SIGIT PURWANTOMO. Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Departemen Biologi

Transkripsi

1 KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI SIGIT PURWANTOMO Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Departemen Biologi PROGRAM STUDI BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007 i

2 Judul Nama NRP Program Studi : KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI : SIGIT PURWANTOMO : P : BIOLOGI Disetujui, Komisi Pembimbing Prof. Dr.Ir. Antonius Suwanto, M.Sc Ketua Prof. Dr.Ir. Alex Hartana Anggota Prof. Dr.Ir. Maggy T Suhartono Anggota Dr.Ir. Inez H Slamet-Loedin Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.Sc Tanggal Ujian: 29 Agustus 2007 Tanggal Lulus: ii

3 KATA PENGANTAR Puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa sehingga pada akhirnya penelitian dengan judul KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI dapat diselesaikan. Penelitian ini sebagian besar dibiayai oleh KNAW (Dutch Royal Academy of Sciences). Sebagian disertasi ini telah diajukan pada jurnal Anales Bogoriense dengan judul The expression of drought-repressed rice homeobox gene Oshox4 controls reduction of cell size and cell number. Di sampng itu, sebagian disertasi ini telah diajukan pula pada jurnal Plant Molecular Biology dengan judul Annotation of the homeodomain-leucinezipper (HD-Zip) family I, II and III from rice and functional analysis of the HD-Zip family I member Oshox4. Pertama-tama saya mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. Bimbingan, saran, dan dorongan semangat selama saya melakukan studi program doktor ini tidak akan pernah sekalipun saya lupakan. Ucapan terima kasih saya tujukan untuk Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana yang telah memberikan dasar genetika kepada saya selama saya sekolah di IPB. Di samping itu, saran, kritikan, dan masukan dari Bapak telah memberi dorongan positif pada desertasi saya akan selalu diingat. Terima kasih saya ucapkan untuk Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono untuk waktu yang dicurahkan dalam memberi masukan pada desertasi saya. Saran Ibu untuk memberikan desertasi saya dibaca oleh orang lain di luar ilmu yang saya tekuni ini sangat membantu memperbaiki alur berpikir saya. Hal ini akan selalu saya ingat. Terima kasih saya tujukan kepada Ibu Dr. Ir. Inez H Slamet Loedin. Pengalaman saya bekerja dan usaha Ibu Inez untuk mendorong semangat belajar saya tidak cukup untuk digambarkan dalam kalimat ini. Ibu Inez telah memberikan dasar bagi saya untuk bekerja di laboratorium biologi molekuler dan mengenalkan saya kepada teman-teman peneliti di luar negeri. Semuanya ini senantiasa tidak akan hilang dari ingatan. Terima kasih kepada Bapak Dr. Dedy Duryadi Solihin atas dorongan semangat kepada saya. Ucapan terima saya tujukan untuk Ibu Dr. Utut Widiastuti, Bapak Dr. Sony Suharsono, dan Bapak Dr. M Jusuf, serta Bapak Dr. Sugiono Moeljopawiro untuk masukan dan kritik yang telah diberikan. Pada kesempatan ini, saya mengucapkan terima kasih kepada Dr. Annemarie H Meijer yang telah memberi bimbingan selama saya bekerja di laboratorium Clusius di tahun pertama. Disiplin bekerja dan membaca yang ditanamkan tidak akan pernah saya lupakan. Kepada Dr. Pieter. BF Ouwerkerk saya mengucapkan terima kasih untuk teknik molekuler yang telah diberikan serta waktu yang dicurahkan membimbing saya di lab Clusius sejak tahun pertama dan sampai sekarang. Hampir semua teknik molekuler yang saya gunakan adalah berasal dari Pieter. Ini akan saya ingat selalu. Terima kasih saya ucapkan kepada Saskia Rueb yang telah memberikan pelajaran transformasi genetika padi. Ucapan terima kasih juga diucapkan kepada Enrico Scarpella yang telah berbagi teknik membuat preparat potongan padi. Terima kasih diucapkan lepada Marianne Verbenne yang telah dengan senang hati memberikan konstruksi asam salisilat asal bakteri kepada iii

4 saya. Terima kasih ditujukan untuk Huub Loffler sebagai koordinator BIORIN KNAW yang telah memberikan dorongan kepada saya. Terima kasih saya ungkapkan untuk Andi Utama, Diah Retno, dan Ibu Sukendah untuk waktu yang diberikan dalam membaca disertasi saya ini dan sekaligus membantu proses editing. Usaha yang membantu saya mengedit pada disertasi ini akan selalu saya ingat dan tidak akan terlupakan. Akhirnya kepada teman-teman di Biotek LIPI dan di IPB yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu, saya mengucapkan terima kasih yang mendalam untuk semua yang telah diberikan selama saya menempuh S3 ini. Pada desempatan ini, ucapan terima kasih saya ungkapkan kepada keluarga, Ibu-Bapak, Mamak, Mimi-Apa, Mbak Cici-Mas Gun, Iwit-Dewi, Uni, Teh Ina-A Iwan, Teh Ely-A Didi, Hendra-Ika, dan Dindin-Nia yang memberi banyak dorongan untuk saya selama belajar di Belanda dan IPB ini. Terima kasih untuk Aay, ucapan terima kasih tidak cukup hanya diungkapkan dalam dua kata terima dan kasih. Terima kasih untuk mendukung pilihan saya belajar S-3 di Leiden dan IPB. Jakarta, 2007 Sigit Purwantomo iv

5 RIWAYAT HIDUP Sigit Purwantomo dilahirkan di Jakarta, 10 April Menamatkan sekolah dasar dan menengah di Jakarta. Tahun 1988 diterima di IKIP Jakarta Jurusan Pendidikan Biologi. Tahun 1993 menyelesaikan pendidikan S-1 di IKIP Jakarta di bawah bimbingan Prof. Dr. Emo Kastama. Memulai pendidikan S-2 di Jurusan Biologi Universitas Indonesia pada tahun 1995 dan menyelesaikannya pada tahun 1997 dengan predikat cum laude. Penelitian S-2 dilakukan di Puslitbang Bioteknologi LIPI di bawah supervisi Dr. Usep Soetisna. Tahun 1997 bergabung dengan kelompok penelitian padi Puslit Bioteknologi di bawah supervisi Dr. Inez H Slamet-Loedin. Tahun 2001 semester genap terdaftar di Institut Pertanian Bogor. Tahun bekerja di Clusius Lab, Leiden University, The Netherlands di bawah supervisi Dr. Annemarie H Meijer dan Dr. Pieter BF Ouwerkerk. Sampai sekarang bekerja di Kelompok Penelitian Padi, Lab Biologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong. v

6 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR ix DAFTAR SINGKATAN xiv PENDAHULUAN 1 Latar belakang 1 2 Tujuan dan manfaat penelitian Tujuan penelitian Manfaat penelitian... 5 TINJAUAN PUSTAKA 1 Kekeringan 1.1 Budidaya padi dan kekeringan Cekaman kekeringan: respon tanaman dan upaya rekayasa genetika untuk meningkatkan toleransi tanaman Identifikasi gen potensial untuk padi tahan kering HD-Zip (Homeodomain Leucine Zipper) Asam salisilat Asam salisilat pada tanaman Asam salisilat pada mikroorganisme Sinyal dengan perantara asam salisilat Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri BAHAN DAN METODE 1 Waktu dan tempat penelitian Bahan penelitian Metodologi penelitian Karakterisasi Gen HD-Zip padi responsif kekeringan Penapisan HD-Zip yang merespon kekeringan Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan A Meningkatkan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV A.1 Konstruksi 35S-Oshox A.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi dan Arabidopsis A.2.1 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi A.2.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke Arabidopsis A.3 Uji kekeringan tanaman transgenik Arabidopsis 35S- B Oshox Menurunkan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi B.1 Konstruksi vektor RNAi-Oshox B.2 Transformasi RNAi-Oshox4 ke tanaman padi. 38 B.3 Analisis penurunan ekspresi Oshox C Melihat pola ekspresi gen Oshox C.1 Konstruksi vektor pc1391z mengandung fusi promoter Oshox4 dengan gen GUS.. 39 vi

7 C.2 Penggandaan plasmid dan transformasi Agrobacterium ke tanaman padi dan Arabidopsis C.3 Analisis ekspresi gen GUS C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico Introduksi gen-gen entc dan pmsb ke dalam tanaman padi Konstruksi plasmid pc1300 yang mengandung gen entc dan 41 pmsb Transformasi konstruksi gen PSA ke tanaman padi Nipponbare Analisis molekular ekspresi gen entc dan pmsb pada tanaman padi transgenik Nipponbare Pengukuran asam salisilat dan asam salisilat glukosida HASIL DAN PEMBAHASAN 1 Hasil penelitian karakterisasi gen HD-Zip 1.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman Respon gen HD-Zip padi terhadap cekaman abiotik Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat Uji kekeringan pada tanaman Arabidopsis yang mengandung 35S- Oshox Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox Analisis pola ekspresi gen Oshox Hasil penelitian introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat ke tanaman padi 2.1 Analisis Northern gen hph Analisis Northern gen entc Analisis Southern gen pmsb Kandungan asam salisilat Pembahasan 3.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan Introduksi gen-gen penyandi biosintesis asam salisilat asal bakteri ke dalam genom padi 70 4 Pembahasan umum 70 SIMPULAN DAN SARAN 1 Simpulan 74 2 Saran 74 DAFTAR PUSTAKA vii

8 DAFTAR TABEL Halaman 1 Target urutan nukleotida dari HD-Zip berupa pseudopalindromic Jenis kultivar padi yang dipakai dalam percobaan cekaman abiotik Jenis bakteri yang dipakai pada percobaan kloning dan transformasi Daftar plasmid yang digunakan pada konstruksi gen 30 5 Perunut yang digunakan 30 6 Distribusi gen-gen HD-Zip Famili I, II, dan III Oryza sativa Respons sejumlah gen Oshox terhadap cekaman abiotik pada tanaman padi Pencarian esxpressed sequence tag (EST) menggunakan cdna gen Oshox Ekspresi GUS pada tanaman transgenik poshox4-gus saat terpapar cekaman kekeringan Kandungan asam salisilat pada padi transgenik 65 viii

9 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Diagram alur penelitian karakterisasi gen regulator HD-Zip untuk ketahanan kekeringan dan introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis SA berasal dari bakteri untuk ketahanan penyakit blas. Garis titik-titik merupakan tujuan jangka panjang Mekanisme toleransi kekeringan dan respon tanaman saat terpapar kekeringan (Bartels & Sunkar 2004). Tanda panah menunjukkan arah pengaruh; kotak: bentuk respon sel; +: memberi pengaruh meningkatkan; -: memberi pengaruh menurunkan; ROS: spesies oksigen reaktif. Kotak menggambarkan proses dalam sel Penerimaan dan respon sel saat terpapar cekaman kekeringan. Kekeringan akan mengubah komposisi protein regulator atau fungsional sel untuk keperluan adaptasi sel (Yamaguchi-Shinozaki et al. 1997) Lintasan penghilangan ROS (spesies oksigen reaktif) pada tanaman (Mitler 2002). A. Siklus air-air. B. Siklus glutationaskorbat. C. Siklus glutation peroksidase (GPX). D. Katalase (CAT). PSI: fotosistem I; SOD: superoksida dismutase; MDA: monodihidroaskorbat; AsA: askorbat; tapx: tilakoid APX; DHA dihidroaskorbat; MDAR: MDA reduktase; GSH: glutation; GSSG: glutation teroksidasi; DHAR: DHA reduktase; GR: glutation reduktase Sistem dua komponen pada Escherichia coli dan Saccharomyces serevisiae (Kultz & Burg 1998). Huruf miring menunjukkan gen yang dipengaruhi Urutan asam amino dari protein homeodomain Drosophila melanogaster antp ( Daerah dengan tanda segitiga terbalik merupakan asam amino yang juga dimiliki oleh gen yang mengandung homeobox lainnya Model struktur protein HD-Zip. A. Protein HD-Zip terdiri dari dua motif. Motif HD berperan dalam pengikatan DNA pada ujung terminal N, sementara leucine zipper pada ujung terminal C berfungsi untuk dimerisasi. B. Model struktur pengikatan HD-Zip dengan DNA ( Ringkasan biosintesis asam salisilat. Tanda panah memperlihatkan alternatif sintesis asam salisilat pada tanaman. Tanda panah putusputus merupakan sintesis asam salisilat pada mikroorganisme melalui konversi langsung asam korismat menjadi asam salisilat. Tanda panah dengan titik-titik adalah lintasan produk perantara yang dapat dipakai untuk mensintesis asam salisilat pada mikroganisme Ringkasan peran asam salisilat dalam mengaktifkan sejumlah gen dan protein. : arah pengaruh; : arah yang dihambat; : bentuk ekspresi ix

10 10 Tahapan yang dilakukan dalam penelitian. Penelitian mempunyai dua bagian yang terdiri dari penggunaan HD-Zip (kotak) dan introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri (segitiga) untuk pembuatan padi transgenik Peta restriksi dari konstruksi untuk meningkatkan ekspresi gen Oshox4. 2 x 35S promoter: promoter ganda yang terdiri dari dua buah promoter 35S, Oshox4: daerah cdna Oshox4 pada koordinat , 35S terminator: polya dari 35S Denah perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4. X: tanaman transgenik. 20 tanaman transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4 ditanam dalam satu buah pot. Dua buah kelompok tanaman dipakai dalam percobaan ini untuk tiap-tiap galur yang dipakai Konstruksi vektor untuk menurunkan ekspresi Oshox4. Produk PCR sebesar 400 bp disisipkan sebagai sense pada sisi XhoI/EcoRI dan anti-sense pada sisi HindIII/BamHI pada vektor phannibal. Cassette phannibal SacI/PstI selanjutnya disisipkan pada vektor biner pc Konstruksi T-DNA pda vektor pc1391z mengandung promoter Oshox4. Promoter Oshox4 disisipkan pada sisi HindIII/NcoI. mcs: multiple cloning site, hph: hygromisin fosfotransferase, nos ter: terminator dari nofalin sintase, GUS: gen glukuronidase, RB: batas kanan, LB: batas kiri Peta restriksi dan konstruksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri. 35S: promoter 35S dari CaMV, ss: small subunit dari Rubisco, entc: gen penyandi isokorismat sintase dari E. Coli, pmsb: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari Pseudomonas fluorescens, PIT: terminator dari gen inhibitor proteinase kentang, angka menunjukkan ukuran nukleotida apabila dipotong dengan restriksi enzim tertentu Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan menggunakan gen salt sebagai penanda. Tanda panah menunjukkan terjadinya induksi gen salt pada tingkat transkripsi. j: jam Transkripsi gen Oshsp16.9 Oryza sativa: perlakuan kejut-panas diberikan selama 2 jam pada suhu 42 o C menggunakan analisis Northern. NB: Nipponbare; TP: Taipei. NB: Nipponbare; TP: Taipei; -: tanpa perlakuan kejut-panas; +: perlakuan kejut-panas Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman kejut panas. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perlakuan kejut-panas 42 o C selama 2 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan Pola transkripsi HD-Zip Oshox19 pada cekaman kekeringan. Tanda panah menunjukkan adanya induksi Pola transkripsi HD-Zip Oshox6 pada saat terpapar kekeringan. Tanda panah menunjukkan pola transkripsi terepresi Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman perendaman. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perendaman selama 4 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan x

11 22 Pola transkripsi HD-Zip Oshox23 pada cekaman kekeringan Pola transkripsi HD-Zip Oshox4 pada cekaman perendaman. Panah memperlihatkan induksi pada perendaman. NB: Nipponbare; Oshsp16.9: protein kejut panas Oryza sativa; perendaman selama 4 jam Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan pada Oshox4. Tanda panah menunjukkan terjadinya represi gen Oshox4 di tingkat transkripsi Pola transkripsi HD-Zip Oshox4 pada cekaman kejut-panas. Panah memperlihatkan represi pada kejut-panas. NB: Nipponbare; Oshsp16.9: protein kejut panas Oryza sativa; kejut-panas pada 42 o C selama 4 jam Skema pola ekson-intron Oshox4. Besarnya daerah ekson-intron ditunjukkan oleh angka yang menunjukkan jumlah nukleotida Homeodomain dan motif leucine zipper pada Oshox4. (A) Urutan asam amino daerah homeodomain Oshox4. Tiga heliks alfa Antennapedia (Antp) dari Drosophila ditunjukkan dengan garis. Residu protein yang umum dimiliki ditunjukkan dengan (Δ) warna hitam, sedangkan kesamaan Oshox4 dan Antp ditunjukkan dengan tanda (-). (B) Urutan asam amino daerah leucine-zipper dari Oshox4. Motif leucine yang berulang diperbandingkan dengan basic leucine zipper (bzip) dari C/EBP mamalia yang ditunjukkan dengan garis, sementara lokasi leusin diperlihatkan dengan tanda (L). (C) Homeodomain dan motif leucine zipper Oshox4. Posisi tiga heliks alfa dari homeodomain diletakkan pada kotak dan asam amino leusin pada urutan asam amino protein Fenotipe padi transgenik kultivar Nipponbare hasil transformasi menggunakan konstruksi Oshox4 yang dikontrol oleh promoter 35S. A. Verifikasi Northern pada tanaman dengan ekspresi Oshox4 yang meningkat. B adalah kontrol tanaman mengandung konstruksi pdr5-gus. C. Kelompok transgenik dengan tingkat Oshox4 yang meningkat dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif sedang, dan D. fenotipe pertumbuhan vegetatif tereduksi berat Analisis panjang ruas batang. Daerah berwarna gelap pada A dan B adalah 35S::Oshox4, sementara daerah berwarna putih pada A dan B adalah kontrol. C (sayatan transversal) dan D (sayatan longitudinal) pada ruas batang kontrol. E dan F adalah sayatan transversal dan longitudinal ruas batang padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4. Anak panah menunjukkan daerah sel yang diukur. Angka 1,2, dan 3 menunjukkan posisi ruas batang yang diamati Panjang daun bendera tanaman dengan Oshox4 yang berlebih. A. Panjang daun bendera; B. Panjang sel longitudinal dari daun bendera. C. Sayatan longitudinal daun bendera kontrol. D Sayatan longitudinal daun bendera tanaman 35S-Oshox xi

12 31 Fenotipe malai. A: Lemna/palea kontrol; B: Organ reproduksi kontrol; C: Polen kontrol (panah menunjukkan bentuk pollen normal). D: Lemna/palea 35S-Oshox4; E: Organ reproduksi 35S- Oshox4; F: Polen 35S-Oshox4 (panah menunjukkan bentuk polen normal); G: Jumlah bunga yang dihasilkan tiap malai dan jumlah bunga yang tidak menjadi biji (hampa), 35S-Oshox4 ditandai dengan warna abu-abu; H: Perbandingan panjang selubung daun dari daun bendera pada ruas batang pertama, ruas batang pertama ditandai dengan warna putih; I: perbandingan ukuran sumbu penikel, cabang primer dan sekunder, 35S-Oshox4 ditandai dengan warna abu-abu Fenotipe tanaman 35S-Oshox4 pada umur 2, 4, dan 10 bulan Pengujian ketahanan kekeringan Arabidopsis mengandung 35S-Oshox4 (AT1-10) dibanding kontrol (K-) Analisis Northern tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi menggunakan konstruksi Hannibal. A. Analisis Northern tanaman mengandung konstruksi PO4 dan T1 tanaman 35S- Oshox4. B. Analisis Northern tanaman transgenik Nipponbare mengandung konstruksi RNAi-Oshox4. Angka atau kode menunjukkan asal kalus Lokasi ekspresi gen GUS yang dikendalikan oleh promoter Oshox4 pada jaringan tanaman padi kultivar Nipponbare. A. Jaringan daun. B. Jaringan daun setelah diberikan perlakuan cekaman kekeringan 24 jam. C. Kecambah padi. D. Akar dengan potongan longitudinal. E. Akar dengan potongan transversal. F. Jaringan pembuluh pada daun. G. Lema dan palea. H. Potongan longitudinal benih padi. I. Embrio padi. V: jaringan pembuluh. SC: skutelum. PH: pembuluh floem Northern blot dari tanaman padi mengandung konstruksi asam salisilat asal mikrob dengan menggunakan higromisin fosfotransferase (hph) sebagai penanda. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus Northern blot menggunakan penanda entc pada tanaman padi transgenik Nipponbare mengandung biosintesis asam salisilat asal bakteri. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus. Angka yang tidak diikuti oleh kode huruf menunjukkan individu tanaman Southern blot dari tanaman transgenik padi mengandung konstruksi asam salisilat asal bakteri dengan menggunakan pmsb sebagai pelacak. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus Kandungan asam salisilat (SA) pada bibit padi berumur 2 minggu. SA ditunjukkan dengan warna putih, sedangkan SAG ditunjukkan dalam warna abu-abu. 64 xii

