PENDAHULUAN TINJAUAN PUSTAKA

Transkripsi

1 1 PENDAHULUAN Beberapa probiotik yang umum digunakan berasal dari kelompok bakteri asam laktat (BAL). Probiotik meningkatkan perlawan terhadap bakteri patogen dalam saluran pencernaan melalui senyawa antimikrobial, diantaranya asam organik (laktat, asetat, dan glukoronat), dan hidrogen peroksida. Selain itu juga menghambat pelekatan dari bakteri patogen pada gastrointestinal menuju mukosa usus melalui koloni kompetitif (Toni 2009). Bakteri probiotik juga mampu menghasilkan senyawa mirip antibiotik yang mempunyai pengaruh langsung terhadap bakteri dalam saluran pencernaan (Hilman 2001) yang disebut bakteriosin (Martinez et al 2002). Bakteriosin memiliki kelebihan seperti mempunyai target yang spesifik, rentan terhadap enzim pencernaan proteolitik, memungkinkan untuk dilakukan manipulasi genetik serta aman digunakan (Kalmokoff et al 1996). Lactobacillus plantarum mempunyai kemampuan untuk menghambat mikroorganisme patogen pada bahan pangan dengan daerah penghambatan terbesar dibandingkan dengan bakteri asam laktat lainnya. L. plantarum dapat meningkatkan integritas usus, aktivitas sel-sel usus serta merangsang respon imun (Bixquert 2009). L. plantarum dapat menimbulkan respon proinflamasi untuk mencegah inflamasi dan dapat mendorong respon kekebalan sel yang lebih tinggi dalam epitel usus (Nissen et al 2009). Bakteriosin dari L. plantarum disebut plantaricin. Plantaricin termasuk bakteriosin kelas IIe (bakteriosin 2-peptida) yang mempunyai berat molekul kurang dari 10 kda, tahan panas dan tidak mengandung asam amino lanthionine (Van Belkum & Stiles 2000). Plantaricin memiliki aktivitas antibakteri yang paling besar dibandingkan bakteriosin dari bakteri asam laktat lainnya. Plantaricin ST26MS (2,8 kda) dan ST28MS (5,5 kda) yang diproduksi oleh L. plantarum ST26MS dan ST28MS masing-masing dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram negatif seperti Acinetobacter, E. coli dan Pseudomonas. Plantaricin juga memiliki kemampuan menghambat bakteri Gram positif seperti Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium Perfringens, Bacillus subtilis dan Bacillus cereus (Todorov et al 2004). Penelitian ini bertujuan menguji aktivitas antibakteri dari isolat L. plantarum yang berasal dari buah-buahan tropis serta mengkorelasikan tingkat ekspresi gen pln dengan tingkat penghambatan patogen. Hasil penelitian ini diharapkan dapat mengetahui isolat L. plantarum dengan aktivitas antibakteri dan ekspresi gen pln terbaik sehingga dapat menggantikan peran antibiotik untuk menekan pertumbuhan patogen dalam saluran pencernaan. Hipotesis penelitian ini adalah isolat L. plantarum dari buah-buahan tropis memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen Gram positif dan Gram negatif, aktivitas antibakteri tersebut merupakan korelasi dari ekspresi gen pln. TINJAUAN PUSTAKA Probiotik Probiotik dapat didefinisikan sebagai kultur tunggal atau kultur campuran mikroorganisme hidup yang memiliki pengaruh menguntungkan bagi kesehatan manusia (Fuller 1989). Beberapa bakteri probiotik mampu menghasilkan senyawa mirip antibiotik yang mempunyai pengaruh langsung terhadap bakteri dalam saluran pencernaan (Hilman 2001) yang disebut bakteriosin (Martinez et al 2002). Bakteriosin dari BAL mempunyai aktivitas antibakteri tertentu (Kalmokoff et al 1996). Bakteriosin dapat menjadi alternatif pengganti antibiotik dalam manipulasi populasi mikroba usus. Bakteriosin memiliki kelebihan dibanding antibiotik karena mempunyai target yang spesifik, rentan terhadap pencernaan proteolitik, memungkinkan untuk dilakukan manipulasi genetik serta aman digunakan. Menurut Suskovic (2001), mekanisme kerja probiotik dapat diekspresikan melalui tiga cara, yaitu: menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen pada saluran pencernaan melalui produksi substansi antibakteri (asam laktat, asam asetat, asetaldehida, hidrogen peroksida, dan bakteriosin), persaingan mendapatkan zat makanan dan persaingan reseptor pada epitelium usus; merubah metabolisme mikrobial dengan meningkatkan aktivitas enzim yang bermanfaat seperti galactosidase atau menekan enzim yang tidak bermanfaat seperti gluconidase, glucosidase, nitroreductase; dan merangsang pembentukan kekebalan tubuh. Lactobacillus plantarum Bakteri L. plantarum ini dapat diklasifikasikan ke dalam domain Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo Lactobacillales, famili Lactobacillaceae,

