantan putih galur Wistar yang digunakan sebanyak 20 ekor masing-masing ditempatkan pada kandang. Untuk menghindari agar tikus tidak stres maka selama 7 hari tikus hanya diberikan pakan standar dan air minum secara ad libitum. Diharapkan setelah 7 hari tikus jantan putih galur Wistar telah menyesuaikan kondisi fisiologis, nutrisi dan lingkungan maka selanjutnya tikus diberikan perlakuan sesuai rancangan. Tahap perlakuan pengujian penurun kolesterol Pada tahap perlakuan pengujian penurun kolesterol sebanyak 30 ekor tikus dikelompokkan menjadi 6 kelompok perlakuan seperti pada Lampiran 8. Pakan standar, pakan kolesterol, larutan PTU dan sampel probiotik diberikan setiap hari secara oral selama masa perlakuan. Penimbangan sisa-sisa pakan dilakukan setiap hari, sedangkan pengambilan darah tikus dan penimbangan bobot badan dilakukan setiap 7 hari selama 35

12 37 hari perlakuan. Prosedur penyiapan asupan konsentrat sel probiotik dan kaldu fermentasi seperti yang ditunjukkan pada Lampiran 8. Pengamatan terhadap hasil pengujian in vivo Lactobacillus sp. untuk penurunan kolesterol dilakukan terhadap kadar kolesterol total, trigliserida, HDL dan LDL. Dilakukan juga analisa proksimat penentuan kadar lemak dalam feses tikus Winstar yang digunakan. Prosedur pengujian tersebut disajikan pada Lampiran Penelitian Tahap 4 : Kelayakan finansial perancangan teknologi proses produksi probiotik basis data hasil percobaan skala pilot plant Pada tahap perancangan proses produksi probiotik menggunakan data fermentasi Lactobacillus sp. pada skala 75 L dengan membandingkan substrat standar (Glukosa) dan substrat kompleks (ekstrak jagung). Penentuan medium fermentasi terbaik dihitung secara garis besar berdasarkan keuntungan yang diperoleh. Dengan data skala pilot 75 liter yang diperkirakan memberikan keuntungan selanjutnya dilakukan analisis kelayakan finansial secara detail berdasarkan : data bahan baku media fermentasi skala 75 L, data kinetika biokonversi untuk menghitung neraca masa,. data penggunaan peralatan alur proses (PEFD). dan data tenaga kerja. Kajian terhadap kelayakan finansial meliputi NPV, IRR, Net B/C ratio, PBP dan BEP. Analisis sensitivitas dilakukan dengan asumsi terjadi (1) kenaikan harga bahan baku yaitu jagung dan mengkudu; (2) penurunan kapasitas proses produksi akibat keterbatasan ketersediaan bahan baku berupa mengkudu, jagung dan susu; dan (3) penurunan harga produk probiotik yang dapat disebabkan semakin banyaknya produk sejenis dengan harga yang lebih murah.