13 40 Model hipotetik Oshox4. Ekspresi Oshox4 dikontrol oleh cekaman lingkungan yang berakibat pada elongasi dan jumlah sel serta penundaan penuaan jaringan. -: merepresi; +: menginduksi; o: tidak mempengaruhi; : arah pengaruh; --- : pengaruh tidak langsung; titik-titik: pengaruh logis kekeringan Keterkaitan gen Oshox4 dan kandungan asam salisilat untuk meningkatkan ketahanan padi terhadap kekeringan dan penyakit blas. ---: pengaruh Oshox4 dan asam salisilat dari tanaman;.: pengaruh cekaman; tanda panah: arah pengaruh.. 71 xiii

14 DAFTAR SINGKATAN 35S-hph: konstruksi gen resistensi antibiotik higromisin (higromisin fosfotransferase) di bawah kendali promoter 35S dari CaMV 35S-Oshox4: konstruksi cdna Oshox4 di bawah kontrol promoter 35S dari CaMV ABA: abscisic acid (asam absisat) ABF: ABA binding factor ABRE: ABA responsive element Ac/Ds: elemen loncat association/dissociation dari jagung AP2: apetala2 AREB: ABA responsive element binding as-1: activating sequence 1 AtHK1: Arabidopsis thaliana histidine kinase 1 BA: Asam benzoate BA2H: Asam benzoat 2-hidroksilase bzip: basic leucine zipper CaM: kalmodulin CBF: C-repeat/dehydration responsive element binding factor CBL: calciuneurin B-like CDPK: calcium dependent protein kinase CE: coupling element CIPK: CBL interacting protein kinase cor15a: cold-regulated 15A CRT: C-repeat DNA: asam deoksiribonukleat DR5-GUS konstruksi gen GUS yang dikontrol oleh promoter DR5 DRE: dehydration responsive element DREB: dehydration responsive element binding EDTA: ethylene diamine tetracetic acid Em1a: elemen respons ABA pada promoter gen Em (early methionine labelled polypeptide) dari gandum (Triticum aesticum) dengan sekuens GACACGTGGC Em1b: elemen respons ABA pada promoter gen Em (early methionine labelled polypeptide) dari gandum (Triticum aesticum) CACACGTGCC EmBP: DNA binding protein dari kelas b-zip yang berikatan dengan gen Em entc: gen penyandi isokorismat sintase dari Escherichia coli EnvZ: osmosensor pada sistem dua komponen Escherichia coli EREBP: ethylene responsive element binding protein FAO: Food and Agriculture Organization GS: glukosil salisilat GST: glutation S-transferase GNT35: GST Nucotiana tabaccum HD: homeodomain HD-BELL: kelompok anggota homeodomain xiv

15 HD-GLABRA2: kelompok anggota homeodomain HD-knotted1: kelompok anggota homeodomain HD-Zip: homeodomain leucine zipper HOG1: high osmolarity glycerol 1 HOT(D): 13-hidroksi oktadekatri(di)enoik HPOT(D): 13-hidroksiperoksi-oktadekatri(di)enoik HR: respon hipersensitif HVA1: barley (Hordeum vulgare) aleuron LEA protein ICS: isokorismat synthase IPL: isokorismat piruvat liase IRRI: International Rice Research Institute JA: asam jasmonat kn1: gen homeobox yang pertama kali diidentifikasi berasal dari tanaman (Zea mays) KNOX: kelompok anggota homeodomain LEA: late embryonic abundant Lti78: low-temperature-induced LTRE: low temperature responsive element MADS-box: faktor transkripsi pada perkembangan bunga MAPK: mitogen activated protein kinase MAPKK: MAPK kinase MAPKKK: MAPK kinase kinase MSA: metil asam salisilat nahg: gen penyandi salisilat hidroksilase pada Psudomonas putida NHI1: NPR-homolog 1 NIM1: nama lain untuk NPR1 NPR1: non-expresser of PR genes 1 OmpR: regulator respons pada sistem dua komponen Escherichia coli OSBZ8: Oryza sativa b-zip padi yang terinduksi kuat oleh ABA Oshox: Oryza sativa homeobox OsZIP-1a: homolog EMBP1 otsa: penyandi biosintesis trehalose dari Escherichia coli otsb: penyandi biosintesis trehalose dari Escherichia coli p5cs: pyrroline-5-carboxylate reductase PCR: polymerase chain reaction PHD-finger: plant homeodomain finger pmsb: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari Pseudomonas fluorescens PO4 konstruksi promoter Oshox4 yang difusikan dengan gen GUS PR: pathogenesis related protein PR: pathogenesis related protein rab18: responsive ABA 18 rd28a: responsive to dehydration rd29a: responive dehydration29a RNA: asam ribonukleat RNAi: RNA interference RNAi-Oshox4: konstruksi RNAi untuk menekan transkripsi gen Oshox4 ROS: spesies oksigen reaktif xv

16 SA GTase: SA: SABP: sacb: SAG: SAR: SCOF-1: SDS: sid1: SLN1: SNI1: SSDB: SSK1: TAIL: TALE: T-DNA: TF: TGA: TMV: Vahox1: WRKY: YPD1: UDP-glukosa SA glukosiltransferase salicylic acid SA binding protein gen penyandi fruktan dari Bacillus subtilis SA 2-O-β-D-glukosida systemic acquired resistance faktor transkripsi dari kedelai sodium dodecyl sulfate SA-induced defence homolog OmpR pada sistem dua komponen Saccharomyces cereviseae suppressor of npr1 inducible sequence specific DNA-binding homolog OmpR pada sistem dua komponen Saccharomyces cereviseae thermal asymmetric interlaced 3-aa acid loop extension utas nukleotida yang merupakan bagian dari sistem penginduksi tumor yang dimiliki oleh Agrobacterium tumefaciens yang terintegrasi dalam genom tanaman faktor transkripsi faktor transkripsi anggota dari bzip tobacco mosaic virus HD-Zip tomat yang berperan dalam program cell death kelas faktor transkripsi yang ditandai dengan urutan asam amino WRKYGQK pada ujung N domain DNA-binding. protein penyambung antara SLN1 dan SSK1 xvi

17 PENDAHULUAN Formatted: Different first page header 1 Latar belakang Padi (Oryza sativa L.) merupakan salah satu tanaman pangan pokok penting dunia yang dikonsumsi oleh sekitar tiga miliar penduduk dunia. Di Indonesia padi merupakan tanaman yang bernilai strategis karena lebih dari 50% dari total kalori penduduk Indonesia berasal dari padi (beras). Oleh karena itu Faktor tersebut yang menyebabkan padi dibudidayakan secara intensif baik melalui usaha intensifikasi maupun ekstensifikasi. Dua dari 23 spesies genus Oryza yaitu Oryza O. sativa dan Oryza glaberrima merupakan spesies yang dibudidayakan sejak lama (Ge et al. 1999). Di Indonesia, produksi padi ditingkatkan dari tahun ke tahun, dari 1.76 ton/ha pada tahun 1961 menjadi 4.57 ton/ha pada tahun Sejumlah kultivar dari spesies ini telah dikembangkan pada lahan budidaya sawah antara lain melalui penggunaan IR36 pada tahun 1976, PB 42 dan Cisadane di tahun 1980, IR64 padasaat tahun 1985, dan Mamberamo pada tahun Usaha intensifikasi dengan penggunaan kultivar-kultivar tersebut merupakan salah satu faktor yang mengantarkan Indonesia pada swasembada beras pada tahun Seiring dengan berjalannya waktu, usaha intensifikasi dengan kultivar terbatas, dandan luasan lahan sawah yang tetap tidak dapat memenuhi kebutuhan konsumsi beras di Indonesia yang terus meningkat. Konsumsi beras di Indonesia pada tahun 2000 mencapai 30.8 juta ton dan diprediksi pada tahun 2020 akan menjadi 42.3 juta ton. Dengan kondisi tersebut, Indonesia harus mengimpor beras untuk mencukupi kebutuhan beras nasional. Impor beras pada akhir 2005 telah mencapai 70 ribu ton (BPS 2005).. Jika produksi beras nasional konstan tiap tahun dan lahan pertanian sekitar 0.1 juta ha, maka untuk mencukupi kebutuhan beras tersebut diperlukan lahan baru sekitar 600 juta (BPS, 2005). Pada saat ini lahan sawah sudah jenuh oleh sistem pertanaman yang sudah ada, sehingga upaya untuk meningkatkan produksi padi nasional sebaiknya diarahkan pada areal tanam di lahan-lahan marginal dengan sistem pertanian padi padi lahan kering, gogo, dan gogorancah (perpaduan sistem gogo dan sawah). Masalahnya, lahan-lahan marginal yang ada biasanya mempunyai kendala dalam

18 2 ketersediaan air yang berpotensi untuk terpaparnya tanaman padi oleh kondisi kekeringan. Kira-kira 90% budidaya padi dipengaruhi oleh kekeringan yn.ang dapat Terpaparnya padi oleh kondisi kekeringan bisa berakibat pada menurunnya produktivitas. Untuk menjaga produktivitas padi di lahan-lahan tersebut perlu dikembangkan kultivar yang beradaptasi dengan lahan kering dan bermenghasilkan produksi tinggi. Pemuliaan konvensional dengan bantuan marka molekular atau melalui rekayasa genetika telah dikembangkan untuk mendapatkan varietas padi tahan kekeringan (O toole 2004). Caranya adalah dengan mengintroduksi sifat tahan kering melalui protein fungsional dengan tujuan mengatur dan melindungi metabolisme sel padi serta mendetoksifikasi senyawa beracun selama tanaman padi tercekam terpapar kekeringan. Pendekatan lain yang potensial untuk dikembangkan guna mendapatkan padi tahan kekeringan adalah dengan mengontrol gen protein regulator yaitu gen protein yang berperan dalam mengatur ekspresi protein gen fungsional. Dengan mengontrol gen protein regulator diharapkan dapat mengatur ekspresi sejumlah gen protein fungsional atau regulator lain yang berada di bawah kendali gen protein regulator tersebut. Salah satu keluarga gen protein regulator yang hanya terdapat pada tanaman adalah gen yang mengkode protein homeodomain leucine zipper (HD-Zip). Protein HD-Zip dicirikan oleh adanya homeodomain yang berdampingan langsung dengan motif leusin zipper. yang berulang. Protein HD- Zip merupakan faktor transkripsi yang memiliki peran penting pada tanaman dalam merespon sinyal lingkungan (Schena et al. 1993), termasuk salah satunya sinyal terhadap kekeringan. Berkaitan dengan tanaman padi, sejumlah gen HD-Zip padi telah diidentifikasi (Meijer et al. 2000). Salah satu gen dari famili HD-Zip II padi, yaitu gen Oshox1 diperkirakan berfungsi dalam perkembangan tanaman antara lain sebagai penentu spesifikasi sel pada perkembangan jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000; Scarpella et al. 2002). Walaupun demikian, respon gen-gen HD-Zip padi pada saat mengalami cekaman abiotik, misal: kekeringan, belum pernah dievaluasi. Oleh sebab itu perlu dilakukan karakterisasi ggen HD-Zip padi yang Formatted: Indent: First line: 0,95 cm

19 3 memiliki potensi untuk dimanfaatkan pada program perbaikan genetik tanaman padi tahan kekeringan. Sampai saat ini belum pernah dilakukan kkarakterisasi dan analisis fungsional untuk memahami fungsi dari gen-gen famili HD-Zip. sampai saat ini belum pernah dilakukan. Untuk mengetahui fungsi gen dalam suatu tanaman dapat dipelajari melalui 3 metode yaitu dengan meningkatan tingkat ekspresinya (over expression), menghilangkan ekspresi (knockout), dan mengidentifikasi pola ekspresi gen tersebut. Meskipun metode kontrol protein regulator gen HD-Zip diharapkan dapat mengatasi akibat buruk yang ditimbulkan oleh kondisi kekeringan, namun dibutuhkan pendekatan lain untuk mengembangan sistem pertahanan tanaman padi pada saat terpapar kekeringan. Cekaman kekeringan mengakibatkan tanaman padi rentan terhadap cekaman lain termasuk cekaman biotik, misalnya penyakit blas. Kondisi tanah yang aerob, kekeringan, dan kandungan nitrogen yang tinggi pada tanah merupakan kondisi ideal bagi berkembangnya Magnaporthe grisea. Magnaporthe grisea merupakan cendawan yang menyebabkan bertanggung jawab pada munculnya penyakit blas. Penyakit blas menyerang sampai 12% dari luas areal padi di Indonesia (Utami et al. 2005). Oleh sebab itu penyakit blas merupakan penyakit penting pada areal pertanian padi sistem sawah dan gogo. Ketahanan tanaman padi terhadap penyakit blas, terutama pada saat kondisi kekeringan, dapat ditingkatkan melalui kontrol sinyal yang berperan dalam mekanisme pertahanan biotik seperti asam salisilat (SA). Hasil penelitian yang ada menunjukkan bahwa kandungan asam salisilat pada padi berkorelasi positif dengan ketahanan terhadap serangan blas (Silverman et al. 1995). Pada tanaman dan mikroorganisme, asam salisilat atau produk perantaranya disintesis melalui beberapa lintasan metabolime. Asam salisilat dapat dibentuk melalui lintasan fenilalanin atau asam korismat. Lintasan biosintesis asam salisilat melalui isokorismat adalah lintasan penting untuk ketahanan tanaman terhadap cekaman biotik (Wildermuth et al. 2001). Jika produksi asam salisilat melalui isokorismat dapat ditingkatkan maka diharapkan ketahanan tanaman padi dapat meningkat. Asam salisilat dapat diproduksi dengan mengubah asam korismat menjadi isokorismat oleh enzim isokorismat sintase yang selanjutnya dikonversi menjadi asam salisilat oleh enzim isokorismat piruvat liase. Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden)

20 4 Sejumlah mikroorganisme memiliki gen yang mengkode kedua enzim tersebut. Escherichia E. coli memiliki gen entc yang menyandi enzim isokorismat sintase sedangkan Pseudomonas fluorescens memiliki gen pmsb yang menyandi iso-korismat piruvat liase. Masing-masing gen tersebut memerlukan promoter tanaman agar dapat terekspresi pada sel tanaman. Introduksi kedua gen tersebut ke dalam tembakau di bawah kendali promoter virus tanaman memperlihatkan peningkatan ketahanan terhadap penyakit pada tembakau transgenik (Verberne et al. 2000). Konstruksi gen yang menyandi kedua enzim ini telah tersedia untuk penelitian, sehingga. Dengan demikian, gen-gen iso-korismat sintase dan iso-korismat piruvat liase dapat ditransformasikan ke dalam tanaman padi dan ekspresinya diharapkan dapat meningkatkan konsentrasitingkat asam salisilat pada tanaman padi. Tingkat asam salisilat yang tinggi diharapkan dapat menjadi pembatas terhadapcegah serangan penyakit blas pada padi. 2 Tujuan dan manfaat penelitian 2.1 Tujuan penelitian Secara umum, tujuan penelitian ini adalah meningkatkan ketahanan tanaman padi terhadap kekeringan dan penyakit blas dengan menganalisis fungsi gen famili HD-Zip padi yang respon terhadap kondisi kekeringan dan mengintroduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat untuk ketahanan terhadap penyakit blas. Perakitan tanaman padi yang tahan kekeringan dan penyakit blas diharapkan dapat membantu pengembangan penanaman padi dengan sistem lahan kering pada lahan marginal. Dampak dari perluasan penanaman padi di lahan-lahan marginal ini akan meningkatkan produksi beras nasional dan mengurangi jumlah impor beras. Sedangkan tujuan khusus penelitian ini adalah untuk: (i) mengkarakterisasi salah satu gen tanaman padi keluarga HD-Zip yang diketahui memperlihatkan respon saat padi tercekamterpapar kekeringan setelah dilakukan penapisan gen-gen HD-Zip padi yang merespon cekaman kekeringan; (ii) mengintroduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yang berasal dari bakteri ke dalam genom tanaman padi. Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold

21 5 Untuk merealisasikan tujuan tersebut dilakukan serangkaian percobaan dilakukan yang meliputi: (1) penapisan gen HD-Zip yang merespon kekeringan, (2) peningkatkan ekspresi (overexpression) gen Oshox4 yang merupakan salah satu gen HD-Zip di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV, (3) penghilangan (knockout) atau penurunan (knockdown) ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi, (4) studi pola ekspresi gen Oshox4, (5) transformasi gengen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yaitu gen entc dan gen pmsb ke tanaman padi, (6) analisis integrasi dan ekspresi gen entc dan gen pmsb pada level transkripsi dengan analisis Southern dan Northern, dan (7) analisis kandungan asam salisilat pada tanaman trangenik. Secara keseluruhan diagram alur penelitian disajikan pada Gambar Manfaat penelitian Manfaat yang diperoleh dari hasil penelitian karakterisasi gen-gen famili HD-Zip terhadap cekaman kekeringan adalah tersedianya informasi tentang gen HD-Zip yang responsif terhadap cekaman kekeringan. Manfaat lebih jauh adalah diperoleh sumber gen yang dapat digunakan sebagai gen donor untuk merakit padi transgenik yang tahan kekeringan. Hasil yang diperoleh dari penelitian introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yang berasal dari bakteri ke dalam genom tanaman padi adalah selain diperoleh tanaman transgenik padi dengan kandungan asam salisilat tinggi, juga menghasilkan tanaman padi transgenik yang tahan terhadap penyakit blas. Tanaman ini dapat dipakai untuk mengembangkan usaha ekstensifikasi tanaman padi pada lahan-lahan marginal yang biasanya mengalami kondisi kekeringan yang berakibat tanaman padi menjadi rentan terhadap penyakit blas.

