PROFIL SKRIPSI PROGRAM

Transkripsi

1 PROFIL FENOTIPIK ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERASAL DARI DAGING SAPI SKRIPSI DUDI FIRMANSYAH PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIANN BOGOR 2009

2 ABSTRACT Fenotipe Profile The Lactic Acid Bacteria From Meat. Firmansyah, D., I. I. Arief, and R. R. A. Maheswari The aim of this research was to observe the fenotipic profile of twenty-eight lactid acid bacteria (LAB) isolated from fresh meat. Those characteristic is determined by growing the lactid acid bacteria tested on MRS media i) at different temperature conditions; that contained ii) 6.5% concentration of NaCl or iii) amoxilin and chloramphenicol antibiotic and incubated at 37 o C for hours. The data were analyzed using ANOVA with GLM procedure, which is provided by MINITAB. Dissimilarity of 28 LAB isolate and treatment as an interaction became the first major concern of this study. The result showed that depends on its growth temperature the LAB could be grouping as mesofilic bacteria (27 isolates LAB) and one of them categorized as thermofilic bacteria. Supplementation of 6,5% NaCl in MRS media was not influenced the growth of LAB, and all of the 28 isolates showed a normal growth in this media after incubated at 37 C for 48 hours. Addition of antibiotic in the media influenced significantly the growth of LAB tested. Base on its capability to grow well at different temperatures and in MRS media contained NaCl 6,5%, also, especially base on its high tolerancy to growth at gastrointestinal tract condition(wijayanto, unpublished), three isolates there were 1B1, 2B4 and 1A5, were selected and tested in MRS broth contained different antibiotics. The result found that isolat LAB 1A5 was the most sensitive to chloramphenicol. The growth of LAB 1B1 and 2B4 in MRS broth contained amoxicillin were better than others showed by the population reduction that not more than 2 log. Keywords : Lactic acid bacteria, growth, temperature, NaCl 6.5%, antibiotic

3 RINGKASAN DUDI FIRMANSYAH. D Profil Fenotifik Bakteri Asam Laktat yang Berasal dari Daging Sapi. Skripsi. Program Studi Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama Pembimbing Anggota : Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. : Dr. Ir. Rarah R.A. Maheswari, DEA Bakteri asam laktat (BAL) merupakan jenis bakteri yang hidup pada lingkungan yang mengandung karbohidrat sebagai sumber gula. Proses isolasi BAL dilakukan pada daging segar untuk mendapatkan kultur starter BAL yang paling berpotensi sebagai kultur produk fermentasi daging. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasikan 28 jenis BAL yang sudah diisolasi dari daging yang dijual di pasar tradisional Bogor, dari segi fenotip yaitu kemampuan tumbuh pada kondisi lingkungan yang mengandung NaCl 6,5%, suhu 15 C, 37 C dan 45 C serta pada kondisi yang mengandung antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol. Penelitian dimulai dengan pemeriksaan kemurnian BAL terhadap 28 kultur yang sudah diisolas, perbanyakan dilanjutkan dengan dilanjutkan dengan pengujian kemampuan tumbuh BAL pada kondisi lingkungan yang mengandung NaCl 6,5%, suhu 15 C, 37 C dan 45 C serta pada kondisi yang mengandung antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol. Rancangan yang digunakan untuk uji pertumbuhan pada media NaCl 6,5% adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan faktor perlakuan yaitu 28 jenis BAL yang diberi perlakuan NaCl dengan konsentrasi 6,5% yang dilakukan 3 kali pengulangan yang dikelompokkan. Rancangan untuk uji sensitifitas terhadap antibiotik adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 3 dengan 3 kali ulangan, dengan faktor pertama adalah perbedaan antibiotik yang diberikan yaitu amoksisilin dan kloramfenikol. Faktor kedua adalah jenis isolat BAL yang berbeda yaitu 1B1, 2B4 dan 1A5. Uji daya tumbuh pada suhu 15 C, 37 C dan 45 C dilakukan secara kualitatif. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa 28 kultur tersebut merupakan kelompok BAL yang tergolong bakteri mesofil yaitu tumbuh pada suhu 15 C, 37 C dan 45 C kecuali kultur 1A1 yang termasuk pada kelompok bakteri thermofil karena mampu tumbuh pada suhu 37 C dan 45 C. Selama ditumbuhkan pada media yang mengandung NaCl 6,5% tidak terdapat penurunan yang nyata (P>0,05) terhadap pertumbuhan BAL. Semua BAL ini termasuk kelompok bakteri halofilik, sedangkan penurunan yang signifikan terjadi pada BAL yang ditumbuhkan pada media yang mengandung antibiotik. Jenis isolat dan antibiotik menunjukkan adanya interaksi yang positif. Isolat 1A5 mempunyai karakteristik yang paling sensitif terhadap kloramfenikol dibandingkan dengan isolat 1B1 dan 2B4. Isolat 1B1 dan 2B4 lebih resisten terhadap amoksisilin dibandingkan dengan 1A5. Kata-kata kunci : Bakteri asam laktat, suhu, pertumbuhan, NaCl 6,5%, antibiotik

4 PROFIL FENOTIPIK ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERASAL DARI DAGING SAPI DUDI FIRMANSYAH D Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor PROGRAM STUDI TEKNOLOGI HASIL TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009

5 PROFIL FENOTIPIK ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERASAL DARI DAGING SAPI Oleh DUDI FIRMANSYAH D Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 12 Agustus 2009 Pembimbing Utama Pembimbing Anggota Irma Isnafia Arief, S.Pt, M.Si NIP Dr. Ir. Rarah R A Maheswari, DEA NIP Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor Dr. Ir. Luki Abdullah, M.Sc.Agr NIP

6 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, Jawa Barat pada tanggal 9 Agustus 1986 dari pasangan yang sangat berbahagia Bapak Dede Iskandar dan Ibu Mumun Mintarsih. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara. Penulis mengenal pendidikan formal di Taman Kanak-kanak Pertiwi pada tahun kemudian melanjutkan ke pendidikan dasar pada tahun di SDN Sukaraja 2 Kabupaten Bogor, pendidikan lanjutan menengah pertama di tempuhnya pada tahun di SMP PGRI 5 Bogor dan pendidikan lanjutan menengah atas pada tahun di SMU PGRI 4 Bogor. Penulis diterima sebagai mahasiswa pada Program Studi Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun Selama mengikuti pendidikan di IPB, penulis aktif menjadi anggota Himpunan Mahasiswa Produksi Ternak (HIMAPROTER), menjadi panitia Bakti Sosial Turun Desa dan pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Pengolahan Daging pada tahun ajaran 2007/2008 dan 2008/2009. Penulis juga pernah magang di Bagian Pengolahan Daging Sapi Laboratorium Ruminansia Besar, Penggemukan Sapi Laboratorium Ruminansia Besar dan Rumah Potong Hewan Elder s. Penulis adalah penerima Beasiswa BBM pada tahun Selama proses penyusunan skripsi penulis bekerja di Laboratorium Ruminansia Besar Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, penulis melakukan penelitian selama tiga bulan dengan judul Profil Fenotipik Isolat Bakteri Asam Laktat yang Berasal dari Daging Sapi, di bawah bimbingan Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. dan Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA dan Ir Sri Rahayu M.Si sebagai pembimbing akademik.

