BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Transkripsi

1 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Tumbuhan Benalu cengkeh (Scurrula ferruginea (jack) Danser) Benalu merupakan tumbuhan parasit terhadap inang tumbuhnya, walaupun bersifat parasit benalu berpotensi sebagai tumbuhan obat. Masyarakat menggunakan untuk bahan obat tradisional (Semangun, 2004) Sistematika Tumbuhan benalu pada cengkeh Kingdom : Plantae Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledonae rdo : Santalales Famili : Loranthaceae Genus : Scurrula Spesies : Scurrula ferruginea (jack) Danser. 2.2 Senyawa flavonoida Flavanoid adalah senyawa polifenol yang banyak terdapat pada sayuran dan buah-buahan. Flavonoid telah menunjukan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik dan aktifitas vasodilatator (Miller, 1996). Senyawa flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah dan biji. Kebanyakan flavonoida berada dalam tumbuh-tumbuhan kecuali alga. Ada juga flavonoida terdapat pada hewan. Penyebaran flavonoida pada tumbuhan yaitu angiospermae, klorofita, fungi briofita (Markham, 1988).

2 Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat gula yang disebut dengan glikosida (Harbone, 1996). Senyawa flavonoid bermanfaat dalam makanan, berupa senyawa fenolik, senyawa inin yang bersifat antioksidan kuat. Banyak kondisi penyakit yang diketahui bertambah parah oleh adanya radikal bebas seperti superoksida dan hidroksil, dan flavonoida memiliki kemampuan untuk menghilangkan dan secara efektif menyapu spesies pengoksida yang merusak itu. leh karena itu, makanan kaya flavonoida dianggap penting untuk mengobati penyakit-penyakit, seperti kanker dan jantung (Heinrich et al, 2009). Ada tiga kelompok flavonoida yang amat menarik perhatian dalam fisiologi tumbuhan, yaitu antosianin, flavonol, dan flavon. Antosianin ( dari bahas yunani Anthos, bunga dan kyanos, biru tua ) adalah pigmen berwarna yang umumnya terdapat dibunga berwarna merah, ungu, dan biru. Pigmen juga terdapat di berbagai tumbuhan lain, misalnya buah tertentu, batang, daun, dan bahkan akar. Sering flavonoida terikat di sel epidermis. Warna sebagian besar buah dan banyak bunga adalah akibat dari antosianin, walaupun beberapa warna tumbuhan lainnya, seperti buah tomat dan beberapa bunga kuning, karena karotenoid. Warna cerah daun musim gugur disebabkan terutama oleh timbunan antosianin pada hari cerah dan dingin, walaupun karotenoid kuning atau jingga merupakan pigmen terbesar di daun musim gugur pada beberapa spesies. (salisbury, 1995) Struktur Dasar Senyawa Flavonoida Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat digambarkan sebagai berikut : A C C C B Gambar 1. Kerangka dasar senyawa flavonoida (Sastrohamidjojo, 1996).

3 2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida (Harborne, 1987). 1. Flavonoida -glikosida Pada flavonoida -glikosida, satu gugus hidroksil flavonoida atau lebih terikat pada satu gula (lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikolisasi menyebabkan flavonoida menjadai kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa. 2. Flavonoida C-glikosida Gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon tahan asam. Glikosida yang demikian disebut C-glikosida. 3. Flavonoida Sulfat Senyawa ini mengandung satu ion sulfat atau lebih yang terikat pada hidroksi fenol atau gula. Senyawa ini sebenarnya bisulfat karena terdapat sebagai garam, yaitu flavon--s 3 K. Banyak yang berupa glikosida bisulfat, bagian bisulfat terikat pada hidroksil fenol yang mana saja masih bebas atau pada gula. 4. Biflavonoida Biflavonoid adalah flavonoid dimer, walaupun prosianidin dimer (satuan dasarnya katekin) biasanya tidak dimasukkan ke dalam golongan ini. Flavonoid yang biasanya terlibat adalah flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola

4 oksigenasi yang sederhana 5,7,4 (kadang-kadang 5,7,3,4 ) dan ikatan antar flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau ikatan eter. 5. Aglikon flavonoid yang aktif-optik Sejumlah aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian menunjukkan keaktifan optik ( yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar ). Yang termasuk dalam golongan flavonoida ini adalah flavanon, dihidroflavonol, katekin, rotenoid, dan lain-lain. Robinson (1995), mengelompokkan flavonoid beradasarkan keragaman pada rantai C 3 yaitu : 1. Flavanon Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk, dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk. 2. Flavon Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3- hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoida

5 3 Flavonol Flavonol adalah turunan 3-hidroksi flavon dan dihidroflavonol.daya serap sinar UV pada struktur flavanol terjadi pada nm pada pita I dan nm pada pita II.Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida. H 4 Isoflavon Merupakan isomer flavon, jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin (senyawa pelindung) yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan terhadap penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi manapun. 5 Flavanonol Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna. H 6 Khalkon

6 Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat tua dengan sinar UV bila dikromatografi kertas. Aglikon khalkon dapat dibedakan dari glikosidanya karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air. 7 Auron Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Auron memiliki panjang gelombang maksimum pada band I nm. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromarografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet karena kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. CH 8 Katekin Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Katekin dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai banyak kesamaan dengan semua senyawa tanpa warna (Robinson, 1995). H H H H H 9 Antosianin

7 Antosianin adalah pigmen pada daun, bunga dan batang tanaman yang memiliki banyak warna biru, lembayung, violet, dan semua yang mendekati warna merah. Antosianin terdapat juga dalam bagian lain tumbuhan tinggi kecuali fungus. Antosianin selalu terdapat dalam bentuk glikosida. Faktor-faktor yang mempengaruhi warna dari antosianin yaitu ph, logam dalam bentuk kompleks dan juga tanin (Robinson, 1995). H 10 Leukoantosianidin Merupakan monomer flavan 3,4-diol, leukoantosianidin jarang terdapat sebagai glikosida, namun beberapa bentuk glikosida yang dikenal adalah apiferol, dan peltoginol (Robinson, 1995). H H H H H H

8 Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana semua flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni : Tabel 2.1 Sifat dari golongan-golongan flavonoida menurut Harborne Golongan flavonoida Penyebaran Ciri khas

9 Antosianin Proantosianidin Flavonol Flavon Glikoflavon Biflavonil Khalkon dan Auron Flavanon Isoflavon Pigmen bunga merah marak, dan biru juga dalam daun dan jaringan lain. Terutama tidak berwarna, dalam daun tumbuhan yang berkayu. Terutama ko-pigmen tidak berwarna dalam bunga sianik dan asianik tersebar luas dalam daun. Seperti flavonol Seperti flavonol Tidak berwarna dan hampir seluruhnya terbatas pada gimnospermae Pigmen bunga kuning, kadangkadang terdapat juga dalam jaringan lain Tidak berwarna, dalam daun dan buah (terutama dalam Citrus) Tidak berwarna, sering kali dalam akar, hanya terdapat dalam suku Leguminosae Larut dalam air, λ maks nm, bergerak dengan BAA pada kertas. Menghasilkan antosianidin bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam. Setelah hidrolisis, berupa bercak kuning murup pada kromatogram Forestal bila disinari sinar UV, maksimal spektrum pada nm. Setelah hidrolisis, berupa bercak coklat redup pada kromatogram Forestal maksimal spektrum pada nm. Mengandung gula yang terikat melalui ikatan C-C, bergerak dengan pengembang air, tidak seperti flavon biasa. Pada kromatogram BAA berupa bercak redup dengan R F tinggi. Dengan amonia berwarna merah (perubahan warna dapat diamati in situ), maksimal spektrum nm. Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl, kadang kadang sangat pahit. Bergerak pada kertas dengan pengembang air, tidak ada uji warna yang khas Biosintesis Flavonoid Senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linear