22 6

23 7 TINJAUAN PUSTAKA 1 Kekeringan 1.1 Budidaya padi dan kekeringan Tanaman padi telah dibudidayakan di berbagai kondisi lingkungan seperti sawah tadah hujan, air-dalam, pasang surut, ladang atau/ gogo, dan sawah irigasi (FAO 2004). Tanaman padi yang dibudidayakan saat ini adalah hasil evolusi tanaman padi semiakuatik (O toole 2004). Proses seleksi buatan dan seleksi alam telah memungkinkan padi dibudidayakan pada lahan kering dan basah. Budidaya padi lahan kering meliputi budidaya padi ladang dan gogo, sedangkan budidaya lahan basah meliputi budidaya padi di sawah, rawa, lebak, dan air-dalam. Istilah ladang dipakai untuk sistem pada pertanian lahan berpindah yang menghendaki adanya pembukaan lahan pada awal siklusnya, sedangkan sistem gogo tidak mengenal pembukaan lahan. Sistem gogo dan sawah dapat dipadukan menjadi sistem gogorancah. Pada sistem padi sawah, air merupakan kebutuhan mutlak. Sumber air pada sawah dapat berasal dari irigasi, tadah hujan, pasang surut, rawa pasang surut, dan lebak. Luas areal pertanaman padi di Indonesia diperkirakan 11 juta hektar meliputi 69% sawah beririgasi, 16% lahan tadah hujan, dan 15% sawah pasang surut (Suprapto 2002). Kira-kira 16-20% dari total luas areal pertanaman padi di Indonesia tersebut rentan terhadap cekaman kekeringan (Pandey & Bhandari 2006). Kekeringan merupakan masalah utama pada budidaya padi sistem sawah tadah hujan dan gogo. Kekeringan juga dapat mengancam sawah irigasi yang terjadi akibat meningkatnya tingkat kerusakan di daerah aliran sungai yang berpengaruh pada ketersediaan air irigasi sepanjang tahun. Sistem budidaya padi air-dalam juga rentan kekeringan jika pada saat bibit tidak segera mendapat air. Kekeringan dapat ditinjau dari sudut pandang meteorologi, hidrologi, dan pertanian. Kekeringan dari segi meteorologi didefinisikan sebagai kurangnya curah hujan dari rata-rata curah hujan normal pada suatu periode waktu tertentu. Kekeringan secara hidrologi merupakan keadaan ketika jumlah air yang tersedia lebih sedikit daripada jumlah air yang dibutuhkan. Di bidang pertanian, jumlah air yang tidak mencukupi untuk pertumbuhan optimal tanaman pertanian merupakan

24 8 definisi kekeringan (Jodo 1995) sehingga kekeringan tidak selalu berhubungan dengan kurangnya curah hujan. Kekeringan memberi pengaruh pada tekanan osmosis sel tanaman (Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 1997). Cekaman kekeringan memiliki pengaruh yang nyata pada penurunan produktivitas tanaman. Kekeringan dapat mengancam budidaya padi pada fase vegetatif dan generatif. Tinggi tanaman, jumlah anakan, dan luas daun adalah hal yang terpengaruh jika cekaman kekeringan terjadi pada fase vegetatif. Penurunan jumlah malai dapat terjadi apabila padi terpapar kekeringan pada fase generatif. Cekaman kekeringan terjadi apabila jumlah air yang terbatas telah berpotensi untuk mengakibatkan kerusakan pada proses fisiologi. Kondisi ini mempengaruhi sifat fisik tanah, komposisi hara tanah, dan interaksi biologi tanaman padi dengan hama, penyakit, dan tanaman lainnya. Kondisi tanah yang aerobik, cekaman kekeringan, dan kandungan nitrat tinggi merupakan kondisi ideal bagi berkembangnya penyakit blas yang disebabkan oleh Magnaporthe grisea. Tanaman akan memberikan respon yang berbeda-beda bila dihadapkan pada kondisi yang kurang menguntungkan bagi lingkungan tumbuhnya. Ada sekelompok tanaman yang mampu bertahan sementara kelompok lainya tidak bisa bertahan pada kondisi cekaman yang sama. Ketahanan terhadap kekeringan dapat berarti kestabilan hasil atau kemampuan bertahan pada kondisi kekeringan (Price et al. 2002). Strategi tahan yang dikembangkan dapat dikelompokkan menjadi tiga, yaitu melarikan diri (escape), menghindar (avoidance), dan toleran membiarkan diri terpaparterhadap cekaman (tolerance). Tanaman tidak terpapar cekaman kekeringan pada strategi escape dan avoidance karena tanaman mampu menghindari cekaman kekeringan dengan mempertahankan kandungan air yang ada. Apabila ketersediaan air tanaman terganggu, tanaman akan memberikan respon untuk tujuan mentoleransi cekaman (Gambar 2). Kekeringan mengakibatkan akumulasiu racun meningkat sehingga tanaman perlu menetralisasi racun tersebut. Di samping itu, perlu mengontrol pertumbuhan dan memperbaiki kerusakan yang ada. Sebagai akibatnya, pembelahan dan elongasi sel menjadi tertahan atau menjadi berkurang (Bartels & Sunkar 2005).

25 9 Gambar 2 Mekanisme toleransi kekeringan dan respon tanaman saat terpapar kekeringan (Bartels & Sunkar 2005). Tanda panah menunjukkan arah pengaruh; kotak: bentuk respon sel; +: memberi pengaruh meningkatkan; -: memberi pengaruh menurunkan; ROS: spesies oksigen reaktif. Kotak menggambarkan proses dalam sel. Padi tahan kering yang ideal adalah padi yang memberikan hasil panen lebih tinggi dibandingkan padi lain apabila terpapar pada cekaman kekeringan dan tetap berpenampilan baik bila tidak ada cekaman kekeringan (Fukai & Cooper 1995). Sifat yang terdapat pada padi tahan kering dapat dibedakan menjadi sifat yang secara konstitutif terekspresi atau sifat yang responsif hanya bila ada kekeringan (Blum 2002; Blum 2005). Sifat konstitutif tidak dipengaruhi oleh ada tidaknya cekaman. Sifat responsif muncul pada saat tanaman terkena cekaman kekeringan dan merupakan proses adaptasi tanaman. Yang ttermasuk sifat yang konstitutif adalah pemrbungaan, akar, sifat permukaan daun, kemampuan tetap hijau, dan kandungan karbohidrat dan nitrogen batang. Beberapa sifat yang termasuk responsif adalah munculnya senyawa dan protein pelindung dari keracunan akibat kekeringan serta perubahan komposisi ekspresi protein.

26 Cekaman kekeringan: respon tanaman dan upaya rekayasa genetika untuk meningkatkan toleransi tanaman Sejumlah faktor menentukan bentuk respon padi terhadap kekeringan. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tahap perkembangan, dan tipe sel. Bentuk respon faktor tersebut ditentukan oleh jumlah air yang hilang dan laju kehilangan air (Bray 1993; Bray 1997). Laju kehilangan air yang lambat diperlukan untuk mengurangi proses kerusakan sel sehingga memungkinkan tanaman dapat kembali pada kondisi semula. Tiga aspek penting dalam kemampuan tanaman untuk kembali ke kondisi semula adalah (1) homeostatis ion; kontrol kerusakan, perbaikan, (2) detoksifikasi akibat cekaman; dan (3) kontrol pertumbuhan (Zhu 2002). Laju kehilangan air yang cepat berakibat pada hilangnya kemampuan sel untuk kembali pada kondisi fisiologi normal. Kekeringan memberikan cekaman osmotik yang mempengaruhi tekanan turgor sel dan cekaman oksidatif. Keseimbangan ion intraseluler menjadi terganggu pada saat terjadi cekaman kekeringan. Sel akan mensintesis senyawa tertentu yang berfungsi menyeimbangkan tekanan. Sel juga akan menghasilkan protein yang mampu melindungi sel dari keracunan dan memperbaiki kerusakan sel pada saat yang sama. Disamping itu, sel akan mengaktifkan atau menonaktifkan sejumlah gen untuk merespon cekaman kekeringan yang diterimanya. Gen dengan pola ekpresi yang responsif merupakan gen yang terlibat dalam mekanisme adaptif padi terhadap kekeringan. Hasil respon ekspresi gen mempunyai fungsi dalam mekanisme mentolerir cekaman dan juga mengatur ekspresi dan penyampaian sinyal ketahanan terhadap cekaman kekeringan (Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki 2005). Sejumlah gen yang teraktivasi umumnya terkait dengan fungsi perbaikan dan kontrol kerusakan serta detoksifikasi (Zhu 2002). Toleransi cekaman kekeringan juga melibatkan represi dari sejumlah gen. Transkripsi dari gen-gen yang terlibat dalam fotosintesis pada tanaman Craterostigma plantagineum dilaporkan mengalami penurunan ekspresi pada saat tanaman terpapar kekeringan (Ingram & Bartels 1996). Proses ini diperlukan untuk proses toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan. Gen-gen yang merespon cekaman kekeringan dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok besar (Gambar 3). Kelompok pertama adalah gen yang menyandi

27 11 protein yang berfungsi langsung dalam melindungsi sel (protein fungsional). Kelompok kedua adalah gen yang menyandi protein yang mengatur ekspresi gen lain pada saat cekaman kekeringan (protein regulator) (Yamaguchi-Shinozaki et al. 2002). Apabila intensitas cekaman kekeringan yang diteriman sel meleibihi batas kemampuan yang dapat diterimanya maka sel akan menghancurkan dirinya sendiri melalui apoptosis. Gambar 3 Penerimaan dan respon sel saat terpapar cekaman kekeringan.kekeringan akan mengubah komposisi protein regulator atau fungsional sel untuk keperluan adaptasi sel (Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 1997). Proses adaptasi terhadap cekaman diawali dengan pengindraan dan penyampaian sinyal secara berurutan yang dikategorikan sebagai proses jangka pendek. Lokasi subseluler dari reseptor dan jumlah reseptor yang terlibat dalam pengindraan cekaman kekeringan masih belum jelas (Ingram & Bartels 1996; Bray 1997). Respon jangka pendek memiliki peran dalam respon jangka panjang (Chaves et al. 2003). Respon jangka panjang dapat berbentuk antara lain penggulungan daun, pengurangan laju respirasi, dan elongasi akar. Cekaman oksidatif sebagai akibat cekaman kekeringan mengakibatkan peningkatan unsur senyawa species reaktif oksigen (ROS) (Vranova et al. 2002). Senyawa-senyawa ini dapat merusak komponen utama sel seperti lemak, protein,

28 12 karbohidrat, dan asam nukleat (Blokhina et al. 2003). Dalam kondisi ini dibutuhkan protein yang berperan dalam mekanisme detoksifikasi dan proteksi sel. Tanaman memiliki sejumlah enzim dan antioksidan yang berfungsi menetralkan ROS (Rodriguez & Redman 2005). Peningkatan ROS akan diubah oleh sejumlah enzim seperti katalase dan askorbat peroksidase sehingga jumlahnya menurun pada saat cekaman abiotik (Mittler 2002) (Gambar 4). - Superoksida dismutase (SOD) pertama sekali mengkonversi O 2 menjadi H 2 O 2. Askorbat peroksidase (APX), GPX, dan CAT selanjutnya akan mendetoksifikasi H 2 O 2. Askorbat (AsA) dibutuhkan oleh APX sementara glutation (GSH) dibutuhkan oleh GPX untuk regenerasi siklus pda gambar 4A-4C. Siklus ini menggunakan elektrron yang dihasilkan dari fotosintesis (4A) atau NAD(P)H Ekspresi superoksida dismutase pada alfalfa (Medicago sativa L.) transgenik mampu meningkatkan toleransi terhadap cekaman kekeringan (Samis et al. 2002). Ekspresi katalase kate dari Escherichia E. coli pada kloroplas tembakau mampu menahan laju hilangnya klorofil pada saat kekeringan (Miyagawa et al. 2000). Lintasan penyampaian sinyal cekaman kekeringan dimulai dari penerimaan sinyal. Sinyal akan diteruskan oleh caraka ke dua. Caraka ke dua pada proses ini adalah inositol fosfat dan unsur ROS. Caraka ke dua memiliki peran antara lain mengatur kadar Ca +2 intraseluler, mengawali proses fosforilasi protein target yang terlibat dalam fungsi proteksi, dan juga mengontrol faktor transkripsi (Xiong et al. 2002; Boudsocq & Lauriere 2005). Kekeringan akan menaikkan konsentrasi kalsium bebas di sitosol ([Ca +2 ] Cyt ) melalui ROS. Kondisi ini merangsang pembukaan saluran kalsium pada membran vakuola (Finkelstein et al. 2002). Perubahan kalsium ditingkat seluler diterima oleh protein pengikat kalsium dan sensor molekul. Perubahan ini mampu menginduksi sejumlah gen antara lain gen p5cs, rab18 (Lang & Palva 1992; Lang et al. 1994), dan Iti78 (Knight et al. 1997). Sensor Ca +2 tumbuhan antara lain adalah kalmodulin (CaM) (Zielinski 1998; Snedden & Fromm 1997; Luan et al. 2002), protein kinase yang mengandung domain CaM (CDPK) (Sanders et al. 2002), dan calcineurin B-like (CBL). Sensor kalsium mempunyai pola pengaturan yang berbeda pada respon cekaman kekeringan, salinitas, dan suhu rendah (Cheong et al. 2003). CDPK berfungsi sebagai sensor dan kinase. CaM dan CBL merupakan protein yang mengikat Ca +2. Formatted: Pattern: Clear

29 13 Keduanya berfungsi melalui interaksi dengan protein target. Protein kinase yang berinteraksi dengan CBL (CIPK) adalah protein target dari CBL (Luan et al. 2002). Calcineurin B merupakan homolog sensor kalsium SOS3 dari yeast berperan pada ketahanan salinitas (Liu & Zhu 1998). CBL1 merupakan regulator positif untuk kekeringan dan salinitas. CBL1 juga menjadi regulator negatif untuk suhu rendah. CIPK3 diidentifikasi berperan dalam hubungan-lintas interaksi antara asam absisat (ABA) dan lintasan transduksi sinyal abiotik (Kim et al. 2003).

30 14 Gambar 4 Lintasan penghilangan ROS (spesies oksigen reaktif) pada tanaman(mitler 2002). A. Siklus air-air. B. Siklus glutation-askorbat C. Siklus glutation peroksidase (GPX). D. Katalase (CAT). PSI fotosistem I; SOD: superoksida dismutase; MDA monodihidroaskorbat; AsA: askorbat; tapx: tilakoid APX; DHA dihidroaskorbat; MDAR: MDA reduktase; GSH: glutation; GSSG glutation teroksidasi; DHAR: DHA reduktase; GR: glutation reduktase. Lintasan penyampaian sinyal cekaman kekeringan dimulai dari penerimaan sinyal. Sinyal akan diteruskan oleh caraka kedua. Caraka kedua pada proses ini adalah inositol fosfat dan unsur ROS. Caraka kedua memiliki peran antara lain mengatur kadar Ca +2 intraseluler, mengawali proses fosforilasi protein target yang terlibat dalam fungsi proteksi, dan juga mengontrol faktor transkripsi (Xiong et al. 2002; Boudsocq & Lauriere 2005). Kekeringan akan menaikkan konsentrasi kalsium bebas di sitosol ([Ca +2 ] Cyt ) melalui ROS. Kondisi ini merangsang pembukaan saluran kalsium pada membran vakuola (Finkelstein et al. 2002).

31 15 Perubahan kalsium ditingkat seluler diterima oleh protein pengikat kalsium dan sensor molekul. Perubahan ini mampu menginduksi sejumlah gen antara lain gen p5cs, rab18 (Lang & Palva 1992; Lang et al. 1994), dan Iti78 (Knight et al. 1997). Sensor Ca +2 tumbuhan antara lain adalah kalmodulin (CaM) (Zielinski 1998; Snedden & Fromm 1997; Luan et al. 2002), protein kinase yang mengandung domain CaM (CDPK) (Sanders et al. 2002), dan calcineurin B-like (CBL). Sensor kalsium mempunyai pola pengaturan yang berbeda pada respon cekaman kekeringan, salinitas, dan suhu rendah (Cheong et al. 2003). CDPK berfungsi sebagai sensor dan kinase. CaM dan CBL merupakan protein yang mengikat Ca +2. Keduanya berfungsi melalui interaksi dengan protein target. Protein kinase yang berinteraksi dengan CBL (CIPK) adalah protein target dari CBL (Luan et al. 2002). Calcineurin B merupakan homolog sensor kalsium SOS3 dari yeast berperan pada ketahanan salinitas (Liu & Zhu 1998). CBL1 merupakan regulator positif untuk kekeringan dan salinitas. CBL1 juga menjadi regulator negatif untuk suhu rendah. CIPK3 diidentifikasi berperan dalam hubungan-lintas interaksi antara asam absisat (ABA) dan lintasan transduksi sinyal abiotik (Kim et al. 2003). Sel dapat menerima cekaman kekeringan dengan menggunakan sistem dua komponen (Gambar 5). Sistem dua komponen pada Escherichia E. coli terdiri dari osmosensor EnvZ dan regulator respon OmpR. Keduanya mentransmisikan informasi cekaman osmotik dari permukaan sel. Sistem dua komponen pada eukariotik memiliki sinyal tambahan berupa modul mitogen-activated protein kinase (MAPK). Modul ini dibutuhkan untuk membawa informasi tentang cekaman osmotik ke tingkat ekspresi gen. Homologi sistem dua komponen pada kapang terdiri dari osmosensor SLN1, protein penyambung YPD1, dan respon regulator SSK1. Pada kondisi osmotik normal, SLN1 aktif secara konstitutif dan memfosforilasi regulator respon SSK1. SSK1 yang aktif akibat fosforilasi akan menekan aktivitas dua MAPKKK yaitu SSK2 dan SSKK2. Represi ini menonaktifkan modul MAPK sehingga high osmolarity glycerol 1 (HOG1) menjadi tidak aktif. HOG1 memiliki fungsi menginduksi ekspresi faktor transkripsi yang induktif untuk selanjutnya mengaktifkan gen yang menjadi target. Homologi SLN1 pada tumbuhan adalah protein transmembran histidin kinase dari

32 16 Arabidopsis thaliana (AtHK1). Sel tumbuhan yang mengkerut akibat cekaman osmotik menjadi rangsangan mekanik. Protein AtHK1 diduga merupakan osmosensor yang mengontrol sinyal cekaman pada modul MAPK (Urao & Yamaguchi-Shinozaki 2002). Gen responsif cekaman kekeringan dapat memiliki elemen cis dan atau trans (Ingram & Bartels 1996; Shinozaki et al. 2003; Rabbani et al. 2003). Beberapa gen-gen terinduksi ABA mempunyai elemen cis- yang responsif terhadap ABA (ABRE; ACGTGG/TC) pada daerah promoter (Bonetta & McCourt 1998). Beberapa faktor basic region leucine zipper (bzip) EmBP1, OSBZ8, dan oszip- 1a yang berikatan dengan ABRE telah diisolasi (Ko & Kamada 2002). Promoter gandum HVA1 mempunyai elemen CE3 (ACGCGTGTCCTG)) dan ABRE. Elemen CE menginduksi ekspresi gen melalui ABA (Shen & Ho 1995). Walaupun demikian, urutan basa A/GCGT tidak mutlak diperlukan sebagai bagian dari CE (Rogers & Rogers 1992; Shen & Ho 1995; Kao et al. 1996; Hobo et al. 1999). Jumlah salinan ABRE dapat meningkatkan respon gen oleh ABA (Skriver et al. 1991). Promoter gandum Em memiliki dua motif ABRE yaitu Em1a dan Em1b yang memiliki peran besar dalam aktivasi gen (Guiltinan et al. 1990). Gen dengan ABRE pada daerah promoter akan diaktifkan oleh faktor trans. AREB1, AREB2, dan AREB3 merupakan faktor transkripsi dari tipe bzip yang berperan sebagai protein yang berikatan dengan ABRE pada rd29b (Uno et al. 2000). Protein lain yang identik dengan AREB1 dan AREB2 adalah ABF (Choi et al. 2000).