7 KATA PENGANTAR Assalamua alaikum wr.wb. Alhamdulillah hirobil alamin mungkin kata itulah yang pantas penulis ucapkan sebagai bentuk syukur atas selesainya skripsi dengan judul Profil Fenotipik Isolat Bakteri Asam Laktat yang berasal dari Daging Sapi. Berkat rahmat dan hidayah Allah SWT penulis dapat menyelesaikan segala urusan dan permasalahan yang datang setiap saat sebagai ujian menuju hidup yang lebih baik. Tidak lupa shalawat dan salam penulis panjatkan bagi junjungan kami Nabi besar Muhammad SAW yang selalu penulis nantikan syafaatnya di hari akhir kelak. Penelitian ini dimulai dengan mengkonfirmasi 28 isolat bakteri asam laktat berdasarkan uji katalase, pewarnaan Gram dan morfologi secara mikroskopis sebagai pembuktian bahwa 28 kultur ini merupakan bakteri asam laktat. Penelitian utama dilakukan untuk mengetahui profil 28 isolat bakteri asam laktat (BAL) yaitu suhu pertumbuhan, ketahanan terhadap NaCl 6,5%, serta sensitifitas terhadap antibiotik amoksisilin dan kloramphenikol dari masing-masing kultur bakteri asam laktat yang sudah diisolasi dari daging sapi yang beredar di pasar yang ada di Bogor. Profil bakteri ini sangat penting hubungannya dengan jenis dan sifat dari bakteri asam laktat yang telah diisolasi, sehingga apabila akan dipergunakan sebagai kultur starter pemilihan isolat sesuai dengan kemampuannya yang mampu menghasilkan produk akhir yang diinginkan. Selain itu juga profil ini dapat mengetahui cara mengendalikan kerja dari bakteri asam laktat yang digunakan sebagai starter kultur. Demikian skripsi ini disusun, penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini. Kritik dan saran selalu penulis harapkan dan semoga bermanfaat bagi para pembaca.wassalamu alaikum wr.wb. Bogor, September 2009 Penulis

8 DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN... i ABSTRACT... ii LEMBAR PERNYATAAN... ii LEMBAR PENGESAHAN... ii RIWAYAT HIDUP... iii KATA PENGANTAR... iv DAFTAR ISI... v DAFTAR TABEL... vii DAFTAR GAMBAR... viii DAFTAR LAMPIRAN... ix PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang Tujuan TINJAUAN PUSTAKA Mikrobiologi Daging Bakteri Asam Laktat Klasifikasi Bakteri Asam Laktat Pertumbuhan Bakteri Antibiotik Kloramfenikol Amoksisilin METODE Lokasi dan Waktu Materi Rancangan Prosedur Pemeriksaan Kemurnian Bakteri Asam Laktat Uji Katalase Pewarnaan Gram Perlakuan Pertumbuahan pada Suhu 15, 37 dan 45 C Pertumbuhan pada NaCl 6,5% Uji Sensitivitas terhadap Antibiotik HASIL DAN PEMBAHASAN Pemeriksaan Kemurnian Bakteri Asam Laktat Uji Katalase Pewarnaan Gram

9 Morfologi Sel Pertumbuhan pada Suhu 15, 37 dan 45 C Pertumbuhan pada NaCl 6,5% Sensitivitas terhadap Antibiotik Amoksisilin dan Kloramfenikol.. 31 KESIMPULAN Kesimpulan Saran UCAPAN TERIMA KASIH DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN vi

10 DAFTAR TABEL Nomor Halaman 1. Batas Maksimum Cemaran Mikroba pada Daging (CFU/g) SNI Karakteristik Genus Bakteri Asam Laktat Karakteristik 28 Isolat Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Uji Katalase, Pewarnaan Gram dan Morfologinya Karakteristik 28 Isolat Bakteri Asam Laktat pada Suhu 15 C, 37 C dan 45 C Pertumbuhan 28 Isolat Bakteri Asam Laktat dalam NaCl 6,5% Jumlah Kematian Isolat 1B1, 2B4 dan 1A5 pada Media yang Mengandung Antibiotik Amoksisilin dan Kloramfenikol... 32

11 DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman 1. Kurva Pertumbuhan Struktur Kimia Kloramfenikol Struktur Kimia Amoksisilin Kekeruhan pada Uji Pertumbuhan BAL pada Suhu Berbeda Ketahanan Hidup Bakteri Asam Laktat pada NaCl 6,5%

12 DAFTAR LAMPIRAN Nomor Halaman 1. Hasil Uji Asumsi Pertumbuhan 28 Isolat BAL dalam Media NaCl 6,5% Hasil Sidik Ragam Pertumbuhan 28 Isolat BAL dalam Media NaCl6,5% Hasil Sidik Ragam Ketahanan Hidup BAL pada Media NaCl 6,5 % Hasil Sidik Ragam Laju Pertumbuhan BAL pada Media NaCl 6,5% Sensitivitas Isolat 1B1, 2B4 dan 1A5 terhadap Antibiotik Amoksisilin dan Kloramfenikol Hasil Uji Asumsi Sensitivitas Bakteri 1B1, 2B4 dan 1A5 terhadap Antibiotik Amoksisilin atau Kloramfenikol Hasil Sidik Ragam Sensitivitas Bakteri 1B1, 2B4 dan 1A5 terhadap Antibiotik Amoksisilin atau Kloramfenikol Hasil Uji Beda Sensitivitas Bakteri 1B1, 2B4 dan 1A5 terhadap Antibiotik Amoksisilin dan Kloramfenikol Hasil Uji Lanjut Pengaruh antara Jenis Bakteri yang digunakan. 41

13 PENDAHULUAN Latar Belakang Bakteri asam laktat (BAL) merupakan jenis bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir dari proses metabolismenya. BAL memanfaakan karbohidrat sebagai sumber nutrisi untuk proses metabolisme. Sumber Karbohidrat yang digunakan berasal dari daging, susu, dan produk lainnya. BAL juga ditemukan banyak pada saluran pencernaan karena sifatnya sebagai probiotik yang bermanfaat bagi manuasia. BAL ini mampu membantu proses penyerapan nutrisi dan mampu menyeimbangkan mikroflora dalam saluran pencernaan. BAL sering dikaitkan dalam proses pengawetan. Jenis pengawetan yang melibatkan mikrooorganisme adalah pengawetan secara biologis terhadap suatu produk dan merupakan bagian dalam pembuatan makanan fungsional. Asam organik berupa asam laktat dan asam asetat, senyawa asetaldehida (meningkatkan cita rasa) serta semacam senyawa antimikroba merupakan senyawa yang dihasilkan BAL yang berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri perusak. Fermentasi merupakan metode pengawetan pangan yang memanfaatkan mikroba tertentu, sehingga terjadi perubahan-perubahan baik kimia dan fisik pada produk yang difermentasi. Perubahan-perubahan ini mampu memperbaiki gizi dari produk dan umumnya menghambat mikroorganisme yang tidak diinginkan pada produk yang difermentasi. Biasanya produk fermentasi yang sering digunakan adalah dari daging yang umunya dikenal dengan nama salami. BAL yang digunakan dalam proses fermentasi diantaranya adalah bakteri dari genus Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, dan Streptococcus. Proses fermentasi dapat terjadi secara alami, namun terdapat beberapa kelemahan, sebagai contoh prosesnya tidak terkendali sehingga mutu produk yang dihasilkan tidak konstan. Fermentasi secara terkontrol dengan penambahan kultur starter yang sesuai dengan bahan dan produk akhir yang diinginkan, merupakan salah satu cara untuk mengendalikan proses fermentasi produk. BAL yang digunakan untuk kultur starter pembuatan fermentasi produk makanan perlu diseleksi terlebih dahulu. Seleksi yang dilakukan berdasarkan kemampuan yang dimiliki setiap BAL yaitu adaptasi tinggi terhadap kondisi lingkungan sehingga memiliki tingkat efisiensi yang tinggi. Kultur Starter dengan

