KELANGSUNGAN HIDUP Pasteurella multocida SETELAH PENYIMPANAN JANGKA LAMA PADA SUHU KAMAR DAN -15 C

Transkripsi

1 KELANGSUNGAN HIDUP Pasteurella multocida SETELAH PENYIMPANAN JANGKA LAMA PADA SUHU KAMAR DAN 15 C (Survival of Pasteurella multocida after Long Term Storage at Room Temperature and 15 C) SITI CHOTIAH Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor ABSTRACT A wide variety of techniques are used for the preservation of microbes and it may be difficult to choose the most suitable for a particular microbes. The preservation method used should minimize loss of viability during processing and storage so that after preservation, cultures will survive for long periods. Survival of lyophilized Pasteurella multocida after long term storage at room temperature and 15 C have been evaluated for achieving the suitable and efficient monitoring in the microbial germ plasm preservation. A total of 93 lyophilized samples of 19 Pasteurella multocida collection prepared in vaccum glass ampoules, stored for more than 12 years at different temperatures were grown on specific medium and identified for the bacterial species. The results showed that 8 of 12 (66,7%) collections of Pasteurella multocida were still viable to life after storing at 15 C emperature during 15 until 24 years, whereas at room temperature during 12 until 22 years showed 4 of 19 (21,05%) collections were viable. There was an indication that survival of lyophilized Pasteurella multocida after long term stored at 15 C is better than at room temperature. Key Words: Survival, Pasteurella multocida, Storage, Temperature ABSTRAK Banyak teknik telah digunakan untuk preservasi mikroba dan terkadang sulit menentukan teknik yang sesuai dan tepat untuk mikroba tertentu. Metode preservasi yang digunakan harus meminimalkan kehilangan viabilitas selama proses dan penyimpanan, sehingga setelah preservasi kultur akan hidup untuk waktu yang lama. Kelangsungan hidup Pasteurella multocida setelah penyimpanan jangka waktu lama pada suhu kamar dan 15 C telah dievaluasi untuk mendapatkan cara pemantauan yang tepat dan efisien dalam pelestarian plasma nutfah mikroba. Sebanyak 93 sampel biakan kering di dalam kemasan ampul gelas dalam kondisi vakum berasal dari 19 koleksi Pasteurella multocida yang telah disimpan lebih dari 12 tahun pada 2 suhu yang berbeda telah ditumbuhkan dalam medium khusus, kemudian diuji viabilitas, kemurnian dan diidentifikasi sampai spesies. Hasil menunjukkan bahwa 8 dari 12 (66,7%) koleksi biakan Pasteurella multocida masih bertahan hidup setelah disimpan pada suhu 15 C selama 15 sampai 24 tahun, sedangkan pada suhu kamar sebanyak 4 dari 19 (21,05%) koleksi masih bertahan hidup selama 12 sampai 22 tahun. Ini menunjukkan bahwa kelangsungan hidup koleksi biakan Pasteurella multocida lebih lama pada suhu simpan 15 C dibandingkan dengan suhu kamar. Kata Kunci: Kelangsungan Hidup, Pasteurella multocida, Suhu Penyimpanan PENDAHULUAN Berbagai macam metode yang dipakai dalam preservasi mikroba yang dilakukan dalam koleksi kultur adalah metode subculture, drying, freezedrying dan freezing. Akan tetapi tidaklah mudah dalam memilih metode yang terbaik untuk keperluan tertentu. Penentuan teknik pengawetan atau penyimpanan mikroba memerlukan penelitian yang rumit, jangka waktu lama, perlu pemantauan dan dana yang besar. Hal itu berkaitan dengan dua hal penting dari tujuan pemilihan metode pemeliharaan mikroba adalah menghasilkan angka kelangsungan hidup yang maksimal dan menjaga stabilitas sifat genetiknya. 912