33 17 Gambar 5 Sistem dua komponen pada Escherichia E. coli dan Saccharomyces serevisiae (Kultz & Burg 1998). Huruf miring menunjukkan gen yang dipengaruhi. Gen responsif cekaman kekeringan dapat memiliki elemen cis dan atau trans (Ingram & Bartels 1996; Shinozaki et al. 2003; Rabbani et al. 2003). Beberapa gen-gen terinduksi ABA mempunyai elemen cis- yang responifresponsif terhadap ABA (ABRE; ACGTGG/TC) pada daerah promoter (Bonetta & McCourt 1998). Beberapa faktor basic region leucine zipper (bzip) EmBP1, OSBZ8, dan oszip-1a yang berikatan dengan ABRE telah diisolasi (Ko & Kamada 2002). Promoter gandum HVA1 mempunyai elemen CE3 (ACGCGTGTCCTG)) dan ABRE. Elemen CE menginduksi ekspresi gen melalui ABA (Shen & Ho 1995). Walaupun demikian, urutan basa A/GCGT tidak mutlak diperlukan sebagai bagian dari CE (Rogers & Rogers 1992; Shen & Ho 1995; Kao et al. 1996; Hobo et al. 1999). Jumlah salinan ABRE dapat meningkatkan respon gen oleh ABA (Skriver et al. 1991). Promoter gandum Em memiliki dua motif

34 18 ABRE yaitu Em1a dan Em1b yang memiliki peran besar dalam aktivasi gen (Guiltinan et al. 1990). Gen dengan ABRE pada daerah promoter akan diaktifkan oleh faktor trans. AREB1, AREB2, dan AREB3 merupakan faktor transkripsi dari tipe bzip yang berperan sebagai protein yang berikatan dengan ABRE pada rd29b (Uno et al. 2000). Protein lain yang identik dengan AREB1 dan AREB2 adalah ABF (Choi et al. 2000). Sejumlah gen seperti cor15a dan rd29a terinduksi melalui lintasan yang tidak melibatkan ABA. Promoter gen-gen tersebut memiliki urutan basa khusus yang merespon kekeringan DRE (TACCGACAT). Elemen cis dengan motif yang serupa dengan G/ACCGAC ditemukan pada CRT dan LTRE (Baker et al. 1994; Jiang et al. 1996; Thomashow 1999). CRT dan LTRE merupakan elemen yang berperan pada respon suhu rendah. Gen yang mengandung elemen cis DRE akan diaktifkan oleh faktor transkripsi yang berikatan dengan daerah tersebut yaitu DREB/CBF (Stockinger et al. 1997; Liu et al. 1998). Peningkatan tingkat ekspresi protein AP2/EREBP CBF-1 dapat meningkatkan toleransi terhadap dingin dan DREB1a dapat meningkatkan toleransi terhadap kekeringan atau salinitas atau dingin pada Arabidopsis A. thaliana (Jaglo-Ottosen et al. 1998; Kasuga et al. 1999; Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki 2001). Tanaman akan memproduksi osmoprotektan pada sel saat terjadi cekaman. Osmoprotektan berfungsi menjaga sel dari ROS. Osmoprotektan seperti trehalosa dan fruktan dihasilkan oleh beberapa mikroorganisme. Introduksi gen penyandi osmoprotektan asal mikrob dapat meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Akumulasi trehalose pada padi transgenik menunjukkan peningkatan tingkat toleransi terhadap cekaman kekeringan. Gen-gen yang diintroduksi adalah penyandi lintasan biosintesis trehalosa otsa dan otsb dari Escherichia E. coli (Wu & Garg 2003). Ekspresi gen penyandi fruktan SacB dari Bacillus subtilis meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan pada tembakau transgenik (Pilon- Smits et al. 1995). Introduksi osmoprotektan yang lain seperti glisin betain dan prolin juga mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cekaman kekeringan. Tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana mengandung gen penyandi biosintesis glisin betain mampu meningkatkan toleransi tanaman saat cekaman abiotik (Chen & Murata 2002). Peningkatan kandungan prolin pada padi

35 19 transgenik mampu memperbaiki ketahanan terhadap kekeringan (Cheng et al. 2001). Hormon tumbuhan asam absisat (ABA) akan meningkat pada waktu terjadi cekaman kekeringan. Kenaikan tingkat konsentrasi ABA selama kekeringan terjadi karena ekspresi sejumlah gen yang mengatur biosintesis ABA (Xiong et al. 2002). ABA dapat mengaktifkan sejumlah gen (Leung & Giraudat 1998). Beberapa gen memperlihatkan respon kekeringan tanpa melalui sinyal ABA. Terdapat dua sinyal transduksi yang melibatkan ABA dan dua sinyal lainnya tidak melibatkan ABA pada respon tanaman terhadap cekaman kekeringan (Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 1997). Lintasan yang tidak melibatkan ABA diperkirakan terekspresi lebih dahulu dibandingkan lintasan yang melibatkan ABA (Narusaka et al. 2003; Dubouzet et al. 2003). 1.3 Identifikasi gen potensial untuk padi tahan kering Beberapa ciri fisiologi dan morfologi tanaman padi untuk bertahan pada saat cekaman kekeringan telah diidentifikasi (Fukai & Kamoshita 2005). Penundaan waktu berbunga, warna hijau dari daun yang lebih dominan, dan pembentukan malai setelah periode kering merupakan ciri penting untuk tanaman padi yang mampu bertahan dari cekaman kekeringan apabila cekaman datang pada fase vegetatif. Sedangkan ciri penting tanaman padi tahan cekaman kekeringan jika kekeringan menyerang pada fase generatif antara lain adalah waktu berbunga yang lebih awal, tidak ada penundaan waktu berbunga, kandungan air yang tinggi pada daun, dan sedikit jumlah daun yang mati. Identifikasi sifat tahan kering dapat dipakai sebagai dasar untuk mencari gen-gen yang terlibat dalam mekanisme tahan kering. Pencarian sifat yang berperan penting dalam ketahanan kekeringan dari tanaman padi dapat dilakukan dengan mempelajari fungsi gen yang terlibat. Fungsi gen dipelajari dengan meningkatan tingkat ekspresinya (overexpression), menghilangkan ekspresi (knockout), dan mengidentifikasi pola ekspresi gen tersebut. Gen yang terlibat dapat diidentifikasi dengan pendekatan genetika Reverse atau Forward. Pendekatan pertama memanfaatkan tanaman hasil mutasi

36 20 yang dapat memperlihatkan hilangnya ekspresi atau meningkatkan ekspresi suatu gen. Gen potensial dapat ditapis melalui tanaman hasil mutasi yang didapat. Pendekatan yang kedua adalah dengan mengisolasi gen yang diduga memiliki fungsi pada mekanisme kekeringan. Tanaman dapat dimutasi menggunakan proses penyisipan T-DNA yang sifatnya acak pada kromosom padi. Kombinasi dengan Ac/Ds transposon memungkinkan percepatan koleksi mutan yang dihasilkan (Jin et al. 2004). Daerah pembatas kanan atau kiri dari T-DNA Agrobacterium tumefaciens biasa dipakai sebagai penanda. Beberapa cara telah dilaporkan dapat mengetahui daerah yang disisip oleh T-DNA, antara lain dengan plasmid resque, inverse PCR (Triglia et al. 1988; Does et al. 1991), atau TAIL (thermal asymmetric interlaced) PCR (Liu & Whittieret al. 1995). Penggunaan pustaka cdna telah dilakukan untuk mengidentifikasi sejumlah gen novel yang responsif saat terjadi cekaman kekeringan pada padi Indica (Reddy et al. 2002). Selain itu, teknologi microarray cdna telah dilakukan untuk mengetahui ekspresi gen yang responsif pada saat cekaman kekeringan (Yamaguchi-Shinozaki et al. 2003). Teknik penapisan diferensial telah dipakai untuk mengisolasi gen yang terinduksi kekeringan (Ingram & Bartels 1996). 2 HD-Zip (Homeodomain Leucine Zipper) Gen HD-Zip merupakan gen yang mengkode protein HD-Zip yang berfungsi sebagai faktor transkripsi. Faktor transkripsi adalah urutan khusus asam amino yang mampu berikatan dengan DNA untuk mengontrol proses penempelan RNA polymerase pada DNA sehingga akan mengontrol proses transkripsi suatu gen (de Sauza et al. 2003). Identifikasi faktor transkripsi didasarkan pada domain khusus dan daerah yang berperan dalam DNA-binding atau oligomerisasi (Liu et al. 1999). Faktor transkripsi dapat dikelompokkan menjadi tiga kelas yaitu faktor transkripsi umum, faktor transkripsi upstream, dan faktor transkripsi inducible. Faktor transkripsi umum bersifat ubiquitous dan terlibat dalam pembentukan komplek inisiasi awal pada daerah core-promoter di sekitar daerah awal transkripsi. TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, dan TFIIH adalah contoh dari faktor transkripsi kelompok faktor transkripsi umum. Faktor transkripsi upstream

37 21 merupakan protein yang berikatan pada daerah upstream dari inisiasi transkripsi yang berfungsi untuk menginduksi atau menghambat proses transkripsi. Faktor transkripsi inducible adalah protein seperti faktor transkripsi upstream yang dapat mengalami aktivasi atau penghambatan untuk ekspresinya sendiri. Transkripsi menjadi langkah awal untuk ekspresi dan pengaturan tingkat ekspresi. Kontrol ekspresi gen pada tanaman merupakan hal esensial untuk regulasi proses biologi seperti pembentukan bagian tanaman, perkembangan, diferensiasi, dan respon terhadap beragam sinyal lingkungan (Yanasigawa 1998). Kontrol pada faktor transkripsi merupakan strategi yang menjanjikan untuk perbaikan toleran terhadap cekaman. Strategi ini memungkinkan pengaturan dengan kisaran luas atas sejumlah gen target. Ekspresi yang meningkat dari faktor transkripsi kedelai SCOF-1 dari famili zinc finger mampu meningkatkan toleransi dingin pada tembakau transgenik tanpa mempengaruhi pertumbuhan normal dan sekaligus juga meningkatkan toleransi beku pada ArabidopsisA. thaliana transgenik. Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 6 Urutan asam amino dari protein homeodomain Drosophila melanogaster antp ( Daerah dengan tanda segitiga terbalik merupakan asam amino yang juga dimiliki oleh gen yang mengandung homeobox lainnya. HD-Zip merupakan anggota dari kelompok homeodomain. Anggota lain dari kelompok homeodomain adalah plant HD finger (PHD-finger), HD GLABRA2 (HD-Zip IV), HD-Knotted1 (HD-KN1) atau KNOX (knotted-like homeobox) (Ito et al. 2001), dan HD-BELL (Bel1-like) (Yang et al. 2002). HD-BELL dan KNOX dapat dikelompokkan ke dalam kelas super TALE (3-aa acid loop extention). Homeodomain memiliki fungsi pada proses penempelan DNA dan terdiri dari tiga heliks alfa (Gambar 7). Heliks alfa pertama membentuk posisi memutar terhadap heliks alfa ke dua. Heliks alfa ke dua akan membelok terhadap heliks alfa ke tiga. Heliks alfa ke tiga selanjutnya bersambungan dengan peptida yang mengandung

38 22 motif leusin zipper. Heliks alfa ke tiga memiliki peranan dalam pengenalan dan penempelan daerah tertentu pada lekukan DNA. Heliks alfa ke dua dan pertama akan memperkuat penempelan tersebut. Gen knotted1 (kn1) dari jagung merupakan gen homeobox yang pertama diidentifikasi pada tanaman (Vollbrecht et al. 1991). Gambar 7 Model struktur protein HD-Zip. A. Protein HD-Zip terdiri dari dua motif. Motif HD berperan dalam pengikatan DNA pada ujung terminal N, sementara leucine zipper pada ujung terminal C berfungsi untuk dimerisasi. B. Model struktur pengikatan HD-Zip dengan DNA ( Formatted: Indent: First line: 0 cm Motif leusin zipper yang bersambungan dengan homeodomain pada HD-Zip dinamakan daerah leucine zipper. Keberadaan leusin yang berulang pada urutan tertentu menunjukkan fungsi untuk pembentukan gulungan yang bergelung untuk membentuk dimer (Sessa et al. 1993). Daerah dengan motif leusin mengandung empat sampai lima leusin dengan motif khusus. Masing-masing leusin dipisahkan oleh enam asam amino. Dua buah protein HD-Zip akan membentuk dimer pada daerah motif membentuk gulungan yang bergelung. Dimer yang terbentuk seolaholah akan membentuk zipper. Pembentukan zipper merupakan syarat awal untuk proses penempelan DNA. Dua buah protein HD-Zip perlu berikatan membentuk dimer untuk dapat berfungsi. Protein dari kelas yang sama dapat membentuk homodimer atau heterodimer (Meijer et al. 1997). HD-Zip diklasifikasikan menjadi empat famili yaitu I, II, III dan IV. Famili I-IV mampu mengenali pola urutan DNA tertentu yang akan diikatnya dalam bentuk pseudopalindromic (Tabel 1). Protein HD-Zip merupakan faktor transkripsi. Protein HD-Zip akan berikatan sebagai dimer pada daerah pengenalan pseudopalindromic (Tabel 1). Famili I dan II memiliki pseudopalindromic yang

39 23 mirip CAATNATTG kecuali pada daerah tengah (N) yaitu (A/T) pada famili I dan (G/C) pada famili II (Sessa et al. 1993; Meijer et al. 2000). Famili III mengenali urutan DNA GTAAT(G/C)ATTAC dan TAAATG(C/T)A akan dikenali oleh famili IV (Sessa et al. 1998; Abe et al. 2001; Ohashi-Ito & Fukuda 2003). Tabel 1 Target urutan nukleotidasekuens dari HD-Zip berupa psudopalindromic HD-Zip Famili I Famili II Famili III Famili IV *Meijer et al **Tron et al Pseudopalindromic CAAT(A/T)ATTG* CAAT(G/C)ATTG* GTAAT(G/C)ATTAC* CATT(A/T)AATG** Protein HD-Zip famili I dan II dibedakan berdasarkan jumlah asam amino leusin pada daerah leucine zipper. Jumlah leusin Famili I lebih banyak daripada Famili II (Meijer et al. 2000). Di samping itu, pada famili I dan II memiliki pola intron-ekson khusus (Hendriksson et al. 2005). Famili III dan IV memiliki domain START setelah daerah HD-Zip (Schrick et al. 2004). Famili IV memiliki motif zipper loop zipper (Nakamura et al. 2006). Protein HD-Zip diduga memiliki peran khusus dalam proses perkembangan yang berhubungan dengan sinyal lingkungan (Schena & Davis 1992; Meijer et al. 2000). Peran HD-Zip ini telah diidentifikasi pada beberapa tanaman seperti Arabidopsis A. thaliana (Ruberti et al. 1991), Oryza O. sativa (Meijer et al. 1997), C. eraterostigma plantigineum (Frank et al. 1998), dan Physcomitrella patens (Sakakibara et al. 2001). Ekspresi gen Athb6, Athb7, dan Athb12 (HD-Zip I) dari Arabidopsis A. thaliana diinduksi oleh cekaman kekeringan (Söderman et al. 1996; Lee & Chun 1998; Söderman et al. 1999). Beberapa gen HD-Zip Ceraterostigma plantagineum menunjukkan respon terhadap kekeringan (Frank et al. 1998; Deng et al. 2002). Pada tanaman padi yang memiliki sejumlah gen HD- Zip, baru satu gen HD-Zip padi yang telah dikarakterisasi. Oshox1 (HD-Zip II) padi diperkirakan berfungsi dalam perkembangan tanaman antara lain sebagai

40 24 penentu spesifikasi sel pada perkembangan jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000; Scarpella et al. 2002). Sejumlah gen-gen HD-Zip padi diperkirakan memperlihatkan respon terhadap sinyal lingkungan antra lain kekeringan. 3 Asam salisilat (SA) Tanaman dan mikroorganisme dapat mensintesis atau menghasilkan produk perantara asam salisilat melalui beberapa lintasan (Gambar 8). Asam salisilat dapat dibentuk melalui lintasan fenilalanin atau asam korismat pada tanaman. Produk perantara pembentukan asam salisilat menggunakan asam korismat dapat ditemui pada mikroorganisme seperti Pseudomonas P. fluorescens dan Escherichia E. coli. Mikroorganisme Yarsinia enterocolitica mampu mengkonversi langsung asam korismat menjadi asam salisilat. Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 8 Ringkasan biosintesis asam salisilat. Tanda panah memperlihatkan alternatif sintesis asam salisilat pada tanaman. Tanda panah putusputus merupakan sintesis asam salisilat pada mikroorganisme melalui konversi langsung asam korismat menjadi asam salisilat. Tanda panah dengan titik-titik adalah lintasan produk perantara yang dapat dipakai untuk mensintesis asam salisilat pada mikroganisme.

41 Asam salisilat pada tanaman Hormon tanaman asam salisilat (SA) memiliki peran penting dalam penguatan ketahanan sistemik (SAR). Tingkat Konsentrasi SA berkorelasi dengan penginduksian beberapa protein yang berhubungan dengan ketahanan terhadap serangan patogen (protein PR) (Gaffney et al. 1993; Sticher et al. 1997). Peningkatan SA berkorelasi dengan resistensi terhadap virus dan induksi PR1 (Chen et al. 1995). Tanaman transgenik tembakau (Gaffney et al. 1993), transgenik padi (Yang et al. 2004), dan transgenik Arabidopsis A. thaliana mengandung gen nahg memperlihatkan hilangnya resistensi lokal maupun SAR dalam melawan infeksi patogen karena tanaman transgenik mengandung ekspresi gen nahg tidak mampu membentuk SA. SA tersedia dalam tanaman sebagai asam bebas dan metabolit terkonjugasi melalui metilasi, hidroksilasi, dan glukosilasi. SA diperkirakan lebih aktif bergerak dalam bentuk asam bebas pada tembakau karena keberadaannya dalam floem (Enyedi et al. 1992). SA yang disintesis pada tembakau yang terinokulasi TMV akan terglukosilasi dan termetilasi. Konjugat terglukosilasi memiliki bentuk SA 2-O-β-D-glukosida (SAG) dan glukosil salisilat (GS), dan metal salisilat (MSA) yang bersifat volatil. Pembentukan senyawa SA terkonjugasi, SA dan SAG, dirangsang oleh adanya infeksi pathogen dan tingkat konsentrasi SA (Lee & Raskin 1999). UDP-glukosa SA glukosiltransferase (SA GTase) bertanggung jawab untuk pembuatan SAG. UDP-glukosa SA karboksil GTase berperan dalam pembentukan GS. SA-karboksil metiltransferase mengontrol pembentukan MSA dari SA (Zubieta et al. 2003). Terdapat dua lintasan alternatif produksi SA pada tanaman (Gambar 86). SA dapat dibuat dari fenilalanin melalui asam sinamat dan asam benzoat (BA) pada tembakau sehat atau yang terinfeksi TMV (Yalpani et al. 1993). Asam benzoat 2-hidroksilase (BA2H) bertanggung jawab dalam konversi BA menjadi SA (Enyedi et al. 1992; Silverman et al. 1995). SA pada ArabidopsisA. thaliana dapat disintesis dari korismat. Lintasan ini dipelajari melalui analisis mutan sid. Mutan ArabidopsisA. thaliana sid1 (SAinduced defence 1) dan sid2 mengandung mutasi pada gen isokorismat sintase. Konsentrasi SA tidak dapat meningkat selama infeksi pathogen akibat mutasi ini, Spanish (Mexico)