14 kemampuan mudah beradaptasi terhadap kondisi lingkungan akan menghasilkan ketersediaan mikroba terjamin dan memungkinkan dimanfaatkan secara luas oleh masyarakat dengan biaya yang relatif murah. BAL yang digunakan sebagai kultur starter harus harus mempunyai kemampuan tahan terhadap antibiotik yang sering digunakan oleh masyarakat seperti penicilin, amoksisilin, kloramphenikol dan antibiotik lainnya. Kamampuan ini akan menjamin ketahanan hidup dari kultur yang digunakan apabila dikonsumsi oleh masyarakat yang sedang menjalani pengobatan, sehingga manfaat dari salami ini tetap ada dan dapat dikonsumsi oleh semua kalangan. Keberhasilan karakterisasi BAL akan memudahkan dalam penggunaannya sebagai kultur starter. Pengkarakterisasian BAL dapat memberikan informasi kultur yang sesuai untuk mendapatkan produk yang diinginkan. Kultur BAL akan mudah untuk dikendalikan dalam produk yang akan dibuat. Produk yang dihasilkan akan sesuai dengan produk jadi yang diinginkan baik dari segi fisik, kimia maupun mikrobiologinya. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi 28 jenis bakteri asam laktat, berdasarkan sifat fenotip meliputi kemampuan tumbuh pada kondisi lingkungan yang mengandung NaCl 6,5%, suhu 15 C, 37 C dan 45 C serta pada kondisi yang mengandung antibiotik amoksisilin dan kloramphenikol. 2

15 TINJAUAN PUSTAKA Mikrobiologi Daging Kandungan nutrisi dalam daging sangat memenuhi persyaratan untuk perkembangan mikroorganisme, baik mikroorganisme yang menguntungkan maupun mikroorganisme perusak atau pembusuk. Daging mempunyai kadar air yang tinggi yaitu 68-75%, kaya akan protein, mengandung sejumlah karbohidrat yang dapat difermentasikan, kaya akan mineral dan mempunyai ph yang menguntungkan bagi sejumlah mikroorganisme (Soeparno, 1998). Sebagian besar bakteri tumbuh di permukaan daging, namun tidak tertutup kemungkinan ditemukannya bakteri di dalam daging. Bakteri dapat mencapai jaringan dalam karkas dengan berbagai cara, diantaranya melalui mekanisme (1) jaringan ternak sehat dapat mengandung sejumlah populasi bakteri yang bersifat dinamis. Apabila bakteri-bakteri tersebut secara terus-menerus memperoleh akses ke dalam jaringan ternak hidup melalui membran mukosa saluran respirasi dan pencernaan. Populasi baru akan menggantikan bakteri-bakteri yang telah dibasmi oleh mekanisme ketahanan tubuh ternak, (2) karkas terkontaminasi oleh bakteri usus selama proses pemotongan dan proses setelah pemotongan. (3) bakteri masuk ke dalam jaringan pada waktu hewan terkena luka sebelum hewan dipotong, dan (4) bakteri yang sudah ada di permukaan karkas dapat mengkontaminasi lapisan jaringan otot yang lebih dalam akibat adanya penetrasi ke lapisan jaringan otot yang lebih dalam (Gill, 1982). Mikroorganisme yang terdapat pada daging segar yang secara alami diantaranya adalah Lactobacillus, Carnobacterium, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Enterococcus, Arthrobacter, Acinobacter, Brochorthrix, Listeria, Enterobacteriaceae, kapang dan khamir. Enterobacteriaceae psikotropik dapat juga ditemukan, sementara mikroorganisme Gram positif termasuk bakteri asam laktat dijumpai dalam jumlah kecil pada daging mentah (Lucke, 1997). Bakteri yang terdapat pada daging segar yang bersifat menguntungkan adalah bakteri Lactobacillus, Micrococcus, Carnobacterium dan Enterococcus. Bakteri yang bersifat merugikan yang terdapat pada daging segar adalah Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Arthrobacter, Brochorthrix, Listeria dan Enterobacteriaceae (Holt et al., 1994).

16 Standar Nasional Indonesia mensyaratkan batas maksimum cemaran mikroba seperti tercantum dalam Tabel 1. Tabel 1. Batas Maksimum Cemaran Mikroba pada Daging (CFU/g) SNI Batas Maksimum Cemaran Mikroba No Jenis Cemaran Mikroba Daging Segar/Beku Daging tanpa Tulang 1 Angka Lempeng Total Bakteri (ALTB) 1 x x Escherichia coli * 5 x x Staphylococcus aureus 1 x x Clostridium sp Salmonella sp.** 6 Coliform 1 x x Enterococci 1 x x Campylobacter sp Listeria sp. 0 0 Sumber : Badan Standar Nasional (BSN), 2000 Keterangan : (*) dalam satuan MPN/gram, (**) dalam satuan kuallitatif Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat ( BAL) adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat (glukosa) menjadi asam laktat. Efek bakterisidal dari asam laktat berkaitan dengan penurunan ph lingkungan menjadi 3 sampai 4,5 sehingga pertumbuhan bakteri lain termasuk bakteri pembusuk akan terhambat. Mikroorganisme umumnya dapat tumbuh pada kisaran nilai ph 6-8 (Buckle et al., 1987). Pemanfaatan BAL oleh manusia telah dilakukan sejak lama, yaitu untuk proses fermentasi makanan salah satunya pada daging yang difermentasi sebagai contoh sosis fermentasi atau salami. Bakteri asam laktat yang paling banyak ditemukan dalam daging fermentasi adalah strain Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, dan Streptococcus. Mikroorganisme ini merupakan bakteri yang bisa terdapat dimana saja dan bersifat sangat kompetitif. Mikroorganisme ini membutuhkan banyak nutrisi untuk tumbuh, daging dapat menyediakan kebutuhan tersebut. Mikroorganisme ini mengubah beberapa gula menjadi asam laktat dan hasil 4

17 metabolisme lainnya. Mikroorganisme ini bisa tumbuh dengan atau tanpa udara, tetapi sangat cepat menghasilkan asam tanpa kehadiran udara. Bakteri asam laktat juga sangat tahan terhadap garam dan tumbuh dengan baik pada formulasi sosis (Food Safety and Inspection Service, 2005). Efektivitas BAL dalam menghambat bakteri pembusuk dipengaruhi oleh kepadatan dan strain BAL serta komposisi media. Selain itu, produk substansi penghambat dari BAL dipengaruhi oleh media pertumbuhan, ph dan suhu lingkungan (Shortt, 1999) Klasifikasi Bakteri Asam Laktat Secara umum grup inti bakteri asam laktat terdiri dari 4 genus yaitu Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus dan Streptococcus yang didasarkan pada ciri morfologi, tipe fermentasi, kemampuan tumbuh pada suhu yang berbeda, sifat stereospesifik (D atau L laktik), serta toleransi terhadap asam dan basa. Klasifikasi bakteri asam laktat terus berkembang, sehingga genus Lactobabacillus menjadi Lactobacillus dan Carnobacterium. Genus Streptococcus menjadi 4 yaitu Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, dan Enterococcus. Genus Pediococcus menjadi Pediococcus, Tetratogenococcus, dan Aerococcus. Sementara pada genus Leuconostoc tidak ada perubahan. Klasifikasi tersebut dihasilkan dengan mempertimbangkan komposisi asam lemak pada membran sel, motilitas dan urutan rrna, serta persen guanin dan sitosin pada DNA. Klasifikasi spesies sering juga dicantumkan toleransinya terhadap garam dan ph, pertumbuhan terhadap suhu yang berbeda dan konfigurasi produksi asam laktat. Perbedaan fenotip atau sifat biokimia dibedakan dalam kemampuan memfermentasi karbohidrat, hidrolisis arginin, pembentukan asetosin, kemampuan tumbuh pada garam empedu, kemampuan menghemolisis, produksi polisakarida ekstraseluler, faktor pertumbuhannya, dihasilkannya beberapa enzim, kemampuan tumbuh pada susu dan perbedaan dalam serologinya (Pot et al., 1994; Axelsson, 1998). Berdasarkan metabolismenya bakteri dapat digolongkan dalam dua kelompok yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Kelompok homofermentatif adalah kelompok bakteri asam laktat yang mampu mengubah glukosa menjadi asam laktat dan kelompok bakteri asam laktat heterofermentatif adalah yang memfermentasi glukosa menjadi asam laktat, etanol/asam asetat dan CO 2 (Fardiaz, 1989). Bakteri 5

