MATERI DAN METODE. Prosedur

Transkripsi

1 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Pengolahan Susu, Bagian Teknologi Hasil Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor dan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Departemen Pertanian. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2012 hingga Juni Materi Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu whey yang berasal dari sisa pengolahan keju Gauda yang sudah dievaporasi. Daun cincau hijau dan hitam, bulk kefir koleksi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Kultur starter probiotik berupa Lactobacillus acidophilus RRM-01, media agar berupa deman s Rogosa Sharpe Agar (MRSA), deman s Rogosa Sharpe Broth (MRSB), Buffer Peptone Water (BPW), akuades, yodium, alkohol, safranin, lugol, kristal violet, H 2 O 2, susu skim, NaOH 0,1 N, fenolptalein, selen, H 2 SO 4, HCl 0,01 N, petroleum eter, etanol 95 % dan aseton. Alat Penelitian ini menggunakan beberapa peralatan. Peralatan yang digunakan antara lain tabung reaksi, rak tabung reaksi, autoclave, inkubator, laminar air flow, pembakar bunsen, mikropipet, magnetic stirrer, vortex mixer, refrigerator, mikroskop, objek glass, cawan petri, kompor, panci, pengaduk kayu, termometer, labu erlenmeyer, ph meter, blender, kertas saring biasa dan kertas saring Whatman 41. Prosedur Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan meliputi persiapan kultur starter yang terdiri atas pemeriksaan morfologi dan viabilitas kultur starter. Analisis whey konsentrasi juga

2 dilakukan untuk mengetahui kelayakannya sebagai bahan baku pembuatan minuman whey fermentasi probiotik dan pembuatan ekstrak cincau hijau dan hitam. Pemeriksaan Kemurnian Kultur Starter (Pelczar dan Chan, 2008). Teknik pengujian kemurnian kultur starter meliputi pengujian morfologi dan uji katalase. Pengujian kultur starter dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dilakukan pada preparat bakteri yang telah difiksasi pada gelas objek lalu ditetesi secara berurutan dengan kristal violet ungu, kemudian larutan yodium, alkohol (bahan pemucat) dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai dimana setiap pergantian bahan dibilas dengan akuades. Bakteri yang telah diwarnai dicuci dari sisa pewarna dan dikeringkan, kemudian diamati dengan mikroskop pada pembesaran 100X. Bakteri yang diwarnai dengan metode ini dapat dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif yang mampu mempertahankan zat pewarna ungu kristal sehingga akan tampak ungu tua. Kelompok yang lain yaitu bakteri gram negatif yang akan kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin sehingga akan tampak berwarna merah. Pengujian katalase dilakukan dengan cara preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek ditetesi dengan satu tetes H 2 O 2. Bakteri bersifat katalase positif bila penambahan H 2 O 2 menghasilkan gelembung udara (O 2 ) yang merupakan hasil reaksi sebagai berikut : H 2 O 2 + senyawa organik senyawa organik + H 2 O + ½ O 2 Perbanyakan dan Pemeriksaan Viabilitas Kultur Starter. Perbanyakan kultur starter meliputi tahapan persiapan media tumbuh kultur starter berupa susu skim. Susu skim didistribusikan dalam tabung reaksi sebanyak 9 ml lalu disterilisasi dalam autoklaf dengan suhu 115 ºC selama 3 menit. Kultur starter diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam susu skim yang sudah diturunkan suhunya hingga menjadi 40 ºC. Inkubasi kultur starter dilakukan pada suhu 37 ºC selama 18 jam. Kultur disimpan pada suhu 4±1 ºC sebelum digunakan. Analisis Whey sebagai Bahan Baku Minuman Whey Fermentasi Probiotik Cincau (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Whey yang digunakan merupakan 15