10 yang terdiri dari tiga atom karbon. Kerangka ini dapat ditullis sebagai C 6 -C 3 -C 6. Jadi senyawa flavonoida adalah senyawa 1,3 diarilpropana, senyawa isoflavonoida adalah senyawa 1,2 diarilpropana, sedang senyawa-senyawa neoflavonoida adalah senyawa 1,1 diarilpropana. Senyawa flavonoida diturunkan dari unit C 6 -C 3 (fenil propana) yang bersumber dari asam sikimat (via fenilalanin) dan unit C 6 yang diturunkan dari jalur poliketida. Fragmen poliketida ini disusun dari tiga molekul malonil-koa yang bergabung dengan unit C 6 -C 3 (sebagai KoA tioester) untuk membentuk unit awal triketida. leh karena itu, flavonoid yang berasal dari biosintesis gabungan terdiri atas unit-unit yang diturunkan dari asam sikimat dan jalur poliketida (Heinrich et al 2009). Semua varian flavonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama yang melalui alur sikimat dan alur asetat-malonat. Flavonoida yang pertama kali terbentuk pada biosintesis adalah khalkon dan semua bentuk diturunkan darinya melalui berbagai alur. Modifikasi flavonoida lebih lanjut mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan: penambahan (atau pengurangan) hidroksilasi, metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida, metilenasi gugus orto-dihidroksil, dimerisasi (pembentukan biflavonoida), dan glikosilasi gugus hidroksil (pembentukan flavonoida -glikosida) atau inti flavonoida (pembentukan flavonoida C-glikosida).

11 Gambar 2.1 Biosintesa hubungan antara jenis monomer flavonoida dari alur asetat-malonat dan alur sikimat (Markham, 1988).

12 2.2.4 Sifat Kelarutan Flavonoida Senyawa flavonoid termasuk senyawa polar, karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil ataupun suatu gugus gula. Hal ini memungkinkan flavonoid dapat larut dalam pelarut polar seperti etanol (EtH), metanol (MeH), butanol, aseton, dimetilsulfoksida (DMS), dimetilformamida (DMF), air dan lain-lain. Flavonoid yang berupa aglikon merupakan golongan polifenol yang memiliki sifat senyawa fenol yaitu bersifat agak asam, Keberadaan gugus gula yang terikat pada flavonoid (glikosida) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah terlarut dalam air. Namun hal sebaliknya tidak berlaku pada aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988). 2.3 Skrining Fitokimia Banyak reagen yang dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan dari flavonoid, meskipun beberapa juga akan bereaksi positif dengan senyawa polifenol. Reagen yang biasa digunakan adalah : 1. Shinoda Test, yaitu dengan menambahkan serbuk magnesium pada ekstrak sampel dan beberapa tetes HCl pekat, warna orange, pink, merah sampai ungu akan terjadi pada senyawa flavon, flavonol, turunan 2,3-dihidro dan xanton. Penggunaan zinc sebagai pengganti magnesium dapat dilakukan, dimana hanya flavanonol yang memberikan perubahan warna merah pekat sampai magenta, flavanon dan flavonol akan memberi warna merah muda yang lemah sampai magenta (Sarker, et al 2006). 2. H 2 S 4(p), flavon dan flavonol akan memberikan perubahan larutan kuning pekat. Kalkon dan auron menghasilkan larutan berwarna merah atau merah kebiru-biruan. Flavanon memberikan warna orange (Sarker, et al 2006). 3. NaH 10%, menghasilkan larutan biru violet 4. FeCl 3 5% telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi tidak dapat digunakan untuk membedakan macam-macam golongan flavonoid.