18 asam laktat yang bersifat homofermentatif misalnya Lactobacillus sp., Pediococcus cerevisae dan Streptococcus faecalis. Bakteri asam laktat yang mempunyai sifat heterofermentatif yaitu Leuconostoc mesentroides dan L. brevis (Ishak et al., 1986). Menurut Fardiaz (1998), berdasarkan kebutuhan oksigennya, mikroorganisme dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu ; a) aerob obligat, yaitu hanya tumbuh jika ada oksigen, b) anaerob obligat, yaitu mikroba yang hanya tumbuh jika tidak ada oksigen, c) anaerob fakultatif, yaitu mikroba yang dapat tumbuh dengan atau tanpa oksigen. Setiap bakteri mempunyai suatu enzim yang tergolong flavoprotein. Enzim tersebut dapat bereaksi dengan oksigen membentuk senyawa-senyawa beracun yaitu H 2 O 2 dan radikal bebas O 2. Bakteri aerobik dan anaerobik tetapi tidak sensitif terhadap oksigen (aerotoleran) mempunyai superoksidase dimutase yang memecah radikal bebas dan enzim katalase yang memecah H 2 O 2 sehingga menghasilkan senyawa-senyawa akhir yang tidak beracun. Bakteri yang bersifat anaerobik fakultatif mempunyai enzim superoksidasi dismutase tetapi tidak mempunyai enzim peroksidase yang mengkatalis reaksi antara H 2 O 2 menghasilkan senyawa yang tidak beracun. Bakteri yang bersifat anaerobik tidak mempunyai enzim superoksida maupun katalase (Fardiaz, 1992). Bakteri anaerob obligat akan mati bila terdapat oksigen dalam lingkungan hidupnya karena bakteri tersebut tidak mempunyai enzim katalase, sehingga hidrogen peroksidasi tidak dapat terurai dan akan meracuni bakteri itu sendiri (Hadioetomo, 1985). BAL merupakan mikroflora normal yang terdapat pada daging dan mungkin juga masuk ke dalam daging selama pengolahan. Penambahan garam, gula, nitrit dan asap serta penyimpanan dan pemeraman produk pada suhu rendah dengan potensi oksidasi dan reduksi yang menurun (misalnya dalam wadah pembungkus) merangsang pertumbuhan bakteri ini sehingga mengalahkan pertumbuhan bakteri lainnya yang tidak diinginkan (Arief, 2000). Bakteri asam laktat pada bahan yang mengandung gula dapat mengubah gula menjadi asam laktat yang menyebabkan penurunan ph dan menciptakan suasana yang menghambat pertumbuhan mikroba lain. Bakteri asam laktat sering digunakan dalam proses pengolahan makanan seperti keju, mentega dan yoghurt. Flavor dari produk tersebut biasanya dapat ditingkatkan oleh bakteri asam laktat (Ishak et al., 1986). 6

19 Tabel 2. Karakteristik Genus Bakteri Asam Laktat Karakteristik Lactobacillus Enterococcus Leuconostoc Pediococcus Streptococcus Bentuk Tetrad CO 2 dari Glukosa +/ Pertumbuhan : T 15 ºC /- T 45 ºC +/ /- +/- NaCl 6,5% +/- + +/- +/- - ph 4,4 +/- + +/- + - ph 9, Asam Laktat L DL L D DL Sumber : Batt (1999) Keterangan : *ND = tidak ditemukan Pertumbuhan Bakteri Pertumbuhan bakteri adalah suatu peningkatan massa atau jumlah sel total dan bukan dalam hal ukuran. Pertumbuhan sel dan pembentukan produk mencerminkan kemampuan sel yang dapat dipengaruhi oleh lingkungan. Pelzar dan Chan (1988) menyatakan bahwa istilah pertumbuhan umum digunakan untuk bakteri dan mikroorganisme lain dan biasanya mengacu pada perubahan di dalam hasil panen (pertambahan total masa sel) dan bukan perubahan individu organisme. Fardiaz (1992), menyatakan bahwa pada organisasi uniseluler pertumbuhan berarti pertambahan jumlah sel. Faktor-faktor utama yang dibutuhkan di dalam pertumbuhan kebanyakan spesies bakteri adalah nutrisi, nilai ph, suhu, ketersediaan oksigen dan komponen antimikroba. Bakteri tidak hanya bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tapi juga menunjukkan respon berbeda-beda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya. Nutrisi dibutuhkan oleh bakteri untuk membentuk energi dan menyusun komponenkomponen sel. Faktor selanjutnya adalah nilai ph pada media pertumbuhan bakteri. Kebanyakan bakteri tidak mampu tumbuh dalam kondisi yang terlalu basa ataupun terlalu asam. Nilai ph yang sangat baik untuk pertumbuhan bakteri adalah pada nilai 7

20 ph netral (Volk and Wheeler, 1988). Menurut Fardiaz (1992) Nilai ph sangat mempengaruhi pertumbuhan bakteri. Bakteri umumnya tumbuh pada nilai ph 3 sampai 6. Kebanyakan nilai ph optimum bakteri yaitu nilai ph yang menghasilkan pertumbuhan maksimum berada sekitar 6,5-7,5. Suhu juga mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan mikroorganisme. Keragaman suhu dapat juga mempengaruhi proses-proses metabolik tertentu serta morfologi sel (Pelczar, 1986). Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroba disebabkan suhu berpengaruh terhadap aktivitas enzim sebagai katalis reaksi-reaksi biokimia di dalam sel mikroba. Mikroba mempunyai suhu maksimum, minimum dan optimum untuk pertumbuhannya. Suhu optimum adalah suhu pada saat aktivitas metabolisme mikroba dapat berjalan dengan maksimum, suhu minimum adalah suhu terendah pada saat mikroba masih dapat hidup, sedangkan suhu maksimum adalah suhu tertinggi bagi mikroba untuk tumbuh dan berkembang dengan baik (Fardiaz, 1992). Berdasarkan suhu pertumbuhannya mikroba dibedakan atas tiga grup (Volk dan Wheeler, 1988) sebagai berikut : 1. Psikrofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh pada suhu 0 0 C dengan suhu optimum C dan suhu maksimum 20 0 C; 2. Mesofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh baik pada suhu sekitar C dan 3. Termofilik, yaitu mikroba yang dapat tumbuh baik pada suhu yang relatif tinggi dengan suhu minimum 25 0 C, suhu optimum C dan suhu pertumbuhan maksimumnya C. Bakteri biasanya tumbuh pada suhu kamar, tetapi beberapa bakteri yang tergolong termofilik akan tumbuh dengan baik pada suhu tinggi, yaitu C atau kadang-kadang sampai 60 0 C, sedangkan bakteri lainnya yang tergolong psikrofilik dapat tumbuh pada suhu rendah hingga pembekuan. Selain berpengaruh terhadap pertumbuhan sel, suhu juga berpengaruh terhadap pembentukan produk oleh mikroba. Hal ini berhubungan dengan jenis mikroba yang dominan selama fermentasi. Secara umum, pertumbuhan jasad renik terjadi pada suhu (antara suhu minimum dan maksimum) yaitu sekitar 30 o C. Kecepatan pertumbuhan jasad renik meningkat secara lambat dengan naiknya suhu sampai mencapai kecepatan 8