2 2 genus Lactobacillus, dan spesies Lactobacillus plantarum (NCBI 2010). L. plantarum merupakan bakteri Gram positif yang ditemukan di susu, daging, sayuran fermentasi dan saluran pencernaan manusia. L. plantarum merupakan bakteri anaerobik fakultatif yang dapat tumbuh baik dalam kondisi aerob maupun anaerob. Dalam keadaan aerob L. plantarum dapat mengkonversi oksigen menjadi peroksida. Dalam keadaan anaerob L. plantarum mampu melakukan fermentasi dengan mengubah gula menjadi asam laktat atau alkohol (heterofermentatif). Asam laktat yang dihasilkan merupakan kombinasi dari isomer D- dan L. Bakteri ini juga menghasilkan peptida anti-mikroba dan exopolysaccharides (De Vries et al 2006). L. plantarum mampu bertahan pada ph rendah dari lambung dan usus, mampu menolak efek asam empedu dan dapat berkolonisasi di saluran pencernaan dengan berikatan pada mukosa usus dan kolon. L. plantarum telah diuji dapat mengurangi rasa nyeri dan kembung (IGEM 2009). L. plantarum dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen dan bakteri pembusuk karena kemampuannya untuk menghasilkan asam laktat dan menurunkan ph substrat (Suriawiria 1995). Bakteri ini juga mempunyai kemampuan untuk menghasilkan bakteriosin yang berfungsi sebagai zat antibiotik (Jenie & Shinta 1995). L. plantarum dapat meningkatkan integritas usus, aktivitas sel-sel usus serta merangsang respon imun (Bixquert 2009). L. Plantarum dapat menimbulkan respon pro-inflamasi dan dapat mendorong respon kekebalan sel yang lebih tinggi dalam epitel usus (Nissen et al 2009). Menurut Lonnermark et al (2009), asupan L.plantarum secara in vivo dapat mengurangi gejala gastrointestinal tertentu dan dapat meningkatkan keanekaragaman bakteri baik dalam usus besar. Selain itu, L. plantarum dapat melindungi sel epitel dari kerusakan yang ditimbulkan oleh Escherichia coli (Hougee et al 2009). Bentuk dari L. plantarum dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1 Lactobacillus plantarum (IGEM 2009). Bakteriosin Bakteriosin adalah peptida yang memiliki aktivitas antibakteri, disintesis secara ribosomal oleh sejumlah bakteri (Martirani 2002) serta memiliki pengaruh bakterisidal dan bakteriostatik terhadap bakteri yang mempunyai hubungan dekat dengan bakteri penghasilnya (Ko & Ahn 2000). Bakteriosin Gram positif mengandung asam amino dengan aktivitas yang bervariasi dalam melawan bakteri Gram positif lain (Jack et al 1995) bahkan ada juga yang dapat bereaksi dengan bakteri Gram negatif. Menurut Kalmokoff et al (1999), bakteriosin yang dihasilkan bakteri Gram positif terbagi menjadi dua kelompok besar yaitu lantibiotics dan non-lantibiotics. Bakteriosin berdasarkan sifat kimia dan fungsinya dibagi menjadi empat kelompok yaitu, bakteriosin kelas I: Lantibiotics, peptida molekul kecil (berat molekul < dari 5 kda) mengandung lanthionine dan β-methyl lanthionine; bakteriosin kelas II: peptida yang stabil terhadap panas, berat molekul lebih kecil dari 10 kda dan tidak terjadi perubahan asam amino, bakteriosin kelas III: protein tidak stabil terhadap panas dengan molekul lebih besar dari 30 kda, dan bakteriosin kelas IV: glikoprotein dan lipoprotein (Oscarriz & Pisabarro 2001). Bakteriosin kelompok non-lantibiotics dapat dikelompokkan berdasarkan kandungan sistein atau jembatan disulfida menjadi tiga kelompok, yaitu cystibiotics (mengandung dua atau lebih asam amino sistein untuk jembatan disulfida); thiolbiotics (satu sistein) dan tanpa sistein (Jack et al 1995). Bakteriosin kelas