13 Pereaksi ini memberi warna kehijauan, warna biru, dan warna hitam-biru (Robinson, 1995). 2.4 Teknik Pemisahan Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan: 1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan. 2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaanperbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam satu golongan (Muldja, 1995) Ekstraksi Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin (dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi. Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Hal ini sangat mempermudah proses isolasi (Heinrich et al, 2009). Beberapa metode ekstraksi dapat digunakan untuk mengekstrak suatu konstituen dalam suatu bahan tanaman, yang diantaranya adalah maserasi, perkolasi, ekstraksi sokletasi, ekstraksi pelarut bertekanan, ekstraksi dengan refluks, dan destilasi uap. Dalam ekstraksi padat-cair, bahan tanaman ditempatkan dalam sebuah wadah, dan dibiarkan terjadi kontak dengan pelarut. Proses yang terjadi dari seluruh proses dinamis tersebut dapat diuraikan menjadi beberapa tahap, yaitu tahap pertama pelarut akan berdifusi ke dalam sel, kemudian

14 pelarut akan melarutkan metabolit, dan pada proses akhir pelarut akan berdifusi keluat dari sel bersama dengan metabolit (Sarker, 2007). Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996) Partisi Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat. Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap: 1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan organik 2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich et al, 2009) Hidrolisa Prosedur yang digunakan untuk hidrolisis asam dari flavonoid glikosida adalah, sebanyak 2 mg sampel flavonoid glikosida dicampur dengan asam klorida 6% sebanyak 5 ml dengan jumlah metanol yang sangat sedikit pada sampel untuk membuat proses hidrolisis menjadi sempurna. Larutan dipanaskan selama 45 menit lalu didinginkan, kemudian ekstrak sepenuhnya dilarutkan dengan eter. Penguapan dari larutan akan mengendapkan ramnosa dan glukosa. Lapisan eter, setelah dikeringkan dengan menggunakan natrium sulfat akan didapatkan aglikon flavonoid setelah diuapkan (Mabry et al, 1970).

15 2.4.4 Kromatografi Kromatografi adalah berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Pemisahan secara kromatografi yang berhasil baik berkaitan dengan mengkompromi daya pisah kromatografi, beban cuplikan, dan waktu analisis (Gritter, 1991) Pemisahan pada kromatografi planar pada umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Nilai faktor retardasi solut (Rf) dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan dalam persamaan: Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam. Proses sorpsi Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam, sementara itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak) disebut dengan desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan desorpsi) terjadi secara terus menerus selama pemisahan kromatografi karenanya sistem kromatografi berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian dengan perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga keadaan kesetimbangan ini. Ada 4 jenis

16 mekanisme sorpsi dasar dan umumnya 2 atau lebih mekanisme ini terlibat dalam satu jenis kromatografi. Keempat jenis tersebut adalah adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi ukuran. Adsorben Silika gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas. Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si--Si dan gugus silanol (Si-H). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar. Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu C, meskipun demikian reproduksibilitasnya sulit dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati. Beberapa adsoben yang sering digunakan adalah : Alumina (paling polar) Karbon aktif (charcoal) Silika gel Magnesium silikat Selulosa Resin-resin polimerik (stiren/difenil (paling non-polar) benzen) Tabel 2.2 Daftar adsorben pada kromatografi (Gandjar dkk, 2007) Kromatografi lapis tipis Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya 5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit sampai satu jam. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap atau penyangga untuk lapisan zat cair.

17 Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut (Sudjadi, 1986). Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5 g dapat ditangani. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan yang sedikit. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode pemisahan yang cukup sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi silika gel dengan menggunakan pelarut tertentu (Gritter, 1991). Lempeng lapis penyerap sering menggunanakan indikator flueresensi sehingga bahan alam yang mengabsobsi sinar uv gelombang pendek 245 nm akan tampak sebagai bercak hitam pada latar hijau Kromatografi Kolom Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin saja sampai 100 kalinya. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap yang dipakai ditentukan oleh bobot campuran sampel yang akan dipisahkan. Untuk pemisahan normal, bobot sampel biasanya 30:1 ternyata memadai jika pemisahan tidak terlalu sukar. Ukuran partikel penjerap pada kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Walau pun banyak jenis penjerap telah dipakai untuk kolom, alumina dan silika gel adalah penjerap yang paling berguna dan mudah didapat. Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama (diperiksa dengan KLT) atau tampaknya berasal dari satru puncak (memakai pendeteksian sinambung) digabungkan, dan