21 pertumbuhan maksimum, sedangkan diatas suhu maksimum, kecepatan pertumbuhan menurun dengan cepat dengan naiknya suhu (Fardiaz, 1992). Kurva pertumbuhan mikroba merupakan gambaran dari pertumbuhan secara bertahap sejak awal hingga terhenti mengadakan kegiatan. Secara umum fase pertumbuhan bakteri terbagi menjadi lima fase, yaitu 1) fase lag, 2) fase logaritmik, 3) fase pertumbuhan lambat, 4) fase stasioner, dan 5) fase kematian (Suriawiria, 2005). Jumlah Bakteri Fase stasioner Fase menuju kematian Fase pertumbuhan Fase kematian Fase logaritmik Fase Lag Waktu Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Bakteri Fase pertama merupakan fase lag (lambat) dimana pada tahap ini pertambahan jumlah populasi bakteri sangat sedikit atau bahkan tidak terjadi penambahan bakteri. Fase kedua adalah fase logaritmik (eksponensial) dimana fase ini perkembangan bakteri seimbang dan bakteri mampu membelah dengan kecepatan konstan. Fase ketiga adalah fase statis (tetap) karena jumlah sel yang membelah sama dengan jumlah sel yang mati, sehingga jumlah sel bakteri konstan. Fase terakhir adalah fase kematian, dimana jumlah sel bakteri mulai menurun karena nutrien dalam media dan cadangan energi dalam sel bakteri mulai menipis (Pelczar dan Chan, 1988). Antibiotik Antibiotik adalah salah satu jenis senyawa antibakteri, baik alami maupun sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Penggunaan antibiotika khususnya berkaitan dengan pengobatan penyakit infeksi, meskipun 9

22 dalam bioteknologi dan rekayasa genetika juga digunakan sebagai alat seleksi terhadap mutan atau transforman. Antibiotika bekerja seperti pestisida dengan menekan atau memutus satu mata rantai metabolisme, hanya saja targetnya adalah bakteri. Antibiotika berbeda dengan desinfektan karena cara kerjanya. Desinfektan membunuh kuman dengan menciptakan lingkungan yang tidak wajar bagi kuman untuk hidup (Alcamo, 1984). Setiap antibiotik sangat beragam keefektifannya dalam melawan berbagai jenis bakteri. Ada antibiotika yang membidik bakteri Gram negatif atau Gram positif, ada pula yang spektrumnya lebih luas. Keefektifannya juga bergantung pada lokasi infeksi dan kemampuan antibiotik mencapai lokasi tersebut. Antibiotika dapat digolongkan berdasarkan sasaran kerja senyawa tersebut dan susunan kimiawinya. Enam kelompok antibiotika (Black, 2004) dilihat dari target atau sasaran kerjanya yaitu sebagai berikut : 1) Inhibitor sintesis dinding sel bakteri, mencakup golongan penisilin, polipeptida dan Sefalosporin, misalnya ampisilin, penisilin G; 2) Inhibitor transkripsi dan replikasi, mencakup golongan quinolone, misalnya rifampisin, antinomisin D, asam nalidiksid; 3) Inhibitor sintesis protein, mencakup banyak jenis antibiotik, terutama dari golongan Macrolide, Aminoglycoside, dan tetrasiklin, misalnya gentamisin, kloramfenikol, kanamisin, streptomisin, oksitetrasiklin; 4) Inhibitor fungsi membran sel, misalnya ionomisin, valinomisin; 5) Inhibitor fungsi sel lainnya, seperti golongan Sulfa atau sulfonamid, misalnya oligomisin, tunicamisin; dan 6) Antimetabolit, misalnya azaserine. Kloramfenikol Kloramfenikol adalah antibiotik yang mempunyai aktifitas bakteriostatik, dan pada dosis tinggi bersifat bakterisidal. Aktivitas antibakterinya dengan cara menghambat sintesa protein dengan jalan mengikat ribosom subunit 50S, yang merupakan langkah penting dalam pembentukan ikatan peptida. Struktur kimia antibiotik kloramfenikol adalah 2,2-dichlor-N- [(ar,br)-bhydroxy-a-hydroxymethyl- 4-nitrophenethyl] acetamide yang tersusun dari C 11 H 12 Cl 2 N 2 O 5 dengan berat massa g/mol (Black, 2004). Kloramfenikol 10

23 efektif terhadap bakteri aerob Gram positif, termasuk Streptococcus pneumoniae, dan beberapa bakteri aerob Gram negatif, termasuk Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Salmonella, Proteus mirabilis, Pseudomonas mallei, Ps. cepacia, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella dan Shigella (Alcamo, 1984) ). Gambar 2. Struktur Kimia Kloramfenikol (Alcamo, 1984) Amoksisilin Amoksisilin adalah antibiotik yang termasuk ke dalam golongann penisilin, dengan aktivitasnya membunuh bakteri secara langsung tetapi dengan caraa mencegah bakteri membentuk semacam lapisan yang melekat di sekujur tubuhnya. Lapisan ini mempunyai fungsi yang sangat vital bagi bakteri, yaitu untuk melindungi bakteri dari perubahan lingkungan dan menjaga agar tubuh bakteri tidak tercerai berai. Bakteri tidak akan mampu bertahan hidup tanpa adanyaa lapisan ini. Amoksisilin sangat efektif untuk beberapa bakteri seperti H. influenzae, N. gonorrhoea, E. coli, Pneumococci, Streptococci i, dan beberapa strain dari Staphylococci (Alcamo, 1984). Gambar 3. Struktur Kimia Amoksisilin (Alcamo, 1984) Struktur kimia antibiotik amoksisilin adalah 7-[2-amino-2-(4- hydroxyphenyl)-acetyl]amino-3, 3-dimethyl-6-oxo- 2-thia-5 azabicyclo [3.2.0]heptane -4-carboxylic acid yang tersusun dari C 16 H 19N 3 O 5 S dengan berat massa g/mol (Morin and Gorman, 1982). Amoksisilin stabil dalam kondisi asam serta memiliki keuntungan tambahan dengann tidak berikatan dengann makanan 11

24 seperti pada kebanyakan antiobiotik lainnya karena Amoksisilin ini dieksresikan secara cepat ke dalam bentuk urin (Alcamo, 1984). 12

25 METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bagian Ruminansia Besar dan Labolatorium Ilmu Produksi Ternak Perah Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini berlangsung dalam dua tahap yaitu tahap pertama dari bulan Januari sampai Maret 2008 untuk pemeriksaan kemurnian BAL, pertumbuhan pada suhu berbeda dan pertumbuhan pada NaCl 6,5%. Tahap kedua pada bulan November sampai Desember 2009 untuk pengujian terhadap sensitivitas antibiotik. Materi Bahan Bahan bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah 28 isolat bakteri asam laktat yang berasal dari daging sapi. Isolat bakteri didapat dari daging yang dijual di empat pasar yang berada di Bogor : pasar Anyar (1A1, 1A2, 1A4, 1A5, 1A6, 1A32, 2A1, 2A2 dan 2A3), pasar Cibeureum (1B1, 1B2, 2B1, 2B2, 2B3 dan 2B4), pasar Gunung Batu (1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 2C2 dan 2C12) dan pasar Ciampea (1D1, 1D2, 1D3, 2D1, 2D2, D41 dan 2D42) (Hidayati, 2006). Media yang digunakan adalah deman Rogosa Sharp Agar (MRSA), deman Rogosa Sharp Broth (MRSB), Yeast extract, Buffer Peptone Water (BPW), antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol, NaCl, H 2 O 2, alkohol, kristal violet, iodin, safranin, minyak imersi dan akuades. Alat Peralatan yang digunakan adalah tabung reaksi, cawan petri, ose, inkubator, kompor listrik, bunsen, kapas, alumunium foil, karet, plastik HDPE, panci, gelas objek, cawan petri, tabung reaksi, vortex, oven, autoclave, termometer, rak tabung reaksi, pipet dan alat gelas lain. Rancangan Rancangan yang digunakan untuk uji pertumbuhan pada media NaCl 6.5% adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan faktor perlakuan yaitu 28 jenis bakteri asam laktat yang diberi perlakuan NaCl dengan konsentrasi 6,5% yang dilakukan 3 kali pengulangan yang dikelompokkan. Rancangan untuk uji sensitifitas terhadap antibiotik adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 3x2 dengan 3 kali