2 Menurut SNELL (1991) pemilihan metode preservasi mikroba ditentukan sendiri oleh koleksi kultur masingmasing berdasarkan kemampuan fasilitas yang ada dan dana yang tersedia. Metode freezedrying dipakai dalam konservasi sebagian besar koleksi mikroba di BBalitvet Culture Collection (BCC), termasuk diantaranya adalah koleksi mikroba bakteri Pasteurella multocida. Pasteurella multocida merupakan bakteri patogen pada hewan ternak menyebabkan hemorrhagic septicemia (penyakit ngorok), shipping fever dan atrophic rhinitis, pada unggas menyebabkan fowl cholera (kolera unggas) dan pada kelinci percobaan menyebabkan snauffles (ADLAM dand RUTTER, 1989) Lebih dari 12 tahun yang lalu, telah dilakukan preservasi dengan metode freezedrying menggunakan medium preservan 7,5% glukosa serum (LAPAGE, et al., 1970) terhadap koleksi biakan Pasteurella multocida di BCC. Proses freezedrying menggunakan mesin Edwards EF4 Medulyo freezedrier (Manor Royal, Crawley, West Sussex, U K) dilakukan pada suhu 40 C dengan dua tahapan pengeringan. Pada tahapan pertama menggunakan sentrifuge sampai tekanan mencapai 6,7 mbar, tahapan ini terus berlanjut hingga mencapai tekanan 1,3 x 10 1 mbar. Kemudian koleksi disimpan di dua tempat yang berbeda yaitu pada suhu kamar dan dalam freezer suhu 15 C. Setelah lebih dari 12 tahun dilakukan kontrol mutu (uji viabilitas, kemurnian dan reidentifikasi) terhadap koleksi mikroba yang ada di BCC, diantaranya koleksi Pasteurella multocida. Kelangsungan hidup koleksi Pasteurella multocida setelah penyimpanan jangka waktu lama pada suhu kamar dan 15 C telah dievaluasi untuk mendapatkan cara pemantauan yang tepat dan efisien dalam pelestarian plasma nutfah mikroba. MATERI DAN METODE Biakan Pasteurella multocida Sebanyak 69 sampel biakan plasma nutfah mikroba Pasteurella multocida di dalam kemasan ampul gelas dalam kondisi hampa udara yang berasal dari 19 koleksi yang disimpan pada suhu kamar tanpa pendingin dan 24 sampel yang berasal dari 9 koleksi yang sama dengan sebagian koleksi tersebut tetapi disimpan dalam suhu 15 C, telah digunakan sebagai bahan penelitian. Biakanbiakan mikroba tersebut merupakan koleksi pada BBalitvet Culture Collection (BCC) yang telah disimpan selama lebih dari sepuluh tahun (12 sampai dengan 24 tahun) dengan metode preservasi freeze drying menggunakan medium preservan 7,5% glukosa serum. Sampel diambil secara acak dari masingmasing tanggal proses freeze drying (nomor batch) dari setiap koleksi sebanyak 20% dari stok yang ada di BCC. Uji pertumbuhan dan reidentifikasi Masingmasing sampel ampul dicatat nomor koleksi dan tanggal proses freezedrying (nomor batch). Kondisi fisik ampul diperiksa dan bagian luarnya dibersihkan dengan alkohol 70%. Membuka ampul dilakukan di dalam ruang biohazard, dengan bagian ampul yang terbuka diletakkan pada nyala api, kemudian 0,5 ml medium kaldu brain hart infusion (BHI) dimasukkan kedalam ampul, isi ampul dilarutkan. Suspensi isi ampul dipindahkan ke dalam medium kaldu BHI volume 2 ml yang disiapkan dalam tabung bijou dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama 8 12 jam. Kultur bakteri dalam medium tersebut selanjutnya dibiakkan pada lempeng agar darah yang mengandung 5% darah domba dan diinkubasikan pada suhu 37 C selama jam. Koloni murni yang tumbuh diidentifikasi menurut prosedur BARROW dan FELTHAM (2003) dan CARTER (1973). Identifikasi tahap pertama diuji dengan pewarnaan Gram, pergerakan dalam medium semi solid, pertumbuhan pada medium agar Mc. Conkey pada kondisi aerobik, aktifitas enzim katalase dan oksidase. Tahap kedua dilakukan uji terhadap: reduksi nitrat menjadi nitrit, pembentukan indol, fermentasi glukosa, hidrolisis arginin, aktifitas enzim urease, hidrolisis eskulin, hidrolisis gelatin, aktifitas enzim β galaktosidase, asimilasi glukosa, arabinosa, mannosa, manitol, Nasetilglukosamin, maltosa, potasium glukonat, asam kaprat, asam adipat, asam malat, trisodium sitrat, asam fenil asetat, sitokhrom oksisase. Hasil reaksi dibaca menggunakan API system 913