18 pelarutnya diuapkan, lebih baik dengan tekanan rendah. Jika pelarut dan penjerap murni. Maka fraksi-fraksi pun murni (Gritter dkk, 1991) Kromatografi lapis tipis preparatif Sebagian besar pemakaian kromatografi lapis tipis preparatif hanya dalam jumlah miligram. Kromatografi lapis tipis preparatif bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, dijumpai sebagian besar dalam isolasi bahan alam. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat KLT. Cuplikan sebanyak mg dapat dipisahkan pada lapisan silika gel atau aluminium oksida 20 x 20 cm yang tebalnya 1 mm. Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tercelup ke dalam pengembang. Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan pelarut yang paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap). Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar kemungkinan penguraian (Hostettmann dkk, 1995) Kristalisasi Kristalisai adalah pengendapan kristal dari larutan yang terbuat dari bahan tertentu. Selama proses pembentukan kristal, molekul akan cenderung menjadi melekat kristal tumbuh terdiri dari jenis yang sama molekul karena cocok dalam kisi kristal untuk molekul

19 struktur yang sama daripada molekul yang lain. Jika proses kristalisasi diperbolehkan untuk terjadi dalam mendekati kondisi kesetimbangan, preferensi molekul untuk deposit pada permukaan terdiri dari molekul seperti akan menyebabkan peningkatan dalam kemurnian bahan kristal. Sehingga proses rekristalisasi adalah salah satu metode yang paling penting tersedia bagi ahli kimia untuk pemurnian padatan. ( Pasto, 1992 ) Rekristalisasi Amorf yang diperoleh dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan EtAc, diaduk hingga semua amorf larut sempurna. Kemudian ditambahkan n heksana secara perlahan lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di dasar wadah. Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf hingga diperoleh kristal yang benar benar bebas dari pelarut (Jacobs, 1974). 2.5 Teknik Spektroskopi Spektrofotometer merupakan alat untuk mempelajari interaksi sinar elektromagnetik dengan materi. Gelombang elekromagnetik yang digunakan adalah sekitar nm. Energi elektromagnetik akan diubah menjadi besaran listrik dan melalui amplifier akan diubah menjadi besaran yang dapat diamati. Radiasi elektromagnetik adalah energi yang digunakan untuk penyerapan dan emisi radiasi magnetik yang diteruskan melalui ruang dengan kecepatan luar biasa. Dikenal dua kelompok utama spektroskopi, yaitu spektroskopi atom dan spektroskopi molekul. Dasar dari spektroskopi atom adalah tingkat energi elektron terluar suatu atom atau unsur, sedangkan dasar dari spektroskopi molekul adalah tingkat energi molekul yang melibatkan energi elektronik, energi vibrasi, dan energi rotasi. Energi elektronik yaitu energi yang melibatkan tingkat energi yang ditempati orbit elektron suatu atom dari molekul- molekul. Energi vibrasi yaitu energi yang melibatkan vibrasional antar

20 atom dalam molekul. Energi rotasi yaitu energi yang melibatkan rotasi dari molekul (Bintang, 2011) Spektroskopi Ultra Violet Serapan molekul di dalam derah ultra violet dan terlihat dari spektrum bergantung pada struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di dalam keadaan tereskitasi (Silverstein, 1986). Fenol menyerap didaerah UV pendek dan dapat dideteksi pada pelat silika gel yang mengandung indikator fluoresensi gelombang 253 nm, terlihat sebagai bercak gelap dengan latar belakang berfluoresensi. Akan tetapi, biasanya lebih baik mendeteksinya dengan pereaksi yang lebih khas.semua senyawa fenol berupa senyawa aromatik sehingga semuanya menunjukan serapan kuat didaerah spektrum UV. Selain itu secara khas senyawa fenol menunjukan geseran batokrom pada spektrumnya bila ditambahkan basa (Markham, 1988) Spektroskopi Inframerah (FT-IR) Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran (vibrasi) yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen mengalami getaran (vibrasi) atau osilasi (iscillation) dengan cara serupa dengan dua bola yang terikat oleh suatu pegas. Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap menyebabkan kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam keadaan vibrasi tereksitasi, energi yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila molekul itu kembali ke keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari absorpsi oleh suatu tipe ikatan, bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. leh karena itu, tipe ikatan yang berlainan (C-H, C-C, C=, C=C, -H, dan sebagainya) menyerap radiasi inframerah

21 pada panjang gelombang yang berlainan. Dengan demikian spektrometri inframerah dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya energi yang diserap juga beraneka ragam dari ikatan ke ikatan. Ini disebabkan sebagian oleh perubahan dalam momen dipol (μ 0) pada saat energi diserap. Ikatan nonpolar (seperti C -H atau C-C) menyebabkan absorpsi lemah, sedangkan ikatan polar (seperti misalnya -H, N- H, dan C=) menunjukkan absorpsi yang lebih kuat. Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul: 1. Streching (vibrasi regang/ulur): vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan. 2. Bending (vibrasi lentur/tekuk): vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan. leh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang. Contohnya, ikatan -H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm-1, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan -H itu. Suatu ikatan -H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm-1, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlain-lainan ini disebut cara vibrasi fundamental (Supratman, 2010) Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) Setelah spektroskopi inframerah, spektroskopi resonansi magnetik inti (NMR) adalah yang metode yang paling penting digunakan dalam kimia organik. Dalam spektroskopi inframerah mengandung infromasi mengenai adanya gugus fungsi pada molekul, sedangkan spektroskopi NMR memberikan informasi mengenai jumlah dari masing-masing hidrogen.

22 Kemampuan terhebat resonansi inti magnetik timbul karena tidak semua proton dalam molekul memiliki resonansi yang identik pada frekuensi yang sama. Hal ini sesuai dengan fakta bahwa berbagai macam proton dalam molekul dikelilingi oleh elektron dan memiliki sedikit perbedaan dalam lingkungan elektronik dari satu dan yang lainnya. Proton akan terlindungi oleh elektron yang mengelilingi mereka. Dalam daerah magnetik, peredaran elektron valensi dari daerah penghasil proton yang bertentangan dengan daerah magnetik yang berlaku. Pergeseran kimia dalam unit δ ditunjukkan dalam jumlah resonansi proton yang bergeser dari TMS dalam bagian per juta (ppm) dari frekuensi dasar spektroskopi. Unsur dasar dari spektrometer NMR adalah ilustrasi skematis. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang tidak memiliki proton (biasanya CCl 4 ) dan dalam jumlah yang kecil dari TMS yang ditambahkan sebagai pusat referensi internal. Semua proton dalam molekul yang identik dalam lingkungan kimia akan memiliki pergerseran kimia yang sama. Dengan demikian, semua proton dari TMS atau semua proton dalam benzen, siklopentana, atau aseton memiliki nilai resonansi yang berdekatan pada nilai δ. Masing-masing komponen akan memiliki penyerapan yang tunggal dalam spektrum nmr. Proton ini dikatakan sama secara kimia. Pada kenyataannya, spektrum tidak dapat hanya dibedakan dari berapa banyak tipe proton yang berbeda pada molekul tersebut, tetapi dapat memperlihatkan berapa banyak jenis perbedaan yang ada dalam molekul tersebut. Dalam spektrum NMR, daerah dibawah masing-masing peak adalah proporsional dengan jumlah dari hidrogen yang ada pada peak tersebut (Pavia, 1979).