42 26 (Wildermuth et al. 2001). Fenilalanin amonia liase (PAL) adalah enzim kunci pada biosintesis SA melalui fenilalanin. Terdapat empat salinan gen ini pada genom ArabidopsisA. thaliana. Satu pada kromosom 2, dua pada kromosom 3, dan satu pada kromosom 5. Enzim isokorismat sintase (ICS1; Nomor Aksesi GeneBankGen: AT1G18870) yang mengkonversi korismat menjadi isokorismat berlokasi pada kromosom 1 ( Gen nahg mengkode enzim pendegradasi SA. Gen nahg menyandikan salisilat hidroksilase yang mengkonversi SA menjadi katekol. Gen ini merupakan gen pada lintasan naptalena dalam operon sal dari Pseudomonas putida. Naptalena dan salisilat menjadi sumber karbon bagi genus Pseudomonas. Gen serupa nahg telah diisolasi dari Pseudomonas P. fluorescens (Chung et al. 2001). Operon nah/nah1 (nahabcdef) bersama dengan operon sal/nah2 (nahghijlkm) mengkonversi naptalena menjadi salisilat dan mengubah menjadi piruvat serta asetaldehida (Yen & Gunsalus 1982; You et al. 1991). Kontrol dalam ekspresi nahg memungkinkan dilakukannya penurunan kandungan SA tanaman. 3.2 Asam salisilat pada mikroorganisme Beberapa mikroorganisme dapat memproduksi SA menggunakan korismat melalui isokorismat. SA adalah perantara pada biosintesis pyochelin menggunakan operon pchdcba (Serino et al. 1997). Gen-gen pcha dan pchb mengkode protein yang menjadi katalis dalam konversi korismat menjadi SA melalui isokorismat. SA oleh ICS yang dikode oleh pcha diperlukan untuk mengkonversi korismat menjadi isokorismat. Gen entc dan pmsc merupakan ortholog dari pcha di Escherichia E. coli (Nomor Aksesi GeneBankGen: M24142) dan Pseudomonas P. fluorescens (Nomor Aksesi GeneBankGen: Y09356) (Mercado-Blanco et al. 2001). pchb mengkode isokorismat piruvat liase (IPL) yang mengkatalis isokorismat menjadi salisilat dan piruvat (Gaille et al. 2002). Baru-baru ini, protein Irp9 Yersinia enterocolitica mensintesis salisilat secara langsung menggunakan korismat sebagai prekursor (Pelludat et al. 2003). 3.3 Sinyal dengan perantara asam salisilat

43 27 H 2 O 2 diduga merupakan sinyal bagi sintesis SA (Klessig et al. 2000). Pengaruh oksidatif yang cepat akan terjadi akibat invasi patogen sehingga terjadi peningkatan tingkat konsentrasi H 2 O 2 dan senyawa oksigen reaktif lainnya yang menginduksi respon hipersensitif (HR). Kondisi ini berpengaruh pada tingkat konsentrasi BA bebas dan aktivitas BA2H. Tingkat konsentrasi SA akan meningkat sebagai konsekuensinya. (Leon et al. 1995). Akumulasi SA dibutuhkan untuk induksi SAR (Ryals et al. 1995). Walaupun demikian, SA tidak selalu berhubungan dengan HR. Mutan dnd1 (defence no death 1) memperlihatkan peningkatan tingkat konsentrasi SA dan resistensi terhadap patogen akan tetapi tidak memperlihatkan respon HR (Yu et al. 1998). SA bukan merupakan sinyal yang ditranslokasikan, tetapi terlibat dalam transduksi sinyal dalam jaringan target (Vernooij et al. 1994; Ryals et al. 1995) atau memerlukan molekul lain untuk mengaktifkan SAR. SA ditemukan pada floem pada waktu terjadi serangan patogen (Enyedi et al. 1992). Aplikasi SA secara eksogenus dapat menginduksi resistensi terhadap patogen pada beberapa tanaman model seperti padi, tembakau, dan ArabidopsisA. thaliana, tetapi tidak pada kentang (Coquoz et al. 1998). Pada kentang, tingkat konsentrasi SA yang tinggi memerlukan keterlibatan molekul lain untuk mengaktifkan SAR (Yu et al. 1997). Metil salisilat mungkin berperan sebagai sinyal lewat udara yang dapat mengaktifkan resistensi tanaman disekitarnya (Shulaev et al. 1997). SA dapat mengaktifkan urutan daerah promoter yang mengandungdna activation sequence 1 (as-1) (Gambar 9). Elemen promoter as-1 diperkirakan merupakan elemen yang merespon cekaman oksidatif dan diaktivasi oleh SA melalui cekaman oksidatif (Garreton et al. 2002). Urutan DNA ini ditemukan pertama kali pada promoter virus dan bakteri. Daerah ini dicirikan oleh dua motif TGACG yang berikatan dengan faktor transkripsi b-zip (Lam et al. 1989; Xiang et al. 1997). Sekuens as-1 telah diidentifikasi dalam glutation S-transferase (GST) seperti GNT35 (Nicotiana tabaccum) dan GST6 (Arabidopsis A. thaliana).

44 28 Gambar 9 Ringkasan peran asam salisilat dalam mengaktifkan sejumlah gen dan protein. : arah pengaruh; : arah yang dihambat; : bentuk ekspresi. Sejumlah protein yang teraktivasi oleh SA telah diidentifikasi (Gambar 9). Respon hipersensitif yang terjadi selama infeksi TMV dan terinduksi SA menjadi media dalam peningkatan tingkat dari sequence specific DNA-binding (SSDB) yang mengandung WRKY yang dapat mengenali elemen respon dari promoter gen kitinase kelas I tembakau (Yang et al. 1999). SABP1 (SA binding protein) katalase merupakan enzim teraktivasi oleh SA. SABP3 mengkode chloroplast carbonic anhydrase yang memperlihatkan aktivitas anti oksidan yang berperan penting selama HR (Slaymaker et al. 2002). Sinyal SA bersifat negatif terhadap sinyal JA (Gambar 9). Tingkat Konsentrasi SA padi menunjukkan penurunan selama peningkatan asam jasmonat (JA) yang disebabkan oleh pelukaan (Lee et al. 2004). SA menjadi penghambat dalam konversi 13-hidroksiperoksioktadekatri(di)enoik (HPOT(D)) menjadi 13-hidroksi oktadekatri(di)enoik (HOT(D)). Kedua senyawa tersebut memiliki peranan dalam sintesis JA (Lee et al. 2004). Protein Non-expresser of PR genes 1 (NPR1)/NIM1 mengatur gen yang

45 29 responifresponsif JA secara negatif dalam sitoplasma. Protein ini berinteraksi dengan faktor transkripsi TGA dalam nukleus dibutuhkan untuk menginisiasi ekspresi gen PR (Spoel et al. 2003). Mutan gen NPR1 tidak memperlihatkan sensitivitas terhadap SA. NPR1 diusulkan menjadi kunci pada SAR di ArabidopsisA. thaliana (Cao et al. 1994; Cao et al. 1997; Cao et al. 1998). Peningkatan tingkat ekspresi NPR1 di ArabidopsisA. thaliana (Chern et al. 2001) dan homolog NPR1 pada tanaman padi NPR-homolog 1 (NH1) (Chern et al. 2005) meningkatkan resistensi terhadap Xanthomonas oryzae. Ekspresi NPR1 secara negatif dikontrol oleh suppressor of npr1 inducible (SNI1). SNI1 adalah regulator negatif pada SAR dan terepresi oleh NPR1. SA memperlihatkan peran nyata dalam sistem pertahanan baik secara lokal maupun sistemik pada tumbuhan termasuk padi. Pemberian Pseudomonas aeruginosa pada padi meningkatkan resistensi terhadap Rhizoctonia solani (Saikia et al. 2006). Aplikasi SA secara eksogenus pada padi mampu mendorong resistensi terhadap Magnaporthe grisea (Manandhar et al. 1998). Introduksi gengen penyandi lintasan biosintesis SA asal bakteri meningkatkan resistensi terhadap patogen pada tembakau (Verberne et al. 2000) dan Arabidopsis A. thaliana (Mauch et al. 2001). Tanaman padi mengandung tingkat konsentrasi SA yang tinggi dan memiliki kemampuan mengkonversi eksogenus SA menjadi glukosil-sa (Silverman et al. 1995) sehingga memperlihatkan bahwa padi memiliki kemampuan menjaga basal SA. SA diduga menjadi pembatas kimiawi melawan infeksi patogen (Yang et al. 2004). 3.4 Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri Asam salisilat memiliki peran dalam mekanisme pertahanan tumbuhan terhadap cekaman biotik maupun abiotik. Pada saat terjadi cekaman biotik maka asam salisilat mempunyai peran penting dalam menginduksi SAR yang akhirnya mengaktifkan sejumlah gen PR pada cekaman biotik. Pada cekaman abiotik, asam salisilat berperan dalam mendetoksifikasi senyawa oksigen reaktif seperti superoksida dan H 2 O 2. Defisiensi kandungan asam salisilat pada Oryza O. sativa mengakibatkan tanaman rentan akan kerusakan akibat cekaman oksidatif (Yang et Formatted: Justified, Indent: First line: 0,95 cm, Line spacing: 1,5 lines

46 30 al. 2004). Pada saat cekaman biotik, SA akan menekan aktvitas APX dan CAT sehingga konsentrasi H 2 O 2 yang dihasilkan NADPH oksidase pada membran plasma tetap. Dengan demikian, tanaman secara simultan menghasilkan H 2 O 2 tetapi kehilangan kemampuan menghilangkan H 2 O 2. Kejadian ini berlawanan pada saat tanaman terpapar cekaman abiotik di mana produksi ROS seperti H 2 O 2 ditekan. Kedua fungsi yang berlawanan dari ROS ini masih menjadi perdebatan (Mittler 2002). Hal ini kemungkinan berhubungan dengan fungsi SA yang mengaktifkan SABP3 yaitu kloroplas karbonik anhidrase yang memiliki fungsi sebagai antioksidan (Slaymaker et al. 2002). Shingga, defisiensi kandungan asam salisilat pada O. sativa mengakibatkan tanaman rentan akan kerusakan akibat cekaman oksidatif (Yang et al. 2004). Tanaman mampu menghasilkan SA disamping melalui fenilalanin juga melalui isokorismat. SA yang dihasilkan melalui isokorismat pada ArabidopsisA. thaliana berperan dalam mekanisme pertahanan (Wildermuth et al. 2001). Gen yang berperan dalam produksi SA melalui isokorismat adalah gen ICS1 dan ICS2 yang berlokasi pada kromosom 1 ArabidopsisA. thaliana. Introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis SA asal bakteri melalui isokorismat pada tanaman padi dapat meningkatkan resisten tanaman. Akumulasi SA melalui isokorismat pada padi belum pernah dilaporkan. Penyamaan urutan asam amino enzim ICS ArabidopsisA. thaliana dan padi memperlihatkan kesamaan sebesar 45%. Padi mempunyai gen ICS yang berlokasi pada kromosom 9 Nipponbare dengan nomor aksesi NM_ dan and CA untuk Indica IR64. Kandungan SA padi berperan dalam mekanisme pertahanan terhadap cekaman biotik. Padi memperlihatkan kandungan SA yang lebih tinggi dibandingkan ArabidopsisA. thaliana dan tembakau. Padi mampu mempertahankan kandungan SA bebas yang cukup tinggi. Walaupun demikian, glukosil transferase padi terinduksi oleh pemberian SA dari luar. Aplikasi SA dan bakteri penghasil SA dari luar mampu meningkatkan sistem pertahanan terhadap serangan Magnaporthe grisea (Manandhar et al. 1998) dan Rhizoctonia solani (Saikia et al. 2006). Kandungan SA dan enzim yang mengkonversi SA memiliki lokasi yang berbeda (Silverman et al. 1995). Ini menimbulkan spekulasi bahwa Formatted: Subscript Formatted: Subscript

47 31 gen pertahanan yang dependen SA akan terinduksi apabila SA dihasilkan menyerupai pemberian SA dari luar. Introduksi gen asal bakteri memerlukan ketersediaan sinyal peptida yang mengarahkan ekspresi gen pada kompartemen tertentu pada sel. Sinyal peptida adalah penting untuk mengontrol ekspresi gen ICS (isochorismate synthase). ICS1 ArabidopsisA. thaliana memiliki sinyal peptida (Wildermuth et al. 2001). Rekayasa SA dengan menambahkan sinyal peptida pada fusi gen pchb-a yang dikontrol oleh promoter 35S dapat meningkatkan konsentrasi SA pada Arabidopsis A. thaliana (Mauch et al. 2001). Penggunaan sinyal peptida dengan target ekspresi pada kloroplas di tembakau transgenik mampu meningkatkan kandungan asam salisilat (Verberne et al. 2000).

48 32 BAHAN DAN METODE 1 Waktu dan tempat penelitian Penelitian dilaksanakan dari tahun 2001 sampai Penelitian dilakukan di laboratorium Clusius, Institute of Biology Leiden, Leiden University, The Netherlands. Kegiatan kloning, transformasi bakteri, dan molekuler analisis dilakukan di laboratorium Molecular and Developmental Genetics. Sedangkan kegiatan anatomi-histologi dan pengambilan gambar preparat dilakukan di Laboratorium Histologi. Percobaan untuk pemberian abiotik seperti kekeringan, salinitas, kejut-panas dan perlakuan perendaman dalam air dilakukan di ruang tumbuh untuk tanaman padi. Kegiatan uji kekeringan untuk tanaman transgenik Arabidopsis A. thaliana dilakukan pada ruang tumbuh ArabidopsisA. thaliana. Transformasi tanaman di laksanakan di laboratorium biosafety level 2. Pengukuran kadar asam salisilat beberapa kultivar padi dilakukan laboratorium Virology, Virology Department, Leiden University. Untuk pengukuran kandungan asam salisilat dari tanaman transgenik padi yang mengandung gen-gen introduksi asam salisilat asal bakteri dilakukan di Laboratorium CIRAD, Perancis. 2 Bahan penelitian Kultivar padi yang digunakan adalah IRAT112, Cabacu, Cisadane, Nipponbare, T-309, IR64, IR58, dan Taipei (Tabel 2) dan Arabidopsis A. thaliana dari jenis Columbia. Kultivar padi IRAT112 dan Cabacu merupakan padi gogo, Cisadane dan IR64 adalah padi sawah, sedangkan Nipponbare dan T-306 merupakan padi model untuk transformasi. Beberapa strain bakteri yang digunakan untuk kegiatan kloning dan transformasi genetika tertera pada Tabel 3. Antibiotik Rifamfpicin dipakai untuk memelihara kultur Agrobacterium A. tumefaciens LBA4404 dan LBA1115. Sejumlah plasmid yang dipakai diperlihatkan tercantum dalam Tabel 4. Bakteri Escherichia E. coli mengandung plasmid rekombinan dipelihara dengan kandungan antibiotik setengah kali yang dipakai untuk Agrobacterium A. tumefaciens. Perunut untuk melabel pada analisis Northern dipaparkan pada Tabel 5.

49 33 Tabel 2 Jenis kultivar padi yang dipakai dalam percobaan cekaman abiotik No Kultivar Tipe Percobaan 1 IRAT112 Bibit Cekaman abiotik 2 Cabacu Bibit Cekaman abiotik 3 Cisadane Bibit Cekaman abiotik 4 Nipponbare 1.1. Kalus 2.2. Bibit 1.1. Transformasi 2.2. Cekaman abiotik 5 T-309 Bibit Cekaman abiotik 6 IR64 Bibit Cekaman abiotik Formatted Table Formatted: Bullets and Numbering Tabel 3 Jenis bakteri yang dipakai pada percobaan kloning dan transformasi No Bakteri Strain Percobaan 1 Escherichia E. coli DH5α PRΚ2013 Kloning Helper 2 Agrobacterium A. tumefaciens 1. LBA4404 (rif LBA1115 (rif 20) -Transformasi genetika padi -Transformasi genetika ArabidopsisA. thaliana Tabel 4 Daftar plasmid yang digunakan pada konstruksi gen No Plasmid Antibiotik Kegunaan Percobaan 1 TOPO Amp50/Kan25 PCR cloning 2 pc1300 Kan 25 Vektor biner 3 pc1391z Kan 25 Vektor biner 4 pmog80 Kan 25 Vektor biner 5 365S-Oshox4 Kan 25 Vektor biner 6 RNAi-Oshox4 Kan 25 Vektor biner 7 DR5-GUS Kan 25 Vektor biner 8 PO4 Kan 25 Vektor biner Kan: kanamisin Amp: amfpisilin Tabel 5 Perunut yang digunakan untuk melakukan analisis Northern No Perunut Sumber Asal 1 Oshox1-7 cdna Rice Group, Leiden, Belanda 2 Salt Plasmid Rice Group, Gent, Belgia 3 Oshsp 16.9 Plasmid Rice Group, Leiden, Belanda 4 Oshox >8 Plasmid GeneBankGen

50 34 3 Metodologi penelitian Tahapan penelitian meliputi dua bagian terpisah (Gambar 10), yaitu karakterisasi gen HD-Zip padi yang memperlihatkan respon kekeringan, dan introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yang berasal dari bakteri.

51 35 Gambar 10 Tahapan yang dilakukan dalam penelitian. Penelitian mempunyai dua bagian yang terdiri dari penggunaan HD-Zip (kotak) dan introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal

52 36 bakterik (segitiga) untuk pembuatan padi transgenik. 3.1 Karakterisasi Gen HD-Zip padi responsif kekeringan Penapisan HD-Zip yang merespon kekeringan Koleksi pustaka HD-Zip tanaman padi. Koleksi dilakukan dengan cara mencari gen HD-Zip pada genom tanaman padi yang tersedia pada database di GeneBankGen dengan alamat website NCBI ( Rice Genome Research Programe ( dan Gramene ( Pencarian gen-gen HD-Zip padi dengan Program BLAST di database GeneBankGen didasarkan pada gen HD-Zip tanaman padi Oshox1 sampai Oshox-7 yang telah diidentifikasi oleh Meijer et al. (1997). Respon gen-gen HD-Zip saat terpapar cekaman abiotik. Beberapa kultivar padi (Tabel 2) dipakai untuk verifikasi respon gen-gen HD-Zip padi saat tanaman terpapar cekaman abiotik. Selain cekaman abiotik kekeringan juga diberikan perlakuan cekaman lainnya seperti asam absisat (ABA), salinitas, kejutpanas, dan perendaman dalam air. Hal ini penting dilakukan karena tanaman yang mengalami kekeringan biasanya mengalami peningkatan kandungan ABA dan mengalami juga cekaman kejut-panas. Cekaman kekeringan memberikan pengaruh cekaman osmotik pada sel yang juga mirip dengan cekaman akibat salinitas. Sementara itu, cekaman perendaman merupakan efek kebalikan dari cekaman kekeringan. Cekaman kekeringan dan asam absisat (ABA) serta salinitas diberikan pada kultivar IRAT112, Cabacu, Cisadane, Nipponbare, dan T-309. Cekaman kejut-panas diberikan pada kultivar Nipponbare dan Taipei. Cekaman perendaman diberikan pada kultivar Nipponbare dan IR64.. Benih padi disemai pada air steril. Benih padi yang telah berkecambah kemudian ditumbuhkan pada kertas filter di dalam cawan Petri seperti dijelaskan oleh Claes et al. (1990). Saat tanaman padi mempunyai empat daun, tanaman diberi perlakuan abiotik. Perlakuan kekeringan, 10 mm asam absisat (ABA), dan salinitas (150 mm) dilakukan sesuai dengan protokol yang didiskripsikan oleh Claes et al. (1990). Cekaman abiotik kejut-panas diberikan pada suhu 42 o C selama dua jam sedangkan cekaman perendaman dalam air diberikan selama enam jam. Selanjutnya, respon tanaman padi terhadap cekaman abiotik dianalisis menggunakan Northern. Northern blot dilakukan pada gel mengandung 1.5%