3 yaitu API 20 NE (Bio Merieux SA, La Balmes Les Grottes, France). HASIL DAN PEMBAHASAN Kelangsungan hidup biakan Pasteurella multocida koleksi BCC dalam bentuk kering setelah penyimpanan jangka lama (12 sampai dengan 22 tahun) pada suhu kamar dipaparkan di dalam Tabel 1. Sebanyak 4 dari 19 (21,05%) koleksi biakan Pasteurella multocida masih tahan hidup setelah disimpan pada suhu kamar tanpa pendingin selama 12 sampai 22 tahun. Empat koleksi tersebut adalah 2 koleksi masih tahan hidup setelah disimpan selama 15 tahun dan 2 koleksi lainnya setelah 17 tahun, dengan prosentase masingmasing 76, 25, 20 dan 25% dari sampel yang diuji. Tabel 1. Kelangsungan hidup biakan Pasteurella multocida koleksi BCC dalam bentuk kering setelah penyimpanan jangka lama pada suhu kamar Asal koleksi INA LN Nomor koleksi (BCC) 0299 Jumlah Jumlah sampel tahan hidup setelah dikonservasi tahun ke: sampel (ampul) Σ % sampel tahan hidup ,6 13, Σ koleksi tahan hidup INA = Indonesia; LN = Luar Negeri 914

4 Dalam konservasi eks situ mikroba akan terjadi kematian selsel selama proses preservasi, dan kemudian akan hilang selama dalam penyimpanan (SNELL, 1991). Penurunan viabilitas Pasteurella multocida pada konservasi eks situ dengan metode freeze drying dalam medium suspensi 7,5% glukosa serum terjadi sebanyak 1,3 x 10 1 CFU/ml, 10 2 CFU/ml dan 8,2x10 2 CFU/ml berturutturut masingmasing karena pengaruh proses, pengaruh penyimpanan selama 1 dan 2 bulan (CHOTIAH, 2006). Koleksi Pasteurella yang ada di National Collection of Type Cultures, Inggris masih tahan hidup sampai 30 tahun penyimpanan dengan metode freeze drying, walaupun sudah tidak terhitung secara logaritma (RUDGE, 1991). Kelangsungan hidup biakan Pasteurella multocida koleksi BCC dalam bentuk kering setelah penyimpanan jangka lama pada suhu 15 C dipaparkan di dalam Tabel 2. Sebanyak 8 dari 12 (66,7%) koleksi biakan Pasteurella multocida masih tahan hidup setelah disimpan pada suhu 15 C selama 15 sampai 24 tahun. Berdasarkan kelompok umur penyimpanan maka kelangsungan hidup koleksi biakan tersebut sebanyak 100, 83,3, 100, 59, 25 dan 0% dari sampel yang diuji masingmasing berturutturut setelah disimpan selama 15, 17, 19, 22 dan 24 tahun. Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa konservasi Pasteurella multocida dengan metode frezze drying memiliki ketahanan hidup lebih lama pada suhu simpan 15 C dibanding dengan pada suhu kamar tanpa pendingin. Sesuai dengan pendapat CARTER (1984) semua Pasteurella tahan hidup selama beberapa tahun setelah frezze drying (lyophilized) menggunakan mediun suspensi konvensional; dalam medium suspensi fibrilasi darah, disimpan pada suhu 40 C sampai 70 C. akan tahan dalam jangka lama; viabilitas bisa tahan sampai waktu tidak terbatas jika disimpan pada suhu 180 C (nitrogen cair). Identifikasi terhadap 8 koleksi Pasteurella multocida menggunakan API system yaitu API 20 NE hasilnya dipaparkan didalam Tabel 3. Sebanyak 5 dari 8 koleksi yang masih berlangsung hidup menunjukkan karakteristik 99,6% Pasteurella multocida. Sedangkan 3 koleksi lainnya menunjukkan karakrter yang sedikit lain yaitu koleksi BCC B2158 dan BCC B2183 dapat memfermentasi glukosa, sedangkan koleksi BCC B0700 tidak memproduksi indol. Tabel 2. Kelangsungan hidup biakan Pasteurella multocida koleksi BCC dalam bentuk kering setelah penyimpanan jangka lama (15 24 tahun) pada suhu 15 C Asal koleksi INA LN Nomor koleksi (BCC B) Jumlah sampel (ampul) Jumlah sampel tahan hidup setelah dikonservasi tahun ke: Σ % sampel tahan hidup , Σ koleksi tahan hidup INA = Indonesia; LN = Luar Negeri 915