3 whey yang telah dievaporasi dengan cara dipanaskan dalam evaporator dengan suhu 60 ºC hingga volumenya menjadi satu per tiga volume awalnya. Whey diuji karakteristik fisik dan kimianya yang meliputi ph, TAT, viskositas, kadar air, abu, protein, lemak, serat dan kandungan laktosa. Analisis Kadar Laktosa Whey Terkonsentrasi (Teles et al., 1978 yang Dimodifikasi). Whey terkonsentrasi sebanyak 0,2 ml diambil dan ditambahkan H 2 O hingga menjadi 10 ml (pengenceran 50 kali), kemudian diaduk hingga homogen. Tabung reaksi disiapkan untuk sentrifus, kemudian dilabel untuk blanko, standar dan sampel. Tabung blanko diisi dengan 2,5 ml akuades, tabung standar diisi dengan 2,5 ml laktosa dan tabung sampel diisi dengan 2,5 ml sampel yang telah diencerkan, kemudian ditambahkan 0,2 ml zink sulfat 5% dan 0,2 ml barium hydroxide 4,5% (setelah penambahan barium hydroxide warna larutan akan menjadi keruh), kemudian disentrifus pada 1000 rpm selama satu menit sehingga terbentuk endapan putih dan supernatan. Sebanyak 1 ml supernatan diambil, dipindahkan ke dalam tabung dengan volume ± 15 ml, lalu ditambahkan 2,5 ml reagen Teles (warna larutan menjadi merah lembayung, tetapi belum tampak perbedaan warna antar tabung), kemudian ditutup rapat tabung dengan karet penutup tabung. Tabung direndam sedalam 4-6 cm pada air yang mendidih selama 6 menit (terjadi perbedaan warna antar tabung sampel dengan konsentrasi laktosa yang berbeda, kandungan yang lebih tinggi akan berwarna lebih gelap), kemudian segera didinginkan di bawah air kran. Tabung yang sudah dingin lalu ditambahkan H 2 O hingga larutan menjadi 12,5 ml, lalu dibalik-balikkan 5-10 kali untuk menghomogenkannya. Absorbansi dibaca pada 520 nm dengan spektrofotometer. Kadar laktosa whey dihitung dengan menggunakan rumus : Laktosa (mg/ml) = x 50 Ekstraksi Daun Cincau (Amirdivani dan Baba, 2011 yang Dimodifikasi). Daun cincau yang akan diekstraksi dibuat menjadi bubuk terlebih dahulu. Pembuatan bubuk cincau ini diawali dengan membersihkan daun cincau segar dengan air mengalir, lalu ditiriskan untuk membuang sisa air pencucian. Daun cincau tersebut lalu dikeringkan dengan oven suhu 50 ºC selama 18 jam. Daun yang sudah kering lalu digiling dengan blender hingga menjadi bubuk. Bubuk cincau ini selanjutnya 16

4 dilarutkan dengan air destilasi (dh 2 O) steril dengan rasio 1:20. Campuran kemudian diekstraksi selama 24 jam di waterbath dengan suhu 70 ºC. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan kertas saring biasa. Penyaringan dilakukan kembali dengan kertas saring whatman 41 untuk mendapatkan ekstrak yang bening. Ekstrak disimpan pada suhu 4 ºC sebelum digunakan. Penelitian Utama Penelitian utama meliputi pembuatan minuman whey fermentasi probiotik dengan penambahan esktrak cincau, analisis fisik, kimia dan mikrobiologi. Penilaian organoleptik yaitu mutu hedonik juga dilakukan untuk mengetahui penerimaan konsumen terhadap produk minuman whey fermentasi probiotik cincau. Penentuan formulasi terbaik melalui perangkingan berdasarkan kadar serat pangan, jumlah bakteri asam laktat dan karakteristik organoleptik juga dilakukan untuk mendapatkan produk terbaik dari ketiga sampel yang diujikan Pembuatan Minuman Whey Probiotik dengan Penambahan Ekstrak Cincau (Athanasiadis et al., 2004 yang Dimodifikasi). Diagram alir pembuatan minuman whey probiotik cincau ditampilkan pada Gambar 5. Whey + ekstrak cincau (10%) Pasteurisasi (T = 90 ºC; t = 15 detik) Penurunan suhu hingga 27 ºC Inokulasi 5% kultur starter (3% La, 2% Bulk kefir) Inkubasi (T = 27 ºC, t = 20 jam) Penyimpanan (T= 4 ºC, t = 24 jam) Minuman whey probiotik cincau 17

5 Gambar 5. Diagram Alir Pembuatan Minuman Whey Fermentasi Probiotik Cincau Whey konsentrasi ditambahkan ekstrak cincau sebanyak 10%, lalu dipasteurisasi pada suhu 90 ºC selama 15 detik, kemudian diturunkan suhunya menjadi ± 27 ºC. Whey konsentrasi selanjutnya dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril sebanyak 300 ml, lalu diinokulasi dengan 5% kultur starter yang terdiri atas 2% bulk kefir dan 3% kultur starter Lactobacilus acidophilus secara aseptik. Campuran dihomogenkan sebelum diinkubasi pada suhu ruang (27±1 ºC) hingga dicapai ph 4,5 (20 jam). Kefir whey selanjutnya disimpan selama 24 jam pada suhu 4 ºC sebelum dilakukan pengujian selanjutnya. Viskositas (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Viskositas diukur menggunakan viskometer. Sampel minuman whey fermentasi probiotik cincau sebanyak 100 ml dimasukkan ke dalam bejana pemutar dari viskotester. Bejana dibiarkan berputar selama beberapa saat hingga jarum skala pada viskotester berhenti pada skala tertentu. Skala yang terbaca menunjukkan viskositas dari sampel dengan satuan viskositas adalah dpa.s. Nilai ph (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Sampel minuman whey fermentasi probiotik cincau sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam wadah. ph meter dinyalakan dan dibiarkan hingga stabil. Kalibrasi ph meter pada larutan buffer ph 7, lalu ke larutan buffer dengan ph 4, selanjutnya elektroda dari ph meter tersebut dibilas dengan aquadest dan dikeringkan. Elektroda dicelupkan ke dalam larutan kefir whey probiotik dan nilai ph didapatkan setelah angka pada ph meter tersebut stabil. Total Asam Tertitrasi (TAT) (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Perhitungan jumlah asam dihitung sebagai % asam laktat. Sampel diambil sebanyak 10 ml lalu ditambahkan 2-3 tetes indikator pp dan dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda pertama yang tidak berubah bila dikocok. Perhitungan jumlah asam ini dilakukan dengan cara sebagai berikut : Jumlah asam (% asam laktat) = x 100 % Keterangan : N = Normalitas larutan NaOH 18

6 V1 V2 = Volume sampel (ml) =Volume larutan NaOH (ml) Kadar Air (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Sampel ditimbang sebanyak 2 g dan dimasukkan dalam wadah bertutup yang sudah diketahui bobotnya. Sampel tersebut lalu dimasukkan ke dalam oven 105 ºC selama 18 jam, kemudian sampel dikeluarkan dari oven dan didinginkan dalam eksikator. Sampel yang sudah dingin lalu ditimbang hingga didapatkan berat yang stabil. Kadar air sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut: Kadar Abu (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Cawan dipanaskan dalam tanur selama lebih kurang satu jam pada suhu (525 ± 5) ºC lalu didinginkan dalam desikator selama 45 menit kemudian ditimbang dengan neraca analitik (W 0 ). Sampel minuman whey fermentasi probiotik ditimbang sebanyak 2-3 gram lalu dimasukkan ke dalam cawan porselen dan ditimbang (W 1 ). Cawan yang berisi sampel tersebut dipanaskan dalam oven pada suhu (100 ± 2) ºC sampai H 2 O hilang. Cawan yang berisi sampel lalu ditempatkan dalam tanur pada suhu (525 ± 5) ºC sampai terbentuk abu berwarna putih. Air ditambahkan ke dalam abu, dikeringkan dalam penangas uap kemudian dilanjutkan pada pemanas listrik dan diabukan kembali pada suhu (525 ± 5) ºC sampai mencapai berat yang tetap. Cawan yang berisi sampel lalu dipindahkan ke dalam desikator dan didinginkan selama 45 menit kemudian ditimbang (W 2 ). Persentase kadar abu dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Kadar abu (%) = x 100% Keterangan: W 0 W 1 W = Bobot cawan kosong (gram) = Bobot cawan dan contoh sebelum dikeringkan (gram) = Bobot cawan dan contoh setelah dikeringkan (gram) Kadar Protein (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Analisis kadar protein menggunakan metode semimikro kjeldahl. Sampel minuman whey fermentasi 19

7 probiotik sebanyak 0,51 gram dicampurkan dengan selen 2 gram dan 25 ml larutan H 2 SO 4 pekat lalu dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml. Labu tersebut lalu dipanaskan dengan pemanas listrik dengan pengaduk otomatis magnetic stirrer selama 2 jam atau hingga mendidih dan larutan menjadi jernih kehijaun. Larutan dibiarkan dingin, kemudian diencerkan dan dimasukkan ke dalam gelas ukur 100 ml. Larutan sampel tersebut lalu dipindahkan dengan pipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam alat penyuling, ditambahkan 5 ml NaOH 30% dan beberapa tetes indikator fenolptalein (pp). Larutan tersebut disuling selama 10 menit dan digunakan 10 ml asam borat 2% yang sudah dicampur dengan indikator. Ujung pendingin dibilas dengan air suling. Destilat dititrasi dengan HCl 0,01 N. Prosedur yang sama dilakukan pada 5 ml aquadest sebagai blanko/kontrol. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan cara : Kadar Protein (%) = Keterangan : V 1 V 2 w N fp = Volume HCl 0,001 N yang dipergunakan untuk penitraan contoh (ml) = Volume HCl yang dipergunakan untuk penitraan blanko (ml) = Bobot sampel (g) = Normalitas HCl = Faktor pengencer Kadar Lemak (Badan Standarisasi Nasional, 1992). Sampel minuman whey fermentasi probiotik sebanyak 1-2 gram (W) dimasukkan ke dalam labu ekstraksi lalu ditambahkan 10 ml air suling, diaduk hingga membentuk pasta dan dipanaskan. Sebanyak 1 ml amonium hidroksida pekat ditambahkan, dipanaskan dalam penangas air pada suhu 60 ºC 70 ºC selama 15 menit kemudian diaduk beberapa kali dan didinginkan. Tiga tetes indikator pp dan 10 ml alkohol 95% ditambahkan ke dalam labu, lalu ditutup dan diaduk selama 15 detik. Pada ekstraksi pertama, tambahkan 25 ml etil eter, labu ekstraksi ditutup dan dikocok dengan kencang selama 1 menit. Sebanyak 25 ml petrolium eter ditambahkan lalu tutup labu ekstraksi dan dikocok dengan kencang selama 1 menit. Labu tersebut lalu disentrifuse pada 600 rpm selama 30 detik sehingga terjadi pemisahan fase air (bright pink) dan eter dengan 20

8 jelas. Lapisan eter dituangkan dengan hati-hati ke dalam labu lemak atau pinggan aluminium kosong yang telah diketahui bobotnya (W 0 ). Lapisan air selanjutnya digunakan untuk ekstraksi berikutnya. Ekstraksi dilakukan hingga 3 kali dengan menambahkan 5 ml alkohol 95%, 15 ml etil eter dan 15 ml petroleum eter pada ekstraksi kedua dan ketiga. Pelarut diuapkan di atas penangas air dan dikeringkan labu lemak/pinggan aluminium yang berisi ekstrak lemak dalam oven pada suhu 100 ± 2 ºC selama 30 menit. Labu lemak berisi sampel tersebut lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang hingga bobot tetap (W 1 ). Kadar lemak dihitung dengan rumus: Keterangan : W = bobot sampel (gram) W 0 W 1 = bobot labu lemak kosong (gram) = bobot labu lemak kosong dan lemak (gram) Analisis Serat Pangan atau Dietary Fiber (Sulaeman et al., 1989). Sampel dihomogenisasi dan diliofilisasi. Sampel digiling hingga lolos saringan 0,3 mm. Sampel diekstraksi lemaknya dengan petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit (40 ml petroleum eter/g sampel). Sampel sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan 25 ml 0,1 M buffer Na 3 PO 4 ph 6, kemudian diaduk. Sebanyak 0,1 ml enzim termamyl ditambahkan dan labu erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil kemudian sampel dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 15 menit di dalam penangas air. Setelah dingin ditambahkan 20 ml air destilata dan ph diatur menjadi 1,5 dengan menambahkan HCl. Pepsin sebanyak 100 mg ditambahkan, erlenmeyer ditutup kembali dengan aluminium foil, kemudian diinkubasi pada suhu 40 ºC selama 60 menit di dalam penangas air. Setelah dingin ditambahkan 20 ml aquadestilata dan atur ph menjadi 4,5 dengan menambahkan HCl. Sampel disaring menggunakan crusible (porositi 2) yang telah diketahui beratnya dan mengandung 0,5 celite kering. Perhitungan serat yang tidak larut (residu) dilakukan sebagai berikut : Sampel dicuci dengan 10 ml air destilata sebanyak dua kali. Sampel dicuci dengan 10 ml 21

9 etanol 95% dan 10 ml aseton masing-masing sebanyak dua kali. Sampel dikeringkan pada suhu 105 ºC selama 24 jam (sampai tercapai berat konstan), setelah dingin lalu ditimbang (D 1 ). Sampel diabukan pada suhu 550 ºC selama 5 jam, setelah dingin ditimbang (I 1 ). Perhitungan serat yang larut (filtrat) dilakukan sebagai berikut: volume filtrat diatur sebanyak 100 ml, etanol hangat (60 ºC) 95% sebanyak 400 ml ditambahkan dan dibiarkan hingga mengendap (sekitar satu jam). Filtrat disaring dengan crusible (porositi 2) yang telah diketahui beratnya dan mengandung 0,5 celite kering, kemudian dicuci dengan 10 ml etanol 78%, 10% etanol 95% dan 10 ml aseton masing-masing sebanyak dua kali. Sampel dikeringkan pada suhu 105 ºC selama 24 jam (sampai tercapai berat konstan), setelah dingin ditimbang (D 2 ). Sampel diabukan pada suhu 550 ºC selama 5 jam, setelah dingin ditimbang (I 2 ). Penentuan blanko dilakukan dengan cara prosedur seperti penentuan serat pangan, tetapi tanpa sampel. Nilai blanko sewaktu-waktu harus dicek dan juga apabila menggunakan enzim dari batch yang berbeda. Total serat pangan dapat dilakukan dengan menjumlahkan serat pangan tidak larut dengan serat pangan larut. Perhitungan : Serat Pangan Tidak Larut = x 100% Serat Pangan Larut = x 100% Serat Pangan Total = serat pangan tidak larut + serat pangan larut Keterangan : D = berat setelah pengeringan (g) I = berat setelah pengabuan (g) W = berat sampel (g) B = berat blanko bebas abu (g) Jumlah Bakteri Asam Laktat (Bacteriological Analytical Manual, 2001). Pemupukan untuk bakteri asam laktat menggunakan metode tuang. Sebanyak 1 ml sampel yang sudah homogen dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer berisi 9 ml larutan BPW, sehingga terbentuk pengenceran Sebanyak 1 ml larutan dari pengenceran 10-1 dimasukkan ke dalam tabung ulir berisi 9 ml larutan BPW, 22

10 sehingga terbentuk pengenceran Pengenceran dilakukan sampai pada pengenceran Pemupukan metode tuang selanjutnya dilakukan dengan cara mengambil secara aseptik sebanyak 1 ml contoh yang telah diencerkan (10-5, 10-6 dan 10-7 ) kemudian disebarkan pada permukaan cawan petri. Media de-man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) steril sebanyak ml dituang ke dalam cawan petri dan dihomogenisasi kemudian dibiarkan sampai mengeras. Cawan petri diinkubasi terbalik pada suhu 37 C selama jam. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC). Penilaian Organoleptik (Soekarto, 1990 yang Dimodifikasi). Penilaian organoleptik dilakukan melalui uji mutu hedonik. Sampel disajikan didalam gelas kaca dengan jumlah yang seragam. Panelis terdiri dari 30 orang mahasiswa. Panelis dipilih berdasarkan kesediaannya untuk menjadi panelis, tidak alergi terhadap produk yang akan diujikan dan memiliki waktu untuk mendapatkan pelatihan khusus sebelum melakukan uji organoleptik. Skala yang digunakan berkisar antara 1-5. Pengujian ini dilakukan terhadap warna, rasa, aroma dan viskositas dari minuman whey probiotik yang disajikan. Formulir untuk pengujian organoleptik dapat dilihat pada Lampiran 1. Penetuan Formula Terbaik berdasarkan Kadar Serat Pangan, Jumlah Bakteri Asam Laktat dan Karakteristik Organoleptik Formula terbaik dari ketiga jenis sampel whey probiotik dapat dihitung dengan perankingan jika diasumsikan bahwa kadar serat pangan, jumlah bakteri asam laktat dan semua peubah yang terdapat didalam pengujian organoleptik memiliki tingkat kepentingan yang sama. Perankingan didasarkan pada karakteristik produk yang diinginkan. Ranking satu diberikan pada whey probiotik dengan kadar serat pangan dan jumlah BAL tertinggi, berwarna kekuningan, memiliki rasa asam khas kefir, tidak beraroma whey dan memiliki konsistensi yang kental. Formulasi terbaik didapatkan dengan menghitung jumlah total hasil perankingan yang didapatkan. Produk dengan nilai total ranking terendah merupakan produk dengan formula terbaik. Perankingan hanya dapat dilakukan pada data yang menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Data dengan hasil analisis yang tidak berbeda nyata diberi 23

11 ranking yang sama yaitu satu. Tabel perankingan untuk menentukan formulasi terbaik ditampilkan pada Tabel 5. Tabel 5. Form Perankingan Penentuan Formula Terbaik Peubah P1 P2 P3 Kadar Serat pangan Jumlah BAL Uji Mutu Hedonik Warna Rasa Aroma Kekentalan Jumlah Ranking Rancangan dan Analisis Data Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan tiga perlakuan, yaitu: P1 = whey probiotik tanpa penambahan ekstrak cincau P2 = whey probiotik dengan penambahan ekstrak cincau hitam 10% P3 = whey probiotik dengan penambahan ekstrak cincau hijau 10% Seluruh perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Model matematika yang digunakan untuk data parametrik adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie,1995) : Y ij = µ + α i + β j + ε ij Keterangan : Y ij = nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = nilai rataan umum pengamatan α i β j ε ij = pengaruh perlakuan ke-i = pengaruh ulangan ke-j = pengaruh dari galat percobaan ke-i dan ulangan ke-j Model matematika yang digunakan untuk data non parametrik (Kruskal Wallis) menurut Casella (2008) adalah sebagai berikut : 24

12 H = + Keterangan : n 1 : jumlah pengamatan dalam sampel ke-1 (i = 1, 2, 3,..., k) n : R i : jumlah dari ranking untuk sampel ke-i Analisis Data Pengujian data parametrik dianalisis ragam dengan ANOVA sedangkan untuk data nonparametrik dianalisis dengan uji Kruskal Wallis. Jika pada analisis ragam didapatkan hasil yang berbeda nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey. 25