53 37 agarose dan 10% 10x MOPS (Memelink et al. 1994). RNA diisolasi berdasarkan Chomczynski dan Sacchi (1987) menggunakan bufer ekstraksi yang terdiri dari 4 M guanidium thiosianat, 20 mm sodium sitrat, 0.5% sarkosyl, 0.1 M β- mercaptoethanol. Total RNA sebanyak 10 μg dari bibit padi berdaun empat dipakai untuk tiap sumur. Hibridisasi untuk Northern blot dilakukan berdasarkan Memelink et al. (1994). Berdasarkan analisis Northern dipilih salah satu gen HD- Zip padi yang memperlihatkan respon terhadap cekaman kekeringan untuk tujuan karakterisasi. Beberapa gen seperti salt dan Oshsp16.9 dipakai untuk mengontrol kondisisebagai kontrol cekaman yang diberikan. Gen salt terekspresi kuat pada saat cekaman osmosis seperti kekeringan, salinitas, dan ABA (Claes et al. 1990). Gen salt merupakan gen ideal yang dapat dipakai sebagai kontrol untuk mengontrol pemberian kekeringan pada tanaman padi. Gen Oshsp16.9 terinduksi kuat pada saat cekaman kejut-panas. selanjutnya dipilih untuk mengontrol proses cekaman kejut-panas yang diberikan Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan Berdasarkan penapisan gen-gen HD-Zip tanaman padi, dipilih satu gen HD- Zip yang memperlihatkan respons terhadap kekeringan yaitu gen Oshox4 sebagai gen yang akan dikarakterisasi. Urutan asam amino protein Oshox4 disejajarkan dengan protein Antp dan bzip untuk mendapatkan gambaran kesamaan urutan nukleotida dengan protein homeobox dan daerah motif leusin zipper. Selanjutnya karakterisasi gen dilakukan dengan membuat padi transgenik dari padi kultivar Nipponbare dan ArabidopsisA. thaliana melalui tiga buah pendekatan yaitu analisis peningkatan, penurunan, dan pola ekspresi gen Oshox4. A Meningkatkan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif dari 35S CaMV A.1 Konstruksi gen 35S-Oshox4 Untuk meningkatkan ekspresi gen Oshox4 maka promoter dari gen Oshox4 disubstitusi dengan promoter dari 35S-CaMV (Gambar 11) sesuai dengan prosedur yang didiskripsikan oleh Sambrook dan Russel (2001), yang selanjutnya

54 38 disebut 35S-Oshox4. Promoter 35S dari CaMV difusikan dengan cdna dari gen yang dianalisis (Oshox4). Poly-A dari 35S digunakan sebagai terminator. Fragmen cdna Oshox4 dari pskbluescript disisipkan pada sisi KpnI/EcoRI vektor prt104 yang mengandung promoter 35S ganda dan polya dari 35S sebagai terminator. Cassette lengkap 35S ganda-oshox4-polya 35S disisipkan pada vektor biner pc1300 pada sisi HindIII. Manipulasi atau penggandaan plasmid biner pc1300 dilakukan dengan memasukkan plasmid ke dalam bakteri E.coli strain DH5α. Plasmid diintroduksi pada E. coli yang kompeten dengan menggunakan cara kejut panas seperti dijelaskan dalam Sambrook dan Russel (2001). Bakteri E.coli dikulturkan sampai mencapai OD 600 = pada media LB cair. Suspensi bakteri diendapkan dengan sentrifugasi dan diresuspensi pada 50 mm CaCl 2 seperdelapan volume awal. Suspensi bakteri pada 50mM CaCl 2 disentrifugasi dan endapan sel bakteri diresuspensi pada 50mM CaCl 2 mengandung 15% gliserol seperduapuluh-lima volume awal. Sebanyak 200 μl sel suspensi bakteri dipakai untuk proses transformasi plasmid ke dalam bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens. Plasmid dimasukkan ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 (untuk transformasi tanaman padi) dan LBA1115 (untuk transformasi tanaman ArabidopsisA. thaliana) dengan menggunakan metode tri-parental mating. E. coli strain prk2013 digunakan sebagai helper untuk memindahkan vektor biner dari E. coli DH5α ke Agrobacterium A. tumefaciens LBA4404 dan LBA1115. Tiga kultur bakteri yang terdiri dari E.coli dengan plasmid biner, bakteri helper, dan Agrobacterium A. tumefaciens yang akan menjadi inang dicampurkan selama 16 jam pada suhu ruang. Campuran bakteri dikulturkan pada medium agar LB dengan antibiotik yang sesuai untuk plasmid rekombinan untuk mendapat koloni tunggal. Kultur bakteri diinkubasi pada suhu 28 o C selama tiga hari. Koloni tunggal mengandung plasmid rekombinan diverifikasi dengan menggunakan gel agarose elektroforesis.

55 39 Gambar 11 Peta restriksi dari konstruksi untuk meningkatkan ekspresi gen Oshox4, 35S-Oshox4. Oshox4: cdna koordinat , 35S terminator: polya dari 35S. 2 x 35S promoter: promoter ganda yang terdiri dari dua buah promoter 35S. A.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi dan ArabidopsisA. thaliana A.2.1 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi Kultur Agrobacterium A. tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung konstruksi gen 35S-Oshox4 ditumbuhkan pada medium ko-kultivasi mengandung asetosiringon 100 mm sampai OD = 1. Populasi bakteri ini selanjutnya dipakai untuk proses transformasi. Transformasi T-DNA AgrobacteriumA. tumefaciens ke tanaman padi dilakukan melalui kalus embriogenik. Kalus embriogenik yang berasal dari skutelum (diinduksi dengan memakai 2,4-D untuk merangsang pembentukan kalus) direndam pada kultur bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens selama 15 menit pada suhu ruang. Kalus ditransfer ke medium padat dan diinkubasi selama 72 jam pada ruang gelap suhu 25 o C. Seleksi antibiotik dilakukan untuk membedakan antara tanaman transgenik dan non-transgenik dengan menggunakan antibiotik higromisin (50 mg/l). Setelah dilakukan seleksi selama 2-3 minggu, tunas dan akar diinduksi dengan menempatkan kalus pada kondisi terang (12 jam) dan gelap (12 jam) pada medium regenerasi yang mengandung IAA (indole acetic acid) (0.5 mg/l) dan BAP (6-benzilaminopurin) (3 mg/l). Sebagai kontrol untuk melihat pengaruh insersi T-DNA pada tanaman padi dilakukan transformasi dengan konstruksi cassette DR5-GUS. Tanaman transgenik padi hasil transformasi yang mengandung ekspresi Oshox4 yang berlebih dipakai untuk melihat pengaruh gen tersebut pada fenotipe padi. Padi transgenik ditumbuhkan dengan metode hidroponik menggunakan

56 40 media hidroponik produk dari Luasa. Pengamatan dilakukan secara berkala berdasarkan periode perkembangan padi kontrol (padi transgenik dengan plasmid kosong atau tanpa mengandung gen Oshox4). Benih tanaman padi transgenik T 0 ditanam dan diamati kemampuan berkecambahnya (generasi T 1 ). Ekspresi gen Oshox4 pada kedua tanaman padi transgenik (perlakuan dan kontrol) diverifikasi menggunakan analisis Northern yang dilakukan seperti pada prosedur sebelumnya (hal 33). Fenotipe padi transgenik overekspresi Oshox4 diamati dengan melihat pertumbuhan vegetatif dan generatif padi. Selanjutnya tanaman padi yang menunjukkan fenotipe overekspresi Oshox4 diisolasi jaringannya untuk analisis histologi lebih lanjut. Ukuran sel diukur menggunakan program ImageJ. Preparat disiapkan dengan mengawetkan jaringan pada plastik Histo-Technik Technovit Jaringan difiksasi pada 0.1 M bufer fosfat mengandung 2% gluteraldehida selama satu jam. Dehidrasi berturut-turut dilakukan menggunakan 70%, 80%, 90%, 96%, dan 100% alkohol selama satu jam pada suhu ruang. Imbibisi Technovit dilakukan dalam dua tahap dimulai dengan Technovit:alkohol = 1:1 dan dilanjutkan Technovit 100% selama masing-masing satu malam. Pemotongan dilakukan dengan pisau gelas sudut 45 o menggunakan mikrotom dari Leica. Pewarnaan kontras dilakukan dengan menggunakan 0.5% safranin. Formatted: Subscript A.2.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke ArabidopsisA. thaliana Tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana yang mengandung35s-oshox4. dibuat untuk menguji potensi aplikasi Oshox4 dalam meningkatkan ketahanan saat cekaman kekeringan. Transformasi 35S-Oshox4 ke dalam tanaman Arabidopsis A. thaliana dilakukan seperti dijelaskan oleh Clough dan Bent (1998) yang telah dimodifikasi. Tanaman Arabidopsis A. thaliana ditumbuhkan pada kondisi 25 o C. Suspensi 5 ml bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens mengandung plasmid rekombinan hasil kultur selama tiga hari pada 28 o C disentrifugasi. Pelet hasil sentrifugasi dilarutkan dalam 1 ml LB (Sambrook & Russel 2001) cair mengandung asetosiringon. Suspensi bakteri dioleskan pada bunga ArabidopsisA. thaliana yang belum mekar. Benih ArabidopsisA. thaliana diseleksi pada media MS (Sambrook & Russel 2001) setengah konsentrasi tanpa

57 41 sukrosa dan mengandung antibiotik higromisin 25 mg/l. Untuk kontrol pengaruh insersi T-DNA pada Arabidopsis A. thaliana dilakukan transformasi konstruksi pc1300 yang akan menyisipkan T-DNA mengandung 35S-hph.. Tanaman transgenik selanjutnya dipindahkan ke rumah kaca dengan media tanam yang terdiri dari campuran tanah, kompos, dan pasir dengan komposisi 1:1:1 untuk menghasilkan benih. A.3. Uji kekeringan tanaman transgenik ArabidopsisA. thalaina 35S-Oshox4 Benih dari 10 tanaman transgenik independen ArabidopsisA. thaliana 35S- Oshox4 dan 5 tanaman transgenik independen ArabidopsisA. thaliana 35S-hph (kontrol) diseleksi pada media MS setengah konsentrasi tanpa sukrosa mengandung antibiotik higromisin 25 mg/l. Tanaman transgenik Arabidopsis A. thaliana dipindahkan dari medium agar MS ke medium tanah dengan kompisisi kompos:pasir = 1:1. Tanaman transgenik ditanam berdampingan dengan dua kali ulangan masing-masing ulangan terdiri dari 20 individu tanaman. Tanaman diaklimatisasi pada kondisi rumah kaca selama satu minggu. Perlakuan cekaman kekeringan diaplikasikan setelah pertumbuhan tanaman Arabidopsis A. thaliana cukup kuat untuk kondisi di lapang (rumah kaca). Kelompok tanaman kontrol disiram air setiap hari. Sedangkan pada kelompok tanaman perlakuan, pemberian air dihentikan untuk memberikan pengaruh cekaman selama periode kekeringan 21 dan 30 hari (Gambar 12). Pemberian air kembali dilakukan setelah tanaman mengalami kondisi kekeringan selama 21 hari dan 30 hari, ketikadimana tanaman sudah mulai menampakkan gejala layu permanen. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk memantau kondisi tanaman Arabidopsis A. thaliana yang mengalami kekeringan. Setelah periode 21 dan 30 hari kekeringan pengamatan dilakukan terhadap tingkat survival tanaman yaitu tanaman yang berhasil melewati periode kritis kondisi kekeringan dan menampakkan gejala pertumbuhan kembali.

58 42 Gambar 12 Denah perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana 35S-Oshox4. X: tanaman transgenik. 20 Dua puluh tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana 35S-Oshox4 ditanam dalam satu buah pot. Dua buah kelompok tanaman dipakai dalam percobaan ini untuk tiap-tiap galur yang dipakai. Formatted Table B Menurunkan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi (RNA interference) B.1 Konstruksi vektor Pasangan basa sepanjang kira-kira 430 bp dari daerah pengkode ujung C protein HD-Zip Oshox4 diisolasi dengan menggunakan PCR (polymerase chain reaction) selanjutnya disebutselanjutnya DISEBUT RNAi-Oshox4. PCR dilakukan dengan memakai cdna Oshox4 dari pbluescript sebagai cetakan (template). Primer yang digunakan adalah primer forward dengan urutan basa CGCTCGAGGGATCCGGCGGCGGCGAGCTTCACGTCGGTG dan primer

59 43 reverse GGGGAATTCAAGCTTTAGTGTTTTCCAACTCTCTCTCTCG. Kondisi PCR meliputi denaturasi awal 95 o C selama 2 menit yang dilakukan sebanyak satu kali. Kondisi 95 o C ini masih dipertahankan selama 0.30 detikmenit untuk proses denaturasi secara sempurna. Penempelan primer pada cetakan dilakukan pada kondisi suhu 55 o C selama 0.45 detikmenit, dan perpanjangan nukleotida dilakukan pada suhu 72 o C selama 1 menit60 detik. Proses PCR yang meliputi denaturasi, penempelan dan perpanjangan nukleotida dilakukan sebanyak 40 siklus. Perpanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 o C selama 420 detik7 menit. Produk PCR ini selanjutnya dibuat sebagai sense dan anti-sense pada vektor Hannibal. Konstruksi sense-intron-antisense dari vektor Hannibal (Wesley et al. 2001) disisipkan pada vektor biner pc1300 (Gambar 13) sesuai dengan Sambrook dan Russel (2001) untuk membuat RNAi-Oshox4.. Formatted: Portuguese (Brazil) Formatted: Portuguese (Brazil) Formatted: Portuguese (Brazil) Gambar 13 Konstruksi vektor untuk menurunkan ekspresi Oshox4. Produk PCR sebesar 400 bp disisipkan sebagai sense pada sisi XhoI/EcoRI dan anti-sense pada sisi HindIII/BamHI pada vektor phannibal. Cassette phannibal SacI/PstI selanjutnya disisipkan pada vektor biner pc1300 menjadi RNAi-Oshox4. OCS: oktopin sintase. B.2 Transformasi pc1300 yang mengandung sense-anti-sense ke tanaman padi Konstruksi vektor dalam plasmid biner digandakan dengan cara dimasukkan ke dalam E.coli strain DH5α. Insersi plasmid, yang masih berada di dalam E. coli,

60 44 ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 dan LBA1115 dilakukan dengan metode tri-parental mating. Setelah itu AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung ccassette phannibal SacI/PstI ditransformasi ke dalam genom padi. Prosedur transformasi plasmid ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens dan transformasi AgrobacteriumA. tumefaciens ke tanaman padi sesuai dengan prosedur sebelumnya(pada uji over ekspresi). B.3 Analisis penurunan ekspresi Oshox4 Verifikasi penurunan ekspresi gen Oshox4 dilakukan dengan analisis Northern seperti prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya (hal 33). Pengamatan fenotipe padi transgenik yang mengandung kontruksi sense-intron-antisense dilakukan pada tahap pertumbuhan vegetatif dan generatif. C Melihat pola ekspresi gen Oshox4 C.1 Konstruksi vektor pc1391z mengandung fusi promoter Oshox4 dengan gen GUS Promoter Oshox4 diklon dengan ukuran kira-kira 2.5 kb ke arah hulu dari kodon awal termasuk ujung 5 yang tidak ditranslasikan menurut Sambrook dan Russel (2001) menggunakan PCR. Primer yang dipakai adalah primer forward (GGTCTGTTTGGCAAAGCTTCAGTTC) dan primer reverse (GGCCATGGCGAGTTCTAGTAAAATTCAGT). DNA genomik padi kultivar Nipponbare dipakai sebagai cetakan. Kondisi PCR untuk proses denaturasi awal dibuat pada suhu 95 o C selama detikmenit. Kondisi ini masih dipertahankan selama 0.30 detik menit untuk denaturasi lebih lanjut. Penempelan primer pada cetakan dibuat pada suhu 55 o C selama 0.45 detikmenit. Untuk perpanjangan nukleotida dilakukan pada suhu 72 o C selama 180 detik3 menit. Siklus PCR yang meliputi proses denaturasi, penempelan primer dan perpanjangan nukleotida diulang sebanyak 40 kali. Perpanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 o C selama 420 detik7 menit. Produk PCR sebesar 2.5 kb diklon pada vektor TOPO (Invitrogen). Sisipan produk PCR pada vektor TOPO dirunutkan (di-sequencing) memakai primer M13 Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Font: Not Italic, Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden)

61 45 forward dan M13 reverse. Produk PCR 2.5 kb selanjutnya disisipkan pada vektor biner pc1391z yang mengandung gen GUS pada situs HindIII dan NcoI (Gambar 14) untuk selanjutnya disebut sebagai PO4. Insersi promoter dilakukan pada sisi HindIII/NcoI sesuai dengan Sambrook dan Russel (2001). Selanjutnya plasmid biner diperbanyak dengan memasukkan plasmid ke dalam bakteri E.coli strain DH5α. Gambar 14 Konstruksi T-DNA pda vektor pc1391z mengandung promoter Oshox4, PO4. Promoter Oshox4 disisipkan pada sisi HindIII/NcoI. mcs: multiple cloning site, hph: hygromisin fosfotransferase, nos ter: terminator dari nofalin sintase, GUS: gen glukuronidase, RB: batas kanan, LB: batas kiri. Produk PCR sebesar 2.5 kb diklon pada vektor TOPO (Invitrogen). Sisipan produk PCR pada vektor TOPO dirunutkan (di-sequencing) memakai primer M13 forward dan M13 reverse. Produk PCR 2.5 kb selanjutnya disisipkan pada vektor biner pc1391z yang mengandung gen GUS pada situs HindIII dan NcoI (Gambar 14) untuk selanjutnya disebut sebagai PO4. Insersi promoter dilakukan pada sisi HindIII/NcoI sesuai dengan Sambrook dan Russel (2001). Selanjutnya plasmid biner diperbanyak dengan memasukkan plasmid ke dalam bakteri E.coli strain DH5α. C.2 Penggandaan plasmid dan transformasi AgrobacteriumA. tumefaciens ke tanaman padi dan ArabidopsisA. thaliana Insersi plasmid (setelah diperbanyak dalam bakteri E. coli) ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 dan LBA1115 dilakukan dengan, Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico)

62 46 metode tri-parental mating, sesuai dengan prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya. Strain AgrobacteriumA. tumefaciens LBA4404 dipakai untuk menginsersi T-DNA ke dalam genom padi sedangkan untuk transformasi pada Arabidopsis A. thaliana menggunakan strain LBA1115. Transformasi Agrobacterium A. tumefaciens ke genom padi dan Arabidopsis A. thaliana dilakukan seperti pada transformasi Agrobacterium A. tumefaciens pada uji over ekspresi (hal 34). C.3 Analisis ekspresi gen GUS Uji ekspresi gen GUS (beta-d-glukuronidase) dilakukan sesuai Jefferson (19897). Larutan bufer X-gluc diinfiltrasikan pada jaringan tanaman transgenik dengan vakum selama 5 menit dilanjutkan dengan inkubasi 37 o C. Reaksi dihentikan menggunakan asam asetat glasial dan etanol 70%. Komposisi bufer X- gluc terdiri dari: 2 mm X-gluc, 0.5 mm potasium ferisianida, 10 mm NaEDTA, 0.1% Triton X-100, dan 0.1 mm sodium fosfat ph 7.7. Protein GUS akan bereaksi dengan substrat X-gluc membentuk warna biru. Pengamatan ekspresi gen GUS lebih lanjut dilakukan pada tingkat sel dengan cara membuat preparat. Preparat disiapkan dengan mengawetkan jaringan tanaman transgenik yang telah diberi substrat X-gluc pada plastik Histo-Technik Technovit Jaringan difiksasi pada 0.1 M bufer fosfat mengandung 2% gluteraldehida selama 1 jam. Dehidrasi berturut-turut dilakukan menggunakan 70%, 80%, 90%, 96%, dan 100% alkohol selama 1 jam pada suhu ruang. Imbibisi Technovit dilakukan dalam dua tahap dimulai dengan technovit:alkohol = 1:1 dan dilanjutkan Technovit 100% selama masing-masing satu malam. Pemotongan dilakukan dengan pisau gelas sudut 45 o menggunakan mikrotom dari Leica. Pewarnaan kontras dilakukan dengan menggunakan 0.5% safranin., Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico) Formatted: Dutch (Netherlands) C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico

63 47 Untuk melihat ekspresi gen Oshox4 in silico dilakukan melalui program BLAST untuk EST (expressed sequence tag) berdasarkan tingkat homologi (kesamaan nukleotida) yang tinggi dengan Oshox4. Program BLAST dijalankan pada website NCBI dengan alamat situs: Hasil pencarian dengan program BLAST selanjutnya dipakai untuk identifikasi kondisi ekspresi gen Oshox4 (misalnya pada saat cekaman penyakit blas atau pada saat fase pertumbuhan tertentu dari padi).

64 Introduksi gen entc dan pmsb ke dalam tanaman padi Konstruksi plasmid pc1300 yang mengandung gen entc dan pmsb Konstruksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri pada plasmid pc1300 dilakukan dengan teknik pemindahan gen entc dan pmsb dari pmog80 (diperoleh dari Dr. M Verberne, Virology Department, Leiden University) ke pc1300 sesuai dengan Sambrook dan Russel (2001) (Gambar 153) untuk selanjutnya disebut sebagai PSA. Gen higromisin fosfotransferase (hph) dipakai untuk ketahanan terhadap antibiotik higromisin pada sistem seleksi. Fragmen EcoRI/XbaI dari pmog80 sebesar kira-kira 1670 bp disisipkan ke dalam pc1300, setelah itu diikuti dengan penyisipan fragmen EcoRI/EcoRI sebesar 2470 bp. Promoter 35S dari virus Cauli Mozaic CaMV dipakai untuk mengatur ekspresi gen entc (Escherichia E. coli) dan gen pmsb (Pseudomonas P. fluorescens). Gen entc menyandi enzim isokorismat sintase sedangkan pmsb menyandi enzim isokorismat piruvat liase. Small subunit dari Rubisco dipakai untuk peptide sinyal ekspresi gen pada klorofil. Sebagai terminator dipakai terminator dari proteinase inhibitor tanaman kentang (Gambar 15). Gambar 15 Peta restriksi dan konstruksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri dari psa. 35S: promoter 35S dari CaMV, ss: small subunit dari Rubisco, entc: gen penyandi isokorismat sintase dari E. Coli, pmsb: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari Pseudomonas P. fluorescens, PIT: terminator dari gen inhibitor

65 49 proteinase kentang, angka menunjukkan ukuran nukleotida apabila dipotong dengan restriksi enzim tertentu Transformasi konstruksi gen PSA ke tanaman padi Nipponbare Transformasi padi yang menggunakan Agrobacterium A. tumefaciens sebagai vektor dilakukan berdasarkan Hiei et al. (1994). Kultur Agrobacterium A. tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung konstruksi gen ditumbuhkan pada medium ko-kultivasi yang mengandung asetosiringon 100 mm. Ko-kultivasi bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens dilakukan sampai OD 600 Agrobacterium = 1. Populasi bakteri ini selanjutnya dipakai untuk proses transformasi. Kalus embriogenik yang berasal dari skutelum padi direndam kultur bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens selama 15 menit pada suhu ruang. Setelah itu kalus ditransfer ke media padat dan diinkubasi selama 72 jam pada ruang gelap pada suhu 25 o C. Untuk membedakan antara tanaman transgenik dan non-transgenik kultur diseleksi dengan menggunakan antibiotik higromisin 50 mg/l. Seleksi pada media antibiotik dilakukan selama 2-3 minggu. Setelah itu, kultur kalus yang berhasil lolos dari media seleksi diinduksi tunas dan akarnya pada media regenerasi yang mengandung IAA (indole acetic acid) (0.5 mg/l) dan BAP (6- benzilaminopurin) (3 mg/l) di kondisi terang (12 jam) dan gelap (12 jam). Formatted: Subscript Analisis molekular ekspresi gen entc dan pmsb pada tanaman padi transgenik Nipponbare T-DNA yang disisipkan pada genom padi Nipponbare untuk ekspresi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri mengandung tiga buah ekspresi gen yaitu gen hph, entc, dan pmsb. Verifikasi keberadaan gen pada tingkat DNA dilakukan dengan analisis Southern. Southern blot dilakukan pada membran nilon menggunakan bufer garam tinggi (Ausebel et al. 2002). Hibridisasi untuk Southern dilakukan berdasarkan Memelink et al. (1994). DNA genomik padi diisolasi dengan menggunakan bufer ekstraksi yang terdiri dari 1 volume 2x bufer isolasi, 1 volume 10 M urea, 5% fenol:klorofom:isoamilalkohol (25:24:1), dan 1% isoamilalkohol. Komposisi 2x bufer isolasi terdiri dari 0.6 M

66 50 NaCl, 100 mm Tris ph 8.0, 40 mm EDTA, 4% N-Lauryl sarcosine, dan 1% sodium dodecyl sulfat. DNA selanjutnya diisolasi dengan ekstraksi fenol dan pengendapan dengan etanol seperti dijelaskan dalam Ausubel et al. (2002). Untuk mengkonfirmasi ekspresi gen pada tingkat RNA dilakukan analisis Northern seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (hal 32) Pengukuran asam salisilat dan asam salisilat glukosida Analisis tingkat konsentrasi SA dan SAG dilakukan sesuai dengan Verberne et al. (2000) yang dilakukan dua kaliengan duplikasi. Asam salisilat dihitung melalui kromatografi menggunakan kolom Phenomenex tipe LUNA 3μ C18 (2) 50 x 4.60 mm x 3μm memakai Security Guard dari Phenomenex (Metrohm, Herisau, Switzerland). Pelarut 90% 0.2 M sodium asetat, ph 5.5, dan 10% methanol digunakan dengan laju aliran 0.80 ml per menit. Asam salisilat dideteksi dengan detektor spektrofluorometer Shimadzu RF-10Axl pada panjang gelombang emisi 407 nm dan panjang gelombang eksitasi 305 nm. Formatted: Left

67 51

68 52 HASIL DAN PEMBAHASAN 1 Hasil penelitian karakterisasi gen HD-Zip 1.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman Penapisan gen HD-Zip tanaman padi terhadap sejumlah cekaman abiotik dilakukan untuk mengidentifikasi gen HD-Zip yang responsif terhadap cekaman abiotik tertentu. Sebanyak 26 gen HD-Zip padi Oryza O. sativa homeobox (Oshox) telah berhasil diidentifikasi melalui eksplorasi genom padi. Tujuh gen Oshox lainnya yaitu Oshox1 sampai Oshox-7 telah diidentifikasi oleh Meijer et al. (1997). Gen HD-Zip baik yang berasal dari eksplorasi pada database di GeneBankGen maupun yang berasal dari Meijer et al. (1997) (total 33 gen) digolongkan ke dalam famili I, II, dan III. Ke-33 gen HD-Zip tersebut secara rinci disajikan pada Tabel 6. Sedangkan ggen HD-Zip diklasifikasikan menjadi empat famili I-IV berdasarkan pola urutan DNA khusus yang diikatnya (Tabel 1). Diskripsi ke33 gen HD-Zip tersebut secara rinci disajikan pada Tabel 6. Tabel 6 menunjukkan bahwa gen Oshox (1 sampai -33) yang berhasil diekplorasi tersebar hampir pada semua kromosom padi (padi memiliki 12 kromosom), yaitu kromosom 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, dan 12 dengan pola penyebaran yang tidak merata. Pada kromosom yang sama bisa ditemukan gen Oshox lebih dari satu famili, misalnya pada kromosom 10 ditemukan gen Oshox1 dari Famili II, gen Oshox8 dari Famili I, dan Oshox9 dari Famili III. Tidak ada satupun dari gen Oshox yang telah dieksplorasi berasal dari Famili IV. Sejumlah gen Oshox yang dieksplorasi dapat diakses pada nomor aksesi tertentu sementara sebagian yang lainnya masih merupakan data in silico. Kultivar yang dipakai sebagai sumber DNA gen Oshox pada GeneBankGen adalah Pokali, Nipponbare, dan kultivar Indica. 1.2 Respon gen HD-Zip padi terhadap cekaman abiotik Respon beberapa gen HD-Zip pada berbagai kultivar padi dianalisis pada sejumlah cekaman abiotik pada tingkat transkripsi menggunakan analisis Northern. Cekaman abiotik yang diberikan adalah kekeringan, salinitas, kejutpanas, dan pemberian hormon tanaman asam absisat. Beberapa gen seperti salt dan Oshsp16.9 dipakai sebagai kontrol kondisi cekaman yang diberikan. Formatted: Portuguese (Brazil)

69 Formatted Table... [1] 53 Formatted Table... [2] Formatted... [3] Formatted... [4] Tabel 6 Distribusi gen-gen HD-Zip famili I, II, dan III pada kromosom padi Oryza O. sativa No. Gen Famili Kromosomms Aksesi Sumber Formatted Klon... [18] 1 Oshox 1 II2 10 X96681X9668_1 Indica Formatted... [19] IR58 Formatted... [20] 2 Oshox 2 II2 6 AF145726AF14572_6 Indica IR58 Formatted... [21] 3 Oshox 3 II2 1 AF145727AF14572_7 Indica IR58 Formatted... [22] 4 Oshox 4 1I 9 AF145728AF14572_8 Indica IR58 Formatted... [23] 5 Oshox 5 I1 8 AF145729AF14572_9 Indica Formatted IR58... [24] 6 Oshox 6 I1 9 AF145730AF14573_0 Indica Formatted IR58... [25] 7 Oshox 7 II2 2 AF145731AF14573_1 Indica Formatted... [26] IR58 Formatted... [27] 8 Oshox 8 I1 10 AY554036AY554036_ Japonica Nipponbare Formatted S1802S1802_... [28] 9 Oshox 9 3III 10 AY554037AY554037_ Japonica Nipponbare Formatted S10307S10307_... [29] 10 Oshox 10 III3 3 AY554035AY554035_ Indica Pokali Formatted OC03C08OC03C08_... [30] 11 Oshox 11 II2 9 AY554038AY554038_ Japonica Formatted Nipponbare... [31] 12 Oshox 12 I1 3 AY554034AY554034_ Indica Formatted... [32] Pokali OG05G01OG05G01_ 13 Oshox 13 I1 3 AY554032AY554032_ Japonica Formatted... [33] Nipponbare R10191R10191_ Formatted... [34] 14 Oshox 14 I1 7 AY559047AY559047_ Japonica Nipponbare Formatted C51865C51865_... [35] 15 Oshox 15 II Oshox 16 I1 2 AY554029AY55402_9 Japonica Nipponbare Formatted R4057R4057_... [37] 17 Oshox 17 II2 4 Formatted... [38] 18 Oshox 18 II2 6 Formatted... [39] 19 Oshox 19 II2 3 AY554031AY55403_1 Japonica Formatted... [40] Nipponbare S6489S648_9 Formatted... [41] 20 Oshox 20 I1 8 Formatted... [42] 21 Oshox 21 I1 3 Formatted... [43] 22 Oshox 22 I1 4 AY554030AY55403_0 Japonica Nipponbare Formatted S21914S2191_4... [44] 23 Oshox 23 I Oshox 24 I Oshox 25 I Oshox 26 II2 2 Formatted... [5] Formatted... [6] Formatted... [7] Formatted... [8] Formatted... [9] Formatted... [10] Formatted... [11] Formatted... [12] Formatted... [13] Formatted... [14] Formatted... [15] Formatted... [16] Formatted... [17] Formatted... [36] Formatted... [45] Formatted... [46] Formatted... [47] Formatted... [48] Formatted... [49] Formatted... [50] Formatted... [51] Formatted... [52] Formatted... [53] Formatted... [54]

70 54 27 Oshox 27 I1 8 AY559049AY55904_9 Japonica Nipponbare Formatted: Right 28 Oshox 28 II2 6 AY554033AY554033_ Japonica Nipponbare Formatted: S6329S6329_ Left 29 Oshox 29 III3 1 AY559050AY55905_0 Japonica Nipponbare Formatted: Right 30 Oshox 30 II2 10 AY559048AY55904_8 Japonica Formatted: Left Nipponbare Formatted: Right 31 Oshox 31 II2 10 Formatted: Left 32 Oshox 32 III3 3 AY559044AY55904_4 Japonica Nipponbare Formatted: Right 33 Oshox 33 III3 12 Formatted: Left Formatted: Right Formatted: Left 1.2 Respon gen HD-Zip padi terhadap cekaman abiotik Respon beberapa gen HD-Zip pada berbagai kultivar padi dianalisis pada sejumlah cekaman abiotik pada tingkat transkripsi menggunakan analisis Northern. Cekaman abiotik yang diberikan adalah kekeringan, salinitas, kejutpanas, dan pemberian hormon tanaman asam absisat. Beberapa gen seperti salt dan Oshsp16.9 dipakai untuk mengontrol kondisi cekaman yang diberikan. Formatted: Right Formatted: Left Formatted: Right Formatted: Left Gambar 16 Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan selama 0 sampai 48 jam menggunakan gen salt sebagai penanda. Tanda panah menunjukkan terjadinya induksi gen salt pada tingkat transkripsi. j: jam Pola transkripsi gen salt selama cekaman kekeringan meningkat dan mencapai puncaknya pada 24 jam setelah cekaman kekeringan kecuali pada kultivar IRAT112. IRAT112 menunjukkan puncak ekspresi gen pada 48 jam setelah pemberian cekaman (Gambar 16). Gen salt terinduksi setelah 4 jam cekaman kekeringan, terjadi pada kultivar Cabacu, Cisadane, dan Nipponbare. Namun pada kultivar IRAT112 dan T-309 induksi gen salt membutuhkan waktu Formatted: Swedish (Sweden)

71 55 yang jauh lebih lama, yaitu setelah 24 jam terpapar cekaman kekeringan. Kelompok tanaman yang tidak mendapatkan perlakuan cekaman kekeringanabiotik (kontrol) sama sekali tidak menunjukkan induksi gen salt. Pola ekspresi gen salt dipakai untuk mengontrol pemberian cekaman kekeringan. Transkripsi gen Protein Oshsp16.9 akan meningkat pada saat tanaman terpapar cekaman kejut panas. Pada dua kultivar padi yang digunakan untuk cekaman kejut panas, yaitu Nipponbare dan Taipei menunjukkan transkripsi gen Oshsp16.9 meningkat pada saat tanaman tercekam papar kejut panas (Gambar 17). Kondisi ini memberikan indikasi bahwa kultivar Nipponbare dan Taipei telah mengalami kejut-panas. Formatted: Dutch (Netherlands) Gambar 17 Transkripsi gen protein Oshsp16.9 Oryza O. sativa: perlakuan kejut-panas diberikan selama 2 jam pada suhu 42 o C menggunakan analisis Northern. NB: Nipponbare; TP: Taipei, -: tanpa perlakuan kejut-panas; +: perlakuan kejut-panas. Formatted: Justified Hasil analisis molekular pada tingkat RNA menggunakan analisis Northern memperlihatkan bahwa beberapa gen Oshox memperlihatkan respon terhadap cekaman abiotik tertentu (Tabel 7). Bentuk respon yang muncul dapat berupa induksi atau represi. Gen HD-Zip padi seperti Oshox3 mengalami induksi pada saat terkena cekaman kejut panas (Gambar 18). Sementara gen Oshox19 mengalami induksi pada saat terpapar cekaman kekeringan (Gambar 19). Gen HD-Zip yang menunjukkan respon represi terjadi pada gen Oshox6 (Gambar 20) saat terpapar cekaman kekeringan. Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 18 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman

72 56 kejut panas. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perlakuan kejut-panas 42 o C selama 2 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan. Gambar 19 Pola transkripsi RNA HD-Zip Oshox19 pada padi saat cekaman kekeringan 0 sampai 48 jam. j: jam Tanda panah menunjukkan adanya induksi. Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Justified Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 20 Pola transkripsi RNA HD-Zip Oshox6 padi pada saat tercekam papar kekeringan selama 0 sampai 48 jam. j: jam. Tanda panah menunjukkan pola transkripsi terepresi. Gen HD-Zip padi dapat memiliki transkripsi basal dan tidak merespon terhadap cekaman abiotik tertentu yang diberikan. Seperti gen Oshox3 yang tidak menunjukkan respon saat diberikan cekaman perendaman dalam air (Gambar 21), meskipun gen ini dapat terinduksi pada saat diberikan kejut panas (Gambar 18). Gen Oshox23 menunjukkan level transkripsi pada tingkat tertentu namun tidak menunjukkan respon terhadap cekaman kekeringan (Gambar 22). Kondisi ini ditunjukkan oleh munculnya pita transkripsi RNA baik pada tanaman yang Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden)

73 57 mengalami kekeringan maupun tanaman kontrol tetapi pola pita atau ketebalan pita antara kedua tanaman tersebut sama. Gambar 21 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman perendaman. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perendaman selama 4 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan. Gambar 22 Tabel 7 Pola transkripsi RNA HD-Zip Oshox23 padi pada saat cekaman kekeringan selama 0 sampai 48 jam. j: jam.. Respon sejumlah gen Oshox terhadap cekaman abiotik pada tanaman padi Gen Salinitas ABA Kekeringan Perendaman Kejut-Panas Oshox1 Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Oshox2 Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Oshox3 Tidak ada Tidak ada Tidak ada Tidak ada Induksi Oshox4 Tidak ada Tidak ada Represi Induksi Represi Oshox6 Tidak ada Induksi (akar) Represi Tidak ada Represi Oshox9 Induksi Induksi Tidak ada Tidak ada Tidak ada Oshox Induksi - - Oshox Represi - - Oshox Tidak ada - - Oshox Induksi - - Oshox Tidak ada - - Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Line spacing: single Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden)

74 58 -: tidak dilakukan pengujian Tabel 76 menunjukkan salah satu gen Oshox yaitu Oshox4 mengalami represi oleh cekaman kekeringan dan terinduksi oleh perendaman yang merupakan cekaman kebalikan dari kekeringan yang. Hal ini sedikit berbeda dengan gen Oshox6 yang mengalami represi pada saat cekaman kekeringan tetapi tidak memberikan respon pada saat cekaman perendaman. Respon gen Oshox terhadap cekaman kekeringan bisa bersifat represi (Oshox4 dan 6) atau induksi (Oshox19 dan 22). Khusus untuk gen Oshox4 selain respon terhadap cekaman perendaman (Gambar 23) dan kekeringan (Gambar 24) dan juga respon terhadap cekaman kejut panas (Gambar 25). Faktor ini yang menjadikan gen Oshox4 menarik untuk dikarakterisasi lebih lanjut. Pola transkripsi Oshox4 menunjukkan pula irama circadian (Gambar 24). Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Dutch (Netherlands), Dutch (Netherlands) Formatted: Dutch (Netherlands) Gambar 23 Pola transkripsi HD-Zip Oshox4 pada cekaman perendaman. Panah memperlihatkan induksi pada perendaman. NB: Nipponbare; Oshsp16.9: protein kejut panas Oryza O. sativa; perendaman selama 4 jam. -: tanpa perlakuan; +: perlakuan Gambar 24 Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan pada Oshox4 selama 0 sampai 48 jam. Tanda panah menunjukkan terjadinya represi gen Oshox4 di tingkat transkripsi.