II, mempunyai berat molekul kurang dari 10 kda, tahan panas dan tidak mengandung asam amino lanthionine. Van Belkum & Stiles (2000) membagi bakteriosin kelas II menjadi 6 subkelas, yaitu IIa: cystibiotics dengan dua jembatan disulfida yang dihasilkan dari 4 residu sistein (Pediocin PA-1/AcH, Enterocin A dan Divercin V41); IIb: cystibiotics dengan satu jembatan disulfida dari 2 residu sistein pada N-section peptida (Leucocin A); IIc: cystibiotics dengan satu jembatan disulfida yang menjangkau N- dan C- section peptida (Carnobacteriocin A dan Enterocin B); IId: peptida yang mengandung satu (thiolbiotics) atau tanpa residu sistein (Lactococcin A dan B); IIe: bakteriosin 2- peptida (Thermophilin 13, Lactacin F, Plantaricin S, A, EF dan JK, Lactococcin G dan M) dan IIf: bakteriosin khas (Enterocin 4). Mekanisme kerja bakteriosin dalam melawan bakteri lain secara umum dengan menyerang membran sitoplasma melalui

3 3 pembentukan pori membran sitoplasma (Sablon et al 2000) dan menembus membran sel sehingga meningkatkan permeabilitas membran sitoplasma (Jack et al 1995) atau menghambat pembetukan septum (Martinez et al 2002). Bakteriosin dalam pori harus berinteraksi dengan membran sitoplasma sel target. Lipid membran sitoplasma yang bermuatan negatif merupakan reseptor utama bakteriosin dalam proses pembentukan pori (Moll et al 1999). Interaksi elektrostatik bakteriosin yang bermuatan positif bersifat hidrofobik dengan gugus fosfat bermuatan negatif pada membran sel target yang merupakan tahap awal pengikatan bakteriosin dengan membran target (Cleveland 2001). Bagian hidrofobik bakteriosin masuk ke dalam membran membentuk pori. Konduktivitas dan stabilitas pori pada bakteriosin kelas II reseptor membran target bekerja terhadap spesifikasi tertentu ( Chen et al 2006). Proses penembusan membran fosfolipid oleh peptida membran aktif umumnya melalui dua mekanisme, yaitu model barrel-stave dan model wedge (Zhao 2003). Pada model barrelstave, peptida menghadap hampir tegak lurus terhadap membran, kemudian masuk dan membuat saluran ion sepanjang membran yang diikuti dengan pengikatan monomer tambahan pembentuk pori (Cleveland 2001). Pada model wedge, peptida berikatan dengan permukaan membran, jika konsentrasi ambang batas monomer peptida tercapai, membran dapat ditembus dan pori sementara terbentuk (Zhao 2003). Gambar 2(a) menunjukan mekanisme penembusan membran sel target dengan model barrel-stave oleh peptida antibakteri. (A) peptida antibakteri membentuk stuktur α-heliks saat kontak dengan membran target. (B) daerah hidrofobik (berwarna ungu) berinteraksi dengan permukaan membran, dimana daerah hidrofilik (berwarna biru) berhadapan dengan peptida. (C) saat konsentrasi batas ambang peptida tercapai, peptida berasosiasi dan membentuk pori trans-membran dengan permukaan hidrofobik menghadap keluar dan permukaan hidrofilik menghadap kedalam, membuat pori aqueous yang membantu penembusan (Jørgenrud 2009). Gambar 2(b) menunjukan mekanisme penembusan membran sel target dengan model wadge oleh peptida antibakteri. (A) peptida antibakteri yang tidak berstruktur membentuk formasi α-heliks saat kontak dengan lingkungan membran target. (B) peptida antibakteri berikatan pada membran dengan daerah hidrofobik (warna ungu) berinteraksi dengan phospholipid bilayer dan bagian hidrofilik (warna biru) menghadap permukaan peptida. (C) konsentrasi lokal yang tinggi dari peptida menjadi awal permeabilitas membran target (Jørgenrud 2009). A A (a) (b) Gambar 2 Mekanisme penembusan membran dengan metode (a) barrel-stave; (b) wedge (Jørgenrud 2009). Plantaricin Plantaricin termasuk bakteriosin kelas II (bakteriosin 2-peptida) yang mempunyai berat molekul kurang dari 10 kda, tahan panas dan tidak mengandung asam amino lanthionine (Van Belkum & Stiles 2000). Menurut Rekhif et al (1995), aktivitas plantaricin sangat stabil dalam kondisi penyimpanan pada suhu kamar selama 5 hari, penyimpanan pada suhu 4ºC dan -20ºC, dan pemanasan (100ºC selama 10 menit atau 56ºC selama 30 menit). Plantaricin umumnya dikodekan menurut strain tunggal serta letak lokus dalam kromosom. Plantaricin memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan patogen terutama bakteri Gram positif seperti L. monocytogenes, S. aureus, C. Perfringens, B. subtilis, dan B. cereus. Bakteriosin dari BAL kurang efisien untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen Gram negatif (E. coli, Pseudomonas dan Salmonella) karena membran luar pada bakteri Gram negatif menghalangi kemampuan bakteriosin (Stevens et al 1991). Namun, menurut Todorov & Dicks (2007), beberapa bakteriosin yang dihasilkan oleh L. plantarum (plantaricin) memiliki kemampuan untuk menghambat bakteri Gram negatif. Plantaricin ST26MS (2,8 kda) dan ST28MS (5,5 kda) yang diproduksi oleh L. plantarum ST26MS

4 4 dan ST28MS masing-masing dapat menghambat pertumbuhan bakteri Acinetobacter, E coli dan Pseudomonas. Plantacin AMA-K (2,9 kda) yang diproduksi oleh L. plantarum AMA-K dapat menghambat E. coli. Plantaricin A (plna) yang diproduksi oleh L. plantarum merupakan suatu peptida feromon. Sisi membran feromon kationik memiliki aktivitas antimikrobial penembusan pori yang diekspor ke luar sel melalui mekanisme sekresi bakteriosin yang secara khusus menjadikan bakteriosin sebagai sekuen utama dalam prekursor peptida feromon. PlnA bertindak sebagai prekursor feromon yang berinteraksi dengan asosiasi membran dari tiga komponen sistem pengatur protein histidin kinase sehingga memicu protein kinase untuk memfosforilasi dua sistem pengatur, yang kemudian akan mengaktifkan gen yang mengkode bakteriosin dua peptida seperti plantaricin E/F dan J/K (Kristiansen et al 2005). Jalur biosintesis plantaricin dapat dilihat pada Gambar 3 dan struktur tiga dimensi plna dapat dilihat pada Gambar 4(a) sedangkan untuk plnf pada Gambar 4(b). Terdapat empat operon induksi-plna pada L. plantarum C11. Dua dari operon induksi plna, plnefi dan plnjklr mengkode dua bakteriosin dua peptida (plantaricin EF dan plantaricin JK) dan mereka mengkognasi protein imunitas (plantaricin I dan plantaricin L). Operon induksi-plna yang ketiga adalah plnmnop yang mengkode bakteriosin fungsional (plnn) dan protein imunitas (plnm dan plnp), tapi plnn tidak menunjukkan aktivitas bakterisidal melawan indikator strain. Operon induksi-plna yang keempat yaitu plnghstuv mengkode transporter ABC (plng) dan protein akses (plnh) yang menyangkut dalam proses transport dari doubleglycine-leader dengan tipe pre-peptida. Orf1 menunjukkan tidak adanya kesamaan dengan protein lain (Gambar 5). Gambar 5 Susunan Operon dari L. plantarum C11 (Jørgenrud 2009). Gambar 3 Jalur biosintesis bakteriosin dua peptida(jørgenrud 2009). N-term a C-term Operon bakteriosin Operon transport Operon pengatur C-term Pengaktivan transkripsi Gambar 4 Struktur tiga dimensi dari (a) plna dan (b) plnf (Jørgenrud 2009). b N-term Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) adalah salah satu teknik PCR yang mampu mengamplifikasi sekuen yang telah diketahui dari sel atau jaringan dan hanya terdapat dalam jumlah sedikit (Yowono 2006). Reaksi PCR dilakukan dengan melakukan transkripsi balik (reverse transcription) terhadap molekul untuk diperoleh molekul cdna (complementary DNA). Pada proses ini primer oligo-dt akan menempel pada bagian poli-a m di ujung 5. Selanjutnya terjadi pembentukan utas pertama dan dilakukan penambahan RNase untuk menyingkirkan, sehingga hasil yang diperoleh adalah utas tunggal cdna. Molekul cdna tersebut akan digunakan sebagai cetakan untuk proses PCR selanjutnya. Salah satu keuntungan penggunaan RT-PCR adalah kemampuan mengidentifikasi m transkrip pada level rendah dengan sensitifitas yang tinggi. Reaksi PCR memerlukan enzim reverse transcriptase untuk mensintesis m menjadi cdna melalui proses katalisis. Molekul cdna yang disintesis bersifat komplementer terhadap cetakan (Yowono 2006). Mekanisme RT-PCR dapat dilihat pada Gambar 6.

5 5 SIKLUS SELANJUTNYA DNA TERPISAH PENEMPELAN PRIMER sekuen 5 - TGA TCC AAT CGG CAG GCC CAA-3 dengan nilai %GC sebesar 57.1% dan nilai (Tm) sebesar 64.5 o C Ekson 1 Ekson 1 Ekson 2 Reverse Transkriptase DNA Primer 1 PEMANJANGAN DNA Primer 2 PRIMER R PRIMER F Ekson 2 se H Taq DNA polimerase Gambar 6 Mekanisme RT-PCR (Sellner & Turbett 1998). Primer yang digunakan pada proses PCR mempunyai ciri-ciri yaitu mempunyai panjang sekitar nukleotida yang spesifik terhadap DNA target, mengandung jumlah yang sama dari tiap nukleotida, mencegah sekuen yang sama karena akan menyebabkan Slipping dari primer di template, menghindarkan dari tiga atau lebih guanin atau sitosin di akhir 3 karena dapat menyebabkan Mispriming, dan tidak mengandung sekuen yang akan menyebabkan basa berpasangan pada dirinya sendiri karena hal ini akan menyebabkan terjadinya primer dimer (Mc Pherson & Moller 2006). Primer yang digunakan adalah primer 16s memiliki sekuen untuk forward 5 - CAA GCC ACC ATT CAA GGT TT-3 dengan nilai melting temperature (Tm) sebesar 44.6 o C dan %GC sebesar 45.0%, untuk reverse memiliki sekuen 5 - CCC TAC TGA TCC CGC AAT TA-3 dengan nilai (Tm) 46.7 o C dan %GC sebesar 50.0%. Primer plna memiliki memiliki sekuen untuk forward 5 - GAA AAT TCA AAT TAA AGG TAT GAA GCA-3 dengan nilai %GC sebesar 25.9% dan nilai (Tm) sebesar 57.0 o C, untuk reverse memiliki sekuen 5 - ATT GCA GTT GCC CCC ATC-3 dengan nilai %GC sebesar 55.6% dan nilai (Tm) sebesar 59.9 o C. Primer plnf memiliki memiliki sekuen untuk forward 5 - TTC CAT GCC TAT AGC GCG CGT-3 dengan nilai %GC sebesar 59.1% dan nilai (Tm) sebesar 66.4 o C, untuk reverse memiliki BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk penelitian ini antara lain kultur bakteri L. plantarum yang berasal dari buah-buahan tropis (Tabel 1), bakteri uji E. coli; Salmonella thypimurium; Pseudomonas floresense (Gram negatif) dan S. aureus; B. cereus (Gram positif), media GYP (Glucose Yeast peptone), medium LB (Luria Bertani), kalsium asetat, kloroform, fenol, etanol, lisozim 5mg/mL, SDS 10%, kloroform, isopropanol, diethylphyrocarbonate (DEPC) 0.1%, etanol 96%, EDTA, primer plna; plnf dan 16s forward dan reverse, deoxyribonucleoside triphosphate (dntp) mix, Taq mix, 2% gel agarosa, dan ethidium bromide (EtBr). Tabel 1 Isolat L. plantarum Asal Isolat Kode Isolat Terong belanda TB(CK) TB(NK) TB(P) Manggis Bst 2 Bst 6 Markisa PSM b5 Mar A2 Mar D2 Mangga kweni Mkw 2 Mkw 7 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain Refrigerator Microsentrifuge (Hettich), Water Bath, Laminar Air Flow (Vision), PCR Gradient (Takara), Spectrophotometer (Bio-Rad), mikropipet (Eppendorf), Hot Plate (Thermolyne), Touch Mixer (Thermolyne), elektroforesis (Bio-Rad), densitograf CS Analyzer, tabung mikrosentrifus 2 ml, neraca analitik, autoklaf (Hirayama), kamera digital, tabung mikrosentrifus 1.5 ml, inkubator, bunsen, pipet volumetrik, bulb, gelas ukur, cawan petri, jarum ose, tabung reaksi, rak tabung reaksi, sudip, gelas pengaduk, dan micro well. Metode Penelitian Kultur Lactobacillus plantarum Sebanyak sepuluh isolat L. plantarum dibiakkan di dalam media selektif GYP dengan komposisi sebagai berikut: 10 g glukosa, 10 g yeast ekstract, 5 g tripton, 2 g beef extract, 1.4 g Na-asetat.3H2O, 5 ml salt solution (0.1 g