26 ulangan. Faktor pertama adalah jenis isolat bakteri asam laktat yang berbeda yaitu 1B1, 2B4 dan 1A5. Faktor kedua adalah antibiotik yang diberikan yaitu kloramfenikol dan amoksisilin. Model matematis yang digunakan untuk Rancangan Acak Lengkap (RAL) berdasarkan Steel and Torrie (1995) : Yij = μ + τi + εij Keterangan : Yij = variabel yang akan dianalisis μ = nilai rataan umum τi = pengaruh 28 kultur bakteri asam laktat εij = galat percobaan Peubah yang diamati adalah jumlah populasi akhir setelah ditumbuhkan pada NaCl 6,5%. Data yang didapat dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Jika berbeda nyata dilakukan uji lanjut Tukey (Steel dan Torrie, 1995). Model matematis yang digunakan untuk Rancangan Acak Lengkap pola faktorial 3x2 berdasarkan Steel and Torrie (1995) : Y ijk = µ + α i + β j + (αβ) ij + ε ijk Keterangan : Y ijk = variabel yang akan dianalisis µ = nilai rataan umum α i β j = pengaruh faktor I pada taraf ke-i; i = 1B1, 2B4 dan 1A5 = pengaruh faktor II pada taraf ke- j; j = antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol (αβ) ij = interaksi antara faktor I pada taraf ke-i dan faktor II pada taraf ke-j ε ijk = galat percobaan Peubah yang diamati adalah jumlah kematian akibat antibiotik amoksisilin dan kloramfenikol. Data yang didapat dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Jika terjadi interaksi dan hasilnya berbeda nyata dilakukan uji lanjut Tukey (Steel dan Torrie, 1995). 14

27 Prosedur Pemeriksaan Kemurnian Bakteri Asam Laktat Kultur starter yang telah diisolasi dari daging sapi pada penelitian sebelumnya di konfirmasi kembali untuk memastikan kemurniannya dengan cara ditumbuhkan pada media deman Rogosa Sharp Agar (MRSA) dengan metode striking dan di inkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam, kemudian diambil satu koloni yang dianggap sebagai koloni bakteri asam laktat dan dimasukan ke deman Rogosa Sharp Broth (MRSB), kultur ini disebut kultur stok. Setiap kultur stok dilakukan penyegaran pada media MRSB sebelum dilakukan pengujian. Sebanyak 1 ml kultur diinokulasikan ke dalam media MRSB. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam yang hasilnya disebut kultur kerja. Kultur kerja ini yang digunakan untuk mengkonfirmasi bakteri uji. Uji yang dilakukan adalah uji katalase dan pewarnaan Gram. 1) Uji Katalase (Lay, 1994) Sebanyak 1 ose isolat dioleskan pada gelas objek yang telah disterilkan dengan alkohol. Gelas objek kemudian ditetesi larutan H 2 O 2 3%. Preparat diamati, bila terjadi gelembung gas maka menunjukkan bakteri dengan katalase positif dan apabila tidak terbentuk gelembung gas bakteri tersebut katalase negatif. Semua bakteri uji dilakukan pengulangan sebanyak 4 kali ulangan. 2) Pewarnaan Gram (Hadioetomo, 1990). Sampel bakteri dari koloni yang homogen dioleskan pada kaca objek kemudian difiksasi panas. Olesan bakteri kemudian diteteskan dengan kristal violet selama satu menit, kemudian diratakan, dibilas dengan akuades dan dikering udarakan. Setelah kering, olesan bakteri diteteskan iodium dan diratakan kembali, keringkan udara selama dua menit, kemudian dibilas akuades dan ditiriskan. Preparat dicuci dengan pemucat warna yaitu etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik, kemudian dicuci segera dengan akuades dan ditiriskan. Preparat selanjutnya diteteskan safranin selama 30 detik, dibilas dengan akuades dan ditiriskan. Setelah kering preparat diteteskan minyak imersi dan diamati dibawah mikroskop untuk melihat bentuk dan warna dunding sel setelah dilakukan pewarnaan. Bakteri yang termasuk dalam 15

28 kelompok Gram positif akan menunjukkan warna ungu atau gelap sedangkan kelompok bakteri Gram negatif akan menunjukkan warna merah safranin. Perlakuan 1) Pertumbuhan pada Suhu 15 ºC, 37 ºC dan 45 ºC (Harrigan dan Mc. Cance, 1988) Sampel kultur kerja bakteri asam laktat umur 24 jam masing-masing diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan dalam 9 tabung reaksi yang sudah berisi MRSB sebanyak 9 ml. Kemudian diinkubasi pada suhu 15 ºC dan 45 ºC selama hari. Kontrol adalah tabung dengan kultur yang sama diinkubasi pada suhu 37 ºC. Pengujian terhadap suhu pertumbuhan BAL dilakukan triplo. Hasil positif atau adanya pertumbuhan ditunjukkan dengan terbentuknya kekeruhan, Kekeruhan yang terjadi menyatakan kemampuan BAL tumbuh pada suhu yang diujikan. Bila tidak terdapat pertumbuhan yang ditunjukkan dengan media tetap bening atau sama dengan media MRSB maka diberi tanda negatif. 2) Pertumbuhan pada NaCl 6,5% (Harrigan dan Mc. Cance, 1988) Pengujian dilakukan untuk mengetahui toleransi bakteri asam laktat terhadap NaCl dengan konsentrasi 6,5%. Kultur kerja bakteri asam laktat dihitung populasi awalnya terlebih dahulu dengan cara mengambil 1 ml kultur bakteri asam laktat dimasukan dalam tabung reaksi yang sudah mengandung 9 ml BPW untuk menghasilkan pengenceran Selanjutnya dilakukan pengenceran desimal hingga diperoleh pengenceran Pemupukan dilakukan dengan cara memupukan 1 ml pengenceran 10-7, 10-8 dan 10-9 pada media MRSA sebanyak 12 ml dalam cawan Petri steril secara duplo. Kultur kerja bakteri asam laktat umur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1ml dalam media MRSB yang mengandung NaCl dengan konsentrasi 6,5%. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama jam yang dilakukan secara triplo. Hasil yang positif ditunjukan dengan terbentuknya kekeruhan atau adanya endapan dan selanjutnya dihitung populasinya. Cara menghitung populasinya sama seperti perhitungan populasi awal tetapi faktor pengencerannya sampai

29 3) Uji Sensitifitas terhadap Antibiotik Uji dilakukan pada bakteri-bakteri dengan kemampuan tumbuh pada suhu sedang atau pada bakteri mesofil. Bakteri mesofil ini memberikan respon yang berbeda pada suhu pertumbuhan 15 ºC. Bakteri tersebut adalah isolat 1B1, 2B4 dan 1A5. Pemilihan isolat uji juga berdasarkan kemampuan ketahanannya terhadap garam empedu dan pada suasana asam yaitu pada ph 2 (Wijayanto, Unpublished). Bakteri tersebut dikarakterisasikan berdasarkan sensitifitas terhadap antibiotik khususnya amoksisilin dan kloramfenikol dengan menumbuhkan kultur 2B4, 1A5 dan 1B1 ke dalam media yang ditambahkan dengan masing-masing antibiotik dengan konsentrasi dalam larutan 0,25 gram/ml yang diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 ºC yang sebelumnya dilakukan perhitungan populasi awal dan kemudian dihitung kembali jumlah bakteri yang masih bertahan dalam kondisi tersebut. Perhitungan yang dilakukan seperti perhitungan yang dilakukan pada uji pertumbuhan pada NaCl 6,5%, faktor pengenceran yang dilakukan pada perhitungan uji sensitifitas pada antibiotik untuk perhitungan awal faktor pengencerannya 10-9 dan untuk perhitungan akhirnya faktor pengencerannya sampai