75 59 Gambar 25 Pola transkripsi HD-Zip Oshox4 pada cekaman kejut-panas. Panah memperlihatkan represi pada kejut-panas. NB: Nipponbare; Oshsp16.9: protein kejut panas Oryza O. sativa; kejut-panas pada 42 o C selama 4 jam. -: tanpa perlakuan; +: perlakuan Formatted: Swedish (Sweden) 1.3 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan Salah satu gen HD-Zip tanaman padi, yaitu Oshox4, dianalisis lebih jauh. Lokasi Oshox4 adalah pada kromosom 9. Gen Oshox4 terdiri dari tiga buah ekson dan dua buah intron (Gambar 26). Intron I berukuran 116 nukleotida intron II berukuran 126 nukleotida. Oshox4 dengan latar belakang Nipponbare diakses pada AP pada bank genbankgen. Gen ini berukuran 1720 nukleotida. Kode akses pada Bgen bankankgen AF adalah untuk Oshox4 dengan latar belakang Indica. Gen Oshox4 diklon dengan metode yeast one-hybrid (Meijer et al. 2000). Penyamaan urutan DNA antara Oshox4 dengan Antp dan C/EBP dilakukan untuk mengetahui daerah serupa dimiliki pada homeodomain dan motif leusin zipper (Gambar 27). Formatted: Dutch (Netherlands) Formatted: Dutch (Netherlands) Gambar 26 Skema pola ekson-intron Oshox4. Besarnya daerah ekson-intron ditunjukkan oleh angka yang menunjukkan jumlah nukleotida. Pola ekson-intron disusun berdasarkan benk gen AP

76 60 Hasil pencarian EST (expressed sequence tag) gen Oshox4 menunjukkan bahwa ekspresi Oshox4 dapat ditemukani pada semua tahap perkembangan padi dan terinduksi oleh serangan penyakit blas (Tabel 8). Tabel 8 Pencarian esxpressed sequence tag (EST) menggunakan cdna gen Oshox4 Nomor aksesi Nomor klon Deskripsi Kesamaan CB OSJNE09g03 mrna Oryza O. sativa 99% CX EI077T09 Pustaka cdna Oryza O. 97% sativa seluruh siklus hidup CB OSJNEc16G05 cdna Oryza O. sativa 99% CB OSJNEc09G03 mrna Oryza O. sativa 98% CX EI104D09 Pustaka cdna Oryza O. 94% sativa seluruh siklus hidup CX EI098H2O Pustaka cdna Oryza O. 98% sativa seluruh siklus hidup CB OSJNEf01k19 mrna Oryza O. sativa 98% CX EI061D02 Pustaka cdna Oryza O. 98% sativa seluruh siklus hidup BQ M019F01 Pustaka cdna Oryza O. sativa dari daun terinduksi penyakit blas 98% 1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif dari 35S-CaMV Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat Gen Oshox4 difusikan dengan promoter 35S-CaMV selanjutnya disebut 35S-Oshox4. Gen ini lalu diintroduksikan ke dalam genom padi dan A. thaliana untuk melihat pengaruh ekspresi berlebih dari gen HD-Zip padi Oshox4 pada tanaman padi dan kemungkinan penggunaannya untuk meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Tanaman transgenik padi Nipponbare yang mengandung 35S-Oshox4 memperlihatkan ekspresi gen 35S-Oshox4 lebih tinggi daripada tanaman kontrol (Gambar 28A). Tanaman kontrol yang digunakan adalah tanaman transgenik yang mengandung konstruksi DR5-GUS. Konstruksi DR5- GUS adalah konstruksi ekspresi gen GUS yang diatur oleh promoter DR5. Kontrol transgenik dipakai untuk menunjukkan bahwa perubahan fenotipe yang

77 61 terjadi pada padi transgenik yang mengandung gen 35S-Oshox4 bukan karena pengaruh insersi acak T-DNA. Gambar 27 Homeodomain dan motif leucine zipper pada Oshox4. Urutan asam amino didasarkan pada aksesi AP untuk Oshox4 (A) Urutan asam amino daerah homeodomain Oshox4. Tiga heliks alfa Antennapedia (Antp) dari D. melanogaster ditunjukkan dengan garis. Residu protein yang umum dimiliki ditunjukkan dengan (Δ) warna hitam, sedangkan kesamaan Oshox4 dan Antp ditunjukkan dengan tanda (-). (B) Urutan asam amino daerah leucine-zipper dari Oshox4. Motif leucine yang berulang diperbandingkan dengan basic leucine zipper (bzip) dari C/EBP mamalia yang ditunjukkan dengan garis, sementara lokasi leusin diperlihatkan dengan tanda (L). (C) Homeodomain dan motif leucine zipper Oshox4. Posisi tiga heliks alfa dari homeodomain diletakkan pada kotak dan asam amino leusin pada urutan asam amino protein. Formatted: Swedish (Sweden) 1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif dari 35S-CaMV Formatted: Swedish (Sweden) Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat

78 62 Gen Oshox4 difusikan dengan promoter 35S-CaMV selanjutnya disebut 35S-Oshox4. Gen ini lalu diintroduksikan ke dalam genom padi dan A. thaliana untuk melihat pengaruh ekspresi berlebih dari gen HD-Zip padi Oshox4 pada tanaman padi dan kemungkinan penggunaannya untuk meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Tanaman transgenik padi Nipponbare yang mengandung 35S-Oshox4 memperlihatkan ekspresi gen 35S-Oshox4 lebih tinggi daripada tanaman kontrol (Gambar 28A). Tanaman kontrol yang digunakan adalah tanaman transgenik yang mengandung konstruksi DR5-GUS. Konstruksi DR5- GUS adalah konstruksi ekspresi gen GUS yang diatur oleh promoter DR5. Kontrol transgenik dipakai untuk menunjukkan bahwa perubahan fenotipe yang terjadi pada padi transgenik yang mengandung gen 35S-Oshox4 bukan karena pengaruh insersi acak T-DNA. Formatted: English (U.S.) Tabel 8 Pencarian esxpressed sequence tag (EST) menggunakan cdna gen Oshox4 Nomor aksesi Nomor klon Deskripsi Kesamaan CB OSJNE09g03 mrna O. sativa 99% CX EI077T09 Pustaka cdna O. sativa 97% seluruh siklus hidup CB OSJNEc16G05 cdna O. sativa 99% CB OSJNEc09G03 mrna O. sativa 98% CX EI104D09 Pustaka cdna O. sativa 94% seluruh siklus hidup CX EI098H2O Pustaka cdna O. sativa 98% seluruh siklus hidup CB OSJNEf01k19 mrna O. sativa 98% CX EI061D02 Pustaka cdna O. sativa 98% seluruh siklus hidup BQ M019F01 Pustaka cdna O. sativa 98% dari daun terinduksi penyakit blas Semua tanaman transgenik padi yang mengandung peningkatan ekspresi gen Oshox4 memperlihatkan fenotipe kerdil dengan reduksi tinggi tanaman. Tanaman transgenik yang mengandung tingkat ekspresi Oshox4 tinggi ini dapat dikelompokkan menjadi tiga berdasarkan pertumbuhan vegetatifnya. Ketiga kelompok tersebut adalah kelompok dengan fenotipe vegetatif ringan, sedang, dan

79 63 berat (Gambar 28 B-D). Kelompok vegetatif ringan diartikan sebagai kelompok yang menunjukkan fenotipe pertumbuhan tidak berbeda dengan kontrol. Kelompok dengan kategori vegetatif sedang diartikan sebagai kelompok dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif berbeda dengan kontrol. Kelompok berat adalah kelompok dengan kondisi petrumbuhan vegetatif sangat berbeda dengan kontrol. Formatted: Dutch (Netherlands) Formatted: Indent: Left: 0,95 cm

80 64 Gambar 27 Homeodomain dan motif leucine zipper pada Oshox4. Urutan asam amino didasarkan pada aksesi AP untuk Oshox4 (A) Urutan asam amino daerah homeodomain Oshox4. Tiga heliks alfa Antennapedia (Antp) dari D. melanogasterrosophila ditunjukkan dengan garis. Residu protein yang umum dimiliki ditunjukkan dengan (Δ) warna hitam, sedangkan kesamaan Oshox4 dan Antp ditunjukkan dengan tanda (-). (B) Urutan asam amino daerah leucine-zipper dari Oshox4. Motif leucine yang berulang diperbandingkan dengan basic leucine zipper (bzip) dari C/EBP mamalia yang ditunjukkan dengan garis, sementara lokasi leusin diperlihatkan dengan tanda (L). (C) Homeodomain dan motif leucine zipper Oshox4. Posisi tiga heliks alfa dari homeodomain diletakkan pada kotak dan asam amino leusin pada urutan asam amino protein. Formatted: Swedish (Sweden), Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Font: Not Bold, Swedish (Sweden)

81 65 Formatted: Swedish (Sweden) 1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif dari 35S-CaMV Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat Gen Oshox4 difusikan dengan promoter 35S-CaMV selanjutnya disebut 35S-Oshox4. Gen lalu diintroduksikan ke dalam genom padi dan Arabidopsis untuk melihat pengaruh ekspresi berlebih dari gen HD-Zip padi Oshox4 pada tanaman padi dan kemungkinan penggunaannya untuk meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Tanaman transgenik padi Nipponbare yang mengandung 35S-Oshox4 memperlihatkan ekspresi gen 35S-Oshox4 lebih tinggi daripada tanaman kontrol (Gambar 28A). Tanaman kontrol yang digunakan adalah tanaman transgenik yang mengandung konstruksi DR5-GUS. Konstruksi DR5- GUS adalah konstruksi ekspresi gen GUS yang diatur oleh promoter DR5. Kontrol transgenik dipakai untuk menunjukkan bahwa perubahan fenotipe yang terjadi pada padi transgenik yang mengandung gen 35S-Oshox4 bukan karena pengaruh insersi acak T-DNA. Semua tanaman transgenik padi yang mengandung peningkatan ekspresi gen Oshox4 memperlihatkan fenotipe kerdil dengan reduksi tinggi tanaman. Tanaman transgenik yang mengandung tingkat ekspresi Oshox4 tinggi ini dapat dikelompokkan menjadi tiga, berdasarkan pertumbuhan vegetatifnya. Ketiga kelompok tersebut adalah kelompok dengan fenotipe vegetatif ringan, sedang, dan berat (Gambar 28 B-D). Kelompok vegetatif ringan diartikan sebagai kelompok yang menunjukkan fenotipe pertumbuhan tidak berbeda dengan kontrol. Kelompok dengan kategori vegetatif sedang diartikan sebagai kelompok dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif berbeda dengan kontrol. Kelompok berat adalah kelompok dengan kondisi petrtumbuhan vegetatif sangat berbeda dengan kontrol. Formatted: Dutch (Netherlands) Formatted: Dutch (Netherlands)

82 66 Gambar 28 Fenotipe padi transgenik kultivar Nipponbare hasil transformasi menggunakan konstruksi Oshox4 yang dikontrol oleh promoter 35S. A. Verifikasi Northern pada tanaman dengan ekspresi Oshox4 yang meningkat. B adalah kontrol tanaman mengandung konstruksi pdr5-gus. C. Kelompok transgenik dengan tingkat Oshox4 yang meningkat dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif sedang, dan D. fenotipe pertumbuhan vegetatif tereduksi berat Penurunan tinggi tanaman pada tanaman padi transgenik yang mengandung Oshox4 diakibatkan oleh panjang ruas batang (Gambar 29) dan daun bendera (Gambar 30) mengalami reduksi. Pengukuran panjang ruas batang pertama, ke dua dan ke tiga menunjukkan adanya reduksi yang cukup signifikan antara tanaman padi transgenik Oshox4 dengan tanaman kontrol (Gambar 29A). Pengukuran ruas batang dilakukan untuk melihat besarnya reduksi tinggi tanaman yang terjadi. Elongasi ruas batang memberikan kontribusi pada tinggi tanaman padi.

83 67 Reduksi ruas batang ini lebih disebabkan oleh pengurangan ukuran batang secara longitudinal (panjang ruas batang) daripada oleh transversal (diameter batang) (Gambar 29B). Terbukti dengan adanya reduksi panjang sel yang terjadi pada sayatan jaringan ruas batang secara longitudinal (Gambar 29D & F), sementara pada sayatan jaringan ruas batang secara tranversal tidak menunjukkan reduksi ukuran sel (Gambar 29C & D). Gambar 29 Analisis panjang ruas batang. Daerah berwarna gelap pada A dan B adalah 35S-Oshox4, sementara daerah berwarna putih pada A dan B adalah kontrol. C (sayatan transversal) dan D (sayatan longitudinal) pada ruas batang kontrol. E dan F adalah sayatan transversal dan longitudinal ruas batang padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4. Anak panah menunjukkan daerah sel yang diukur. Angka 1,2, dan 3 menunjukkan posisi ruas batang yang diamati. Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Right: 0 cm Reduksi ruas batang ini lebih disebabkan oleh pengurangan ukuran batang secara longitudinal (panjang ruas batang) daripada oleh transversal (diameter batang) (Gambar 29B). Terbukti dengan adanya reduksi panjang sel yang terjadi Formatted: French (France) Formatted: French (France) Formatted: French (France)

84 68 pada sayatan jaringan ruas batang secara longitudinal (Gambar 29D & F), sementara pada sayatan jaringan ruas batang secara tranversal tidak menunjukkan reduksi ukuran sel (Gambar 29C & D). Penurunan panjang daun bendera pada tanaman padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4 cukup sigfnifikan, hampir 10 cm perbedaan panjangnya dengan tanaman kontrol (Gambar 30A). Penurunan ini diakibatkan oleh ukuran sel pada tanaman trangenik padi ternyata lebih kecil daripada tanaman padi kontrol (Gambar 30B).

85 69 Penurunan panjang daun bendera pada tanaman padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4 cukup sigfnifikan, hampir 10 cm perbedaan panjangnya dengan tanaman kontrol (Gambar 30A). Penurunan ini diakibatkan oleh ukuran sel pada tanaman trangenik padi ternyata lebih kecil daripada tanaman padi kontrol (Gambar 30B). Gambar 30 Panjang daun bendera tanaman padi dengan Oshox4 yang berlebih. A. Panjang daun bendera; B. Panjang sel longitudinal dari daun bendera. C. Sayatan longitudinal daun bendera kontrol. D Sayatan longitudinal daun bendera tanaman 35S-Oshox4. Fenotipe padi 35S-Oshox4 tidak memunculkan nodus leher batang karena selubung daun dari daun bendera lebih panjang daripada ruas batang pertama. Kondisi ini mengakibatkan sebagian lema/ dan palea padi 35S-Oshox4 tidak muncul. Keadaan ini berakibat pada jumlah biji yang dihasilkan padi 35S-Oshox4 relatif sedikit dibanding tanaman padi kontrol. Sedikitnya jumlah biji yang dihasilkan diduga juga disebabkan tidak sempurnanya polen yang terbentuk. Dugaan ini diperkuat oleh kenyataan bahwa jumlah bulir padi yang hampa lebih banyak terjadi pada padi 35S-Oshox4 (Gambar 31G) daripada tanaman kontrol, sedangkan panjang malai utama, jumlah cabang primer dan sekunder malai tidak

86 70 memperlihatkan perbedaan antara padi 35S-Oshox4 dengan tanaman kontrol (Gambar 31I). Gambar 31 Fenotipe malai. A: Lemna/ dan palea kontrol; B: Organ reproduksi kontrol; C: Polen kontrol (panah menunjukkan bentuk polen normal). D: Lemna dan /palea 35S-Oshox4; E: Organ reproduksi 35S-Oshox4; F: Polen 35S-Oshox4 (panah menunjukkan bentuk polen normal); G: Jumlah bunga yang dihasilkan tiap malai dan jumlah bunga yang tidak menjadi biji (hampa), 35S-Oshox4 ditandai dengan warna abu-abu; H: Perbandingan panjang selubung daun dari daun bendera pada ruas batang pertama, ruas batang pertama ditandai dengan warna putih; I: perbandingan ukuran sumbu paenikel, cabang primer dan sekunder, 35S-Oshox4 ditandai dengan warna abu-abu. Tanaman padi transgenik mengandung konstruksi gen 35S-Oshox4 memperlihatkan fase vegetatif yang lebih lama (Gambar 32). Transgenik 35S- Oshox4 berbunga lebih lama daripada tanaman padi kontrol. Tanaman 35S- Oshox4 baru menghasilkan bunga setelah umurwaktu empat bulan sementara

87 71 kontrol telah menghasilkan biji pada waktu yang sama. Akan tetapi tanaman padi 35S-Oshox4 tidak tidak banyak menghasilkan benih yang fértil. Gambar 32 Fenotipe tanaman 35S-Oshox4 pada umur 2,4, dan 10 bulan Uji kekeringan pada tanaman Arabidopsis A. thaliana yang mengandung ekspresi Oshox4 Tingkat ketahanan tanaman tahan kekeringan yang mengandung Oshox4 diuji pada tanaman model A. thaliana. Transgenik A. thaliana mengandung 35S- Oshox4 mampu bertahan dari kekeringan selama 21 hari (Gambar 33). Tanaman A. thaliana transgenik 35S-Oshox4 AT4-1 dari dua ulangan dengan jumlah tanaman sebanyak 20 tiap ulangannya, lebih dari 90% tanaman yang masih dapat bertahan dan pada AT4-8 hanya sekitar 10% yang dapat hidup. Sementara itu pada blok pertama percobaan tanaman control 35S-hph K-1 sekitar hampir 20% tanaman yang bertahan hidup (Gambar 33C). Kondisi kekeringan lebih dari 21 hari mengakibatkan tanaman A. thaliana transgenik Oshox4 tidak bisa bertahan hidup lebih lama. Setelah 30 hari dalam kondisi kekeringan tidak satupun tanaman transgenik A. thaliana mengandung 35S-Oshox4 yang dapat hidup. Fenotipe transgenik A. thaliana 35S-Oshox4 menunjukkan penurunan tinggi yang tidak begitu nyata dibanding transgenik 35S-hph (kontrol). Penurunan tinggi pada tanaman A. thaliana berhubungan dengan penurunan jumlah dan elongasi sel seperti pada transgenik padi 35S-Oshox4 belum diketahui., Spanish (Mexico), Spanish (Mexico)

88 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4 RNAi dilakukan dengan mengintroduksi sense-intron-anti-sense Oshox4 pada tanaman padi kultivar Nipponbare. Hasil analisis Northern menunjukkan bahwa ekspresi pada tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi Oshox4 memperlihatkan penurunan transkripsi Oshox4 (Gambar 34B). Fakta ini diambil setelah membandingkan ketebalan pita transkripsi Oshox4 pada tanaman padi yang mengandung gen Oshox4 dengan pita transkripsi RNAi Oshox4 (Gambar 34A). Tanaman transgenik yang mengandung konstruksi RNAi menunjukkan pita yang lebih tipis, yang berarti ada penurunan pada level transkripsi.

89 73 Gambar 33 Pengujian ketahanan kekeringan ArabidopsisA. thaliana mengandung 35S-Oshox4. Tanaman dibiarkan tanpa air selama 21 hari. A. Kondisi tanaman pada 19 hari tanpa pemberian air (+). B. Survival tanaman tanpa pemberian air selama 21 hari. C. Presentasi kemampuan bertahan transgenik ArabidopsisA. thaliana mengandung 35S-Oshox4 (AT4-1 sampai AT4--10) dibanding kontrol (K1 sampai K4-). Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Justified Formatted: Swedish (Sweden) Tingkat ketahanan tanaman tahan kekeringan yang mengandung Oshox4 diuji pada tanaman model Arabidopsis A. thaliana. Transgenik Arabidopsis A. thaliana mengandung 35S-Oshox4 mampu bertahan dari kekeringan selama 21 hari (Gambar 33). Tanaman ArabidopsisA. thaliana transgenik Oshox4 pada satuan percobaan satu sekitar 90% tanaman yang masih dapat bertahan dan pada satuan percobaan delapan hanya sekitar 10% yang dapat hidup. Sementara itu pada blok pertama percobaan tanaman kontrol sekitar hampir 20% tanaman yang bertahan hidup (Gambar 33C). Kondisi kekeringan lebih dari 21 hari mengakibatkan tanaman A. rabidopsisthaliana transgenