Mikrobiologi Laut (Pertemuan Ketujuh)

Transkripsi

1 Mikrobiologi Laut (Pertemuan Ketujuh) PERTUMBUHAN MIKROBA (Kultur Kontinyu dan Metode Pengukuran Pertumbuhan) Dr.Ir. Arniati Massinai, M.Si Jurusan Ilmu Kelautan Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Unhas 2015

2 Kultur Kontinyu Metode Pengukuran Pertumbuhan

3 Kultur Kontinyu

4 Kultivasi mikroba menggunakan teknik kultur kontinyu/sinambung, mikroba ditumbuhkan secara terus menerus pada fase paling optimum untuk fase pertumbuhan yaitu fase eksponensial dimana sel membelah diri dengan laju yang konstan, massa menjadi dua kali lipat mengikuti kurva logaritmik. Hal ini dilakukan dengan memberi nutrisi secara terus menerus sehingga mikroba tidak pernah kekurangan nutrisi. Penambahan nutrisi/media segar ke dalam bioreaktor dilakukan secara kontinyu, dimana dalam waktu yang sama larutan yang berisi sel dan hasil produk hasil metabolisme dikeluarkan dari media dengan volume yang sama dengan substrat yang diberikan.

5 Kondisi tersebut menghasilkan keadaan yang STEDY STATE dimana pembentukan sel-sel baru sama dengan sel-sel yang dikeluarkan dari fermentor. Pada kondisi steady state konsentrasi nutrisi, konsentrasi sel, laju pertumbuhan dan konsentrasi produk tidak berubah walaupun waktu fermentasi makin lama

6 Kelebihan Kultur Kontinyu Produktivitas lebih tinggi, disebabkan lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor persatuan produk yang dihasilkan, laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol, pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur. Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru). Dapat dijalankan pada waktu yang lama. Cocok untuk proses yang kontaminasnya rendah dan produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat.

7 Kelemahan Kultur Kontinyu Aliran umpan yang lama, resiko kontaminasi besar Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus biasa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama. Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunkan pada waktu yang lama (Irianto, 2007).

8 Pertumbuhan bakteri dalam kultul kontinyu (biak sinambung) tidak akan mengikuti kurva pertumbuhan. Dalam pertumbuhan bakteri ini terdapat prosedur yang menjadi dasar biak sinambung yang dilakukan dalam kemostat dan turbidostat

9 Pertumbuhan dalam kemostat Kemostat terdiri dari bejana biak yang dimasuki larutan biak dari bejana persediaan dengan kecepatan aliran tetap. Diusahakan dalam bejana biak terdapat pemasokan O2 secara optimum dan supaya selekas mungkin terjadi distribusi merata dari nutrien yang dialirkan masuk sebagai larutan biak. Kecepatan pertambahan dinyatakan sebagai μx = dx/dt dan kerapatan bakteri meningkat dengan x = x0 e μ/t. Biak dalam kemostat dikendalikan subtrat. Stabilitas sistem ini berlandaskan keterbatasan kecepatan tumbuh oleh konsentrasi subtrat yang diperlukan pertumbuhan (donor H, sumber N, Sumber S, atau sumber P).

10 Kultur dalam Kemostat d a b c e f g Gambar : Perinsip Biak sinambung dalam kemostat 1. Bejana persediaan dengan filter keseimbangan (a) pipa pengisi (b) 2. Pompa peristaltik 3. Kemostat dengan penambah larutan biak (c), pengaduk (d), filter udara masuk (e) dan pengambil cuplikan bahan (f) 4. Bejana penampung dengan filter udara keluar (g) 4

11 Fig. The cell crop of a bacterial culture in chemostat

12 Pertumbuhan dalam turbidostat Sistem ini didasarkan pada kerapatan bakteri tertentu atau kekeruhan tertentu yang dipertahankan konstan. Ada perbedaan mendasar antara biak statik klasik dengan biak sinambung dalam kemostat biak statik harus dilihat sebagai sistem tertutup (boleh disamakan dengan organisme sel, tahap stationer dan tahap kematian. Kalau pada biak sinambung merupakan sistem terbuka yang mengupayakan keseimbangan aliran untuk organisme selalu terdapat kondisi lingkungan yang sama. Dalam pertumbuhan sinkron akan terjadi sinkronisasi pembelahan sel. Sinkronisasi populasi sel dapat dicapai dengan berbagai tindakan buatan antara lain dengan merubah suhu rangsangan cahaya, pembatasan nutrien atau menyaring untuk memperoleh sel-sel yang sama ukurannya. Sinkronisasi pertumbuhan ini juga dimaksudkan untuk menyediakan stater dengan usia yang sama.

13 Kultur dalam turbidostat Keterangan 1. penampungan medium steril 2. katub pengontrol aliran media 3. pengeluaran medium 4. Foto sel 5. Sumber cahaya 6. Turbistat

14 Metode Pengukuran Pertumbuhan

15 Laju Pertumbuhan Bakeri berkembang biak dengan pembelahan biner melintang n N = No ² n N = populasi akhir No = Populasi awal n = jumlah pembelahan sel waktu t

16 Waktu Generasi Kecepatan pembelahan sel ditentukan dengan waktu generasi (generation time) atau waktu berganda (doubling time) Waktu Generasi (G) dapat dihitung dgn rumus: t G = n Lon N - Log No n = Log 2 Dimana : G = waktu generasi t = waktu yg dibutuhkan dari jumlah No menjadi N No = populasi awal N = populasi setelah waktu t

17 Contoh soal : Jika 100 sel ditumbuhkan selama 5 jam menghasilkan sel berapa waktu generasinya????

18 Jumlah pembelahan, jumlah sel, logaritma jumlah sel

19 Grafik Jumlah pembelahan, jumlah sel, logaritma jumlah sel Figure 6.13

20 Kelompok Mikroba Bakteri Heterotrofik Bacillus megaterium Escherichia coli Rhisobium meliloti Troponema allidum Waktu generasi pada berbagai mikroba Bakteri Fotosintetik Cholopseudomonas ethylicum Rhodpseudomonas spheroides Rhodospirillum rubrum Waktu generasi (jam) 0,58 0,28 1,80 34,0 7,0 2,4 5,0 Khamir Saccharomyce cerevisiae 2,0 Protozoa Paramecium caudatum Stentor coureleus Tetrabyma geleti 10,5 32,0 3,0

21 Perhitungan Jumlah Sel Hitungan Cawan Hitungan Mikroskopik MPN (Most Probable Number) Metode pengukuran pertumbuhan Perhitungan Massa Sel secara Langsung Volumetrik Gravimetrik Turbidimetrik Perhitungan Massa Sel secara Tidak Langsung Analisa komponen sel (protein, AND, ATP, dsb) Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit skunder, panas) Analisis komsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral, dsb)

22 PERHITUNGAN JUMLAH SEL : HITUNGAN CAWAN Standard Plate Counts (SPC) Total Plate Count (TPC) Angka Lempeng Total (ALT)

23 Syarat-syarat Perhitungan Catat pengenceran yang digunakan Hitung jumlah koloni (yang hanya memenuhi syarat untuk dihitung), spreader tidak dihitung kalikan jumlah koloni (atau rerata jumlah jika digunakan ulangan dalam pengenceran yang sama) dengan kebalikan pengencerannya. Untuk mencegah kesalahan ketelitian dan akurasi, catat hanya dua digit pertama saja. Digit kedua dapat ditingkatkan jika digit ketiga di atas 5; gunakan nol untuk digit setelah digit kedua. Laporkan jumlah (atau dugaan jumlah) sebagai CFU per g atau ml.

24 Perhitungan mikrobia berdasar jumlah koloni Jumlah koloni: Dilakukan dengan pengenceran sampel Figure 6.15, top portion

25 TNTC Spreader

26 Kisaran Hitung untuk Plate Count PDA BAM Ch.3 (2001) : kisaran koloni percawan untuk pour plate AOAC (AOAC OM ) : kisaran koloni per cawan pour plate dan spread plate ISO 7218 (2007:38) : kisaran koloni per cawan untuk spread plate; coloni/cawan untuk pour plate; untuk koloni tipikal pada medium selektif koloni per cawan APHA AWWA WEF 9125 (2004:2) : kisaran koloni per cawan untuk pour plate dan spread plate

27 Perhitungan mikroorganisme dalam satuan CFU/ml atau Gram 1. APHA AWWA WEF 9125 (2004:2) : CFU/ml or gram = jumlah koloni / (jumlah sampel yang dinokulasi x tingkat pengenceran) Contoh : Hasil hitungan cawan : 50 koloni dari tingkat pengenceran 1/100 Jumlah sampel yang diinokulasi : 0,1 ml CFU/ml = 50 CFU/ (0,1 x 1/100) = 50 CFU / 0,001 = CFU/ml

28 Jumlah mikroorganisme jika lebih dari satu pengenceran N (CFU/ml or g) = ( C) / {(1 x n1) + 0,1 x n2) x d} Keterangan : N : Jumlah mikroorganisme CFU/ml or g C : Jumlah semua koloni pada semua cawan n1 : Jumlah cawan yang terhitung pada pengenceran pertama n2 : jumlah cawan yang terisi pada pengenceran ke dua /berikutnya d : Pengenceran dimana hitungan pertama (dari pengenceran pertama) diperoleh

29 Contoh Perhitungan 1/10 1/100 1/1000 TNTC (>300) TNTC (>300) 232 (30-300) 244 (30-300) 33 (30-300) 23 (<30) n1 : 2 cawan n2 : 1 cawan (23 tdk masuk kisaran) d : 1/100 N = {( )/(1 x 2) + (0,1 x 1) + (0,1 x 1) x (1/100)} = (509/0,021) CFU/ml dibulatkan = ,09 CFU/ml = CFU/ml

30 Jumlah Mikroorganisme Yang Tidak Terdapat Pertumbuhan Koloni Pada Cawan 1/10 1/100 1/ PDA BAM Ch.3 (2001) : kurang dari satu kali pengenceran terendah (10 ) Perhitungan : N = < 1 x 10 N = <10 CFU/ml (EAPC : Estimated Aerobic Plate Count) Pernyataan kurang dari satu (<1) menggambarkan ketidak pastian jumlah sel yang berada pada total sampel Walaupun volume sampelk inokulum menghasilkan non koloni, pelaporan sebai 0 mutlak dihindari karena belum tentu produk steril sekalipun belum tentu terbebas dari mikroorganisme

31 Jumlah Mikroorganisme jika semua pengenceran dibawah kisaran perhitungan 1/10 1/100 1/ (<30) 20 (<30) 4 (<30) 2 (<30) 0 (<30) 0 (<30) PDA BAM Ch.3 (2001) : kurang dari satu kali pengenceran terendah (10 ) Perhitungan : N = < 30 x 10 N = <30 x 10 CFU/ml N = 300 CFU/ml (EAPC : Estimated Aerobic Plate Count)

32 Jumlah Mikroorganisme jika Upper Limit 1/10 1/100 1/1000 TNTC (>300) TNTC (>300) 425 (>300) TNTC (>300) TNTC (>300) 450 (>300) Jika semua pengenceran jumlah koloni diatas 300 upper limit dan kurang dari 100 CFU/cm² (luas cawan) : > 100 x luas area cawan x pengenceran tertinggi ATAU n1 : 2 cawan d : 1/1000 N = {( )/(1 x 2) + (0,1 x 1) x (1/1000)} = (875/0,002) CFU/ml = CFU/ml = CFU/ml (EAPC)

33 Spreader Ada tiga tipe spreader. Tipe pertama adalah rantaian koloni, tidak dapat dipisahkan secara tepat, disebabkan oleh disintegrasi gumpalan bakteri ketika inokulum ditebarkan dalam medium plating. Tipe kedua adalah perkembangan koloni yang meluas dalam film air antara agar dan dasar Petri. Tipe ketiga bentuk dalam film air pada tipe permukaan agar.

34 Spreader Kedua tipe ini berkembang karena akumulasi kelembapan pada tiap sebaran asli, dan spreader ini dapat mewakili pertumbuhan koloni individu, jika pengenceran terdistribusi secara merata dalam medium.

35 Pelaporan untuk Koloni Menyebar

36 Pelaporan Adanya Kontaminasi Dan Kesalahan Kerja

37 Hitungan mikroskopik

38

39 Contoh : - Jumlah suspensi sel dengan pengenceran 10 ⁴ dalam kotak sedang, masing masing sebanyak 9,12,8,9, dan 10 sel Jadi jumlah sel/ml dalam kotak sedang : Sel/ml : rata-rata jumlah sel / volume kotak sedang X faktor pengenceran Rata-rata jumlah sel = ( )/5 = 9,6 Volume kotak sedang : 4 x 10 ⁶ Faktor Pengenceran : 10 ⁴ Sel/ml = 9,6 / ( (4 x 10 ⁶ ) x (10 ⁴)) = 9,6/ (0,000004) x (0,0001) = 9,6/ 0, = = 2,4 x 10¹

40 Most probable number (MPN) Merupakan satu metode uji pengenceran bertingkat (serial dilution) untuk mengukur konsentrasi mikroorganisme Mengunakan medium cair pada tabung reaksi, dengan pemasangan tabung Durhan terbalik. Perhitungannya berdasarkan tabung reaksi yang positif (timbul kekeruhan atau gas pada tabung Durham) Untuk setiap pengenceran pada umumnya mengguakan 3 atau 5 seri tabung (SNI (2007:7) Pengencerannya harus lebih tinggi sedapat mungkin di dalam tabung hanya ada satu mikrooganisme

41 Gambar 3 tingkat pengenceran dengan menggunbakan 3 seri tabung

42 Kmbinasi yang positif Index MPN tiap 100 ml