5 Tabel 3. Reaksi biokimia dari 8 koleksi Pasteurella multocida yang masih memiliki ketahanan hidup setelah dikonservasi lebih dari 15 tahun Uji Nomor koleksi BCC B Potasium nitrat Ltriptopan Dglukosa Larginin Urea Eskulin feri sitrat Gelatin 4nitrofenilβDglaktopiranosida Dglukosa Larabinosa Dmannosa Dmanitol Nasetilglukosamin Dmaltosa Potasium glukonat Asam kaprat Asam adipat Asam malat Trisodium sitrat Asam fenil asetat Oksidase Profil API 20 NE % ID API 20 NE 96,6 59,6 96,6 96,6 96,6 96,6 47,9 59,6 KESIMPULAN Telah dievaluasi 93 sampel biakan kering di dalam kemasan ampul gelas dalam kondisi vakum berasal dari 19 koleksi Pasteurella multocida yang telah disimpan selama 12 sampai 22 tahun pada suhu kamar dan pada suhu 15 C selama 15 sampai 24 tahun Kelangsungan hidup koleksi biakan Pasteurella multocida dalam konservasi eks situ dengan metode preservasi freeze drying akan lebih lama pada suhu simpan 15 C dibanding dengan suhu kamar. UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Sdr. Agus Wahyudin dan Sdr. Sukatma teknisi Bakteriologi BBalitvet yang telah membantu dalam kegiatan penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA ADLAM, C. and J.M. RUTTER Pasteurella and Pasteurellosis. Academic Press. Ltd London, Englan. 916

6 BARROW, G.I. and R.K.A. FELTHAM Cowan and Steel`S Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3 nd Ed. Cambridge University Press, UK. pp CARTER, G.R Pasteurella. In: Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Volume 1. NOEL R. KRIEG (Ed.) Williams & Wilkins, Baltomore, USA. CARTER, G.R Diagnostic Procedure in Veterinary Microbiology. 2 nd Ed. Charles C. Thomas Publicher, Springfield, Illinois, USA. CHOTIAH, S Pengaruh Proses Freeze Drying dan Penyimpanan Pada Suhu Kamar terhadap Viabilitas dan Patogenisitas Plasma Nutfah Mikroba Pasteurella multocida. Bull. Plasma Nutfah. 12(1): LAPAGE, S.P., JEAN E. SHELTON, T.G. MITCHELL and A.R. MACKENZIE Culture collection and the preservation of bacteria. In: Methods in Microbiology. Volume 3A. Academic Press London and New York. pp RUDGE, R.H Maintenance of Bacteria by Freezedrying. In: Maintenance of Microorganisms and Cultured Cells. KIRSOP, B.E. and A. DOYLE (Eds). Academic Press Limited. pp SNELL, J.J.S General Introduction To Maintenance Methode. In: Maintenance of Microorganisms and Cultured Cells. KIRSOP, B.E. and A. DOYLE (Eds). Academic Press Limited. pp