30 HASIL DAN PEMBAHASAN Pemeriksaan Kemurnian Bakteri Asam Laktat Pemeriksaan kemurnian bakteri asam laktat (BAL) merupakan cara untuk memastikan bahwa bakteri yang akan diuji merupakan kultur murni BAL hasil isolasi dengan mengetahui karakteristik masing-masing kultur berdasarkan sifat yang tampak atau sifat yang muncul dari tiap-tiap bakteri sebagai identitas yang melekat pada setiap bakteri. Karakteristik tersebut berdasarkan profil fenotipnya seperti berdasarkan dinding selnya melalui pewarnaan Gram, uji katalase serta bentuk dari masing-masing isolat BAL yang sudah diisolasi sebelumnya dari daging sapi yang beredar di Bogor (Hidayati, 2006). Uji Katalase Uji katalase merupakan salah satu uji untuk mengetahui keberadaan enzim katalase pada bakteri uji. Ternyata 28 isolat yang diuji tidak menimbulkan gelembung atau gas, hasil ini dapat dilihat pada Tabel 3. Hal ini menunjukkan bahwa isolat-isolat ini termasuk dalam katalase, karena tidak mempunyai suatu enzim katalase yang mampu menguraikan H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2 sehingga pada saat uji tidak terjadi gelembung. Hasil ini diperkuat oleh hasil penelitian Hidayati (2006) sebagai peneliti awal yang mengisolasi bakteri 1A1, 1A2, 1A4, 1A5, 1A6, 1A32, 2A1, 2A2, 2A3, 1B1, 1B2, 2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 2C2, 2C12, 1D1, 1D2, 1D3, 2D1, 2D2, D41 dan 2D42 yang menyatakan bahwa 28 isolat ini merupakan katalase negatif karena semua bakteri ini tidak mempunyai enzim katalase. Hal ini diperkuat oleh Malaka dan Laga (2005) yang menyatakan bahwa umumnya BAL tidak mempunyai enzim katalase atau bersifat katalase negatif. Menurut Fardiaz (1989) bakteri yang bersifat katalase negatif ini adalah bakteri yang hidup dalam lingkungan anaerobik dan anaerobik fakultatif. Adanya oksigen dalam lingkungan bakteri anaerobik akan menyebabkan racun karena oksigen akan bereaksi dengan flavoprotein yang menghasilkan senyawa H 2 O 2 dan O 2. Bakteri anaerobik tidak mempunyai enzim katalase ataupun enzim peroksidase yang mampu menginaktifkan atau memecah H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2. Keberadaan oksigen dalam lingkungan bakteri anaerobik fakultatif tidak mempengaruhi hidup bakteri ini. Bakteri anaerobik fakultatif meskipun tidak

31 mempunyai enzim katalase tetapi bakteri ini mempunyai enzim peroksidase sehingga H 2 O 2 yang terbentuk akan diuraikan menjadi H 2 O dan O 2. Oleh karena itu bagi bakteri anaerobik fakultatif, ada dan tidaknya oksigen tidak mempengaruhi pertumbuhannya (Fardiaz, 1989). Goktepe et al., (2006) menyatakan bahwa bakteri Lactobacillus merupakan bakteri anaerobik fakultatif yang mampu bertahan hidup dalam kondisi lingkungan yang mengandung oksigen. Bakteri ini tidak mempunyai enzim katalase atau katalase negatif tetapi bakteri ini mempunyai enzim peroksidase yang mampu menginaktifkan H 2 O 2. Berbeda dengan bakteri-bakteri yang bersifat anaerobik yang tidak bisa hidup apabila ada oksigen dalam lingkungannya, karena bakteri ini tergolong bakteri anaerobik (Fardiaz, 1989). Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram merupakan metode uji untuk mengetahui makromolekul dinding sel setiap isolat bakteri uji. Komposisi kimia dinding sel mikroba sangat bervariasi, sehingga terdapat perbedaan kemampuan mengadsorpsi (melekat) di antara spesies, galur, dan bahkan diantara tipe sel pada organisme yang sama (Yuniarti dkk, 2003). Bakteri berdasarkan reaksi pewarnaan Gram dibedakan menjadi bakteri Gram positif dan Gram negatif. Sebanyak 28 isolat bakteri asam laktat dilakukan pengujian pewarnaan Gram. Hasil yang didapatkan ternyata isolat 1A1, 1A2, 1A4, 1A5, 1A6, 1A32, 2A1, 2A2, 2A3, 1B1, 1B2, 2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 2C2, 2C12, 1D1, 1D2, 1D3, 2D1, 2D2, D41 dan 2D42 merupakan bakteri Gram positif. Hasil ini ditunjukan dengan hasil pewarnaan pada sel bakteri berwarna biru yang dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x (Tabel 3). Uji pewarnaan pada kultur ini sesuai dengan hasil yang dilakukan oleh Hidayati (2006) yang menyatakan bahwa 28 kultur ini merupakan bakteri Gram positif. Pato (2003) menegaskan bahwa BAL adalah kelompok bakteri Gram positif. Hal yang sama juga dikemukakan oleh Malaka dan Laga (2005) yang menyatakan bahwa dari segi fisiologis BAL adalah bakteri Gram positif. Fardiaz (1989) menjelaskan bahwa pada bakteri Gram positif dinding selnya lebih tebal dibandingkan bakteri Gram negatif, 90% dinding selnya tersusun oleh peptidoglikan dan lapisan tipisnya adalah teikoat. Yuniarti dkk (2003) menegaskan bahwa dinding sel bakteri Gram positif merupakan struktur yang sangat 19

32 renggang (porous) dengan komponen utama peptidoglikan yang mengandung gugus asam. Proses pewarnaan tahap pertama adalah memberi pewarna basa kristal violet yang menyebabkan membran sitoplasma yang terdiri dari protein dan lipid akan menyerap warna. Tahap selanjutnya dalam pewarnaan Gram adalah memberi larutan iodium sehingga akan terbentuk suatu kompleks antara kristal vioilet dengan iodium. Perlakuan selanjutnya adalah pencucian dengan menggunakan alkohol, proses ini akan mengakibatkan dinding sel mengalami dehidrasi yang kemudian pori-porinya mengkerut, permeabilitas menurun sehingga kompleks kristal violet dan iodium yang sudah terbentuk pada membran sitoplasma tidak bisa keluar dan saat diberi pewarna safranin yang berwarna merah. Pewarna safranin tidak bisa masuk ke dalam membran sitoplasma. Kompleks kristal violet dan iodium tidak terpengaruh, sehingga sel bakteri garam positif tetap berwarna biru. Morfologi Sel Konfirmasi bakteri uji yang terakhir diuji adalah morfologi sel. Sebanyak 28 isolat BAL dikarakterisasi berdasarkan morfologi selnya untuk mengetahui bentuk bakteri dari masing-masing isolat dengan menggunakan mikroskop. Fardiaz (1992) menyatakan bahwa berdasarkan bentuk morfologinya bakteri dibagi menjadi 3 golongan yaitu golongan batang (basil), bulat (kokus) dan golongan spiral. Preparat masing-masing isolat yang sudah dilakukan pewarnaan Gram diamati bentuknya dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x. Hasil pengamatan morfologi sel 28 isolat BAL dapat dilihat pada Tabel. 1 yang menyatakan bahwa sebanyak 6 isolat yaitu 1A1, 1A4, 2B1, 2B3, 1D2, 2D1 dan 2D2 merupakan bakteri berbentuk bulat (kokus) dengan susunan tunggal atau. Menurut Fardiaz (1992) berdasarkan morfologinya isolat ini termasuk dalam genus Streptococcus, Pediococcus dan Micrococcus, karena mempunyai bentuk bulat yang hidup secara berpasangan atau membentuk rantai panjang atau pendek. Sebanyak 21 isolat yaitu 1A2, 2A2, 1A5, 1A6, 1A32, 2A1, 2A3, 1B1, 1B2, 2B2, 2B4, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 2C2, 2C12,1D1, 1D3, 2D41 dan 2D42 adalah bakteri dengan bentuk batang (basil) dengan susunan tunggal atau pendek. Isolat ini merupakan kelompok bakteri asam laktat genus Lactobacillus (Fardiaz, 1992). 20

33 Isolat Bakeri Tabel 3. Karakteristik 6 Isolat Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Uji Katalase, Morfologi dan Pewarnaan Gram Uji Katalase Morfologi Pembesaran 1000X Keterangan Pewarnaan Gram 1A1 bulat, susunan Gram Positif 1A4 bulat, susunan Gram positif 2B1 bulat, susunan Gram positif 2B3 bulat, susunan Gram Positif 1D2 bulat, susunan Gram Positif 21

34 Isolat Bakteri Uji Katalase Morfologi Pembesaran 1000X Keterangan Pewarnaan Gram 2D1 bulat, susunan Gram Positif 2D2 bulat, susunan Gram Positif 1A2 batang, susunan Gram positif 1A5 batang, susunan Gram positif 1A6 batang, susunan Gram Positif 22

35 Isolat Bakteri Uji Katalase Morfologi Pembesaran 1000X Keterangan Pewarnaan Gram 1A32 batang, susunan Gram Positif 2A1 batang, susunan Gram Positif 2A2 batang, susunan Gram positif 2A3 batang, susunan Gram positif 1B1 batang, susunan Gram Positif 23

36 Isolat Bakteri Uji Katalase Morfologi Pembesaran 1000X Keterangan Pewarnaan Gram 1B2 batang, susunan Gram Positif 2B2 batang, susunan Gram Positif 2B4 batang, susunan Gram Positif 1C1 batang, susunan Gram Positif 1C3 batang, susunan Gram Positif 24

37 Isolat Bakteri Uji Katalase Morfologi Pembesaran 1000X Keterangan Pewarnaan Gram 1C4 batang, susunan Gram Positif 1C6 batang, susunan Gram positif 2C2 batang, susunan Gram Positif 2C12 batang, susunan Gram Positif 1D1 batang, susunan Gram Positif 25

38 Isolat Bakteri Uji Katalase Morfologi Pembesaran 1000X Keterangan Pewarnaan Gram 1D3 batang, susunan Gram positif 2D41 batang, susunan Gram Positif 2D42 batang, susunan Gram Positif Pertumbuhan pada Suhu 15 C, 37 C dan 45 C Isolat bakteri asam laktat diinokulasikan dalam tabung reaksi yang berisi media de Man Ragosa Sharp Broth (MRSB) yang dilakukan sebanyak 3 ulangan pada masing-masing isolat, kemudian masing-masing tabung reaksi yang sudah diinokulasi kultur diinkubasi pada suhu 15 C, 37 C dan 45 C selama 24 jam. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 4. Hasil penelitian menujukan untuk isolat 1A6, 2A1, 2A2, 2A3, 1B1, 2B2, 1C1, 1C4, 1C6, 2C2, 2C12, 1D1, 1D2, 1D3, 2D2, 2D41, dan 2D42 dapat tumbuh pada suhu 15 C tapi hanya sedikit sekali, yang ditunjukan dengan kekeruhan yang dihasilkan(+), tetapi isolat-isolat ini mampu tumbuh dengan baik pada suhu 37 C dan 45 C terlihat kekeruhannya (+++). Kekeruhan ini merupakan indikator bakteri dapat tumbuh dengan baik atau tidak dalam media MRSB, semakin keruh media 26

39 MRSB yang sudah diinokulasi bakteri maka bakteri tersebut dapat tumbuh dengan baik. Menurut Fardiaz (1992) bakteri ini termasuk ke dalam golongan bakteri mesofil yaitu bakteri yang mampu tumbuh pada suhu minimal C, maksimal pada suhu 45 C dan pertumbuhan optimal pada suhu 37 C. Tabel 4. Karakteristik Pertumbuhan 28 Isolat Bakteri Asam Laktat pada suhu 15 C, 37 C dan 45 C Jenis Isolat Pertumbuhan pada Suhu Bakteri 15 C 37 C 45 C Keterangan 1A1 ( - ) Termofil 1A mesofil 1A mesofil 1A mesofil 1A mesofil 1A mesofil 2A mesofil 2A mesofil 2A mesofil 1B mesofil 1B mesofil 2B mesofil 2B mesofil 2B mesofil 2B mesofil 1C mesofil 1C mesofil 1C mesofil 1C mesofil 2C mesofil 2C mesofil 1D mesofil 1D mesofil 1D mesofil 2D mesofil 2D mesofil 2D mesofil 2D mesofil Keterangan : + = sedikit keruh ; ++ = keruh ; +++ = sangat keruh Thermofil = bakteri yang tumbuh mulai dari suhu 25 C sampai 80 C (Fardiaz, 1992) Mesofil = bakteri yang tumbuh mulai dari suhu 10 C sampai 45 C (Fardiaz, 1992) Isolat 1A4, 1A32, 2B3, 1C3, 2D1 mampu tumbuh pada suhu 15 C dengan agak baik (+) dan tumbuh sangat baik (+++) pada suhu 37 C, pada suhu 45 C bakteri ini dapat tumbuh dengan baik (++). Suhu 37 C merupakan suhu optimum pertumbuhan isolat-isolat ini terlihat dari kekeruhan yang paling keruh pada suhu ini 27

40 dibandingkan suhu yang lainnya. Isolat 1A2, 1A5, 1B2 ini mampu tumbuh dengan baik pada suhu 15 C dan sangat baik tumbuhnya pada suhu 37 C dan 45 C, bakteri ini masih termasuk bakteri mesofilik namun pada suhu rendah bakteri ini pertumbuhannya lebih baik karena gampang beradaptasi. Keterangan : Tingkat Kekeruhan a : tidak keruh (-) b : sedikit keruh (+) c : keruh (++) d : sangat keruh (+++) a b c d Gambar 4. Kekeruhan pada Uji Pertumbuhan BAL pada Suhu Berbeda Isolat bakteri 2B1 dan 2B4 ini mampu tumbuh dengan sangat baik pada semua suhu baik pada suhu 15 C, 37 C maupun 45 C. bakteri ini masih termasuk bakteri mesofilik. Isolat 1A1 tidak dapat tumbuh pada suhu 15 C, hal ini terlihat dengan tidak adanya kekeruhan yang terjadi pada media MRSB yang diinkubasi pada suhu 15 C dan dapat tumbuh dengan sangat baik pada suhu 37 C dan 45 C. Hal ini menyatakan bahwa isolat 1A1 merupakan bakteri yang tergolong kedalam bakteri thermofilik yaitu bakteri yang dapat tumbuh pada suhu minimal 25 C, maksimalnya pada suhu 80 C dan suhu pertumbuhan optimalnya pada suhu 45 C (Fardiaz, 1992). Pertumbuhan pada NaCl 6,5% Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel. 5 yang menunjukkan kemampuan tumbuh 28 isolat BAL yaitu 1A1, 1A4, 1A5, 1A6, 1A32, 2A1, 2A2, 2A3, 1B1, 1B2, 2B1, 2B2, 2B3, 2B4, 1C1, 1C3, 1C4, 1C6, 2C2, 2C12, 1D1, 1D3, 2D2, 2D41 dan 2D42 pada kondisi media tumbuh mengandung NaCl 6,5%, ternyata bakteri-bakteri tersebut mampu bertahan. Hasil ini menyatakan secara statistik tidak berbeda nyata (P>0,05) meskipun dilihat dari nilai selisih antara populasi awal dengan populasi akhir menunjukkan kenaikan 0,7 sampai 2 Log 10 CFU/ml dan ada juga yang mengalami penurunan sekitar 1 Log 10 CFU/ml. Peningkatan dan penurunan yang terjadi sebenarnya cukup membedakan adanya pertumbuhan dan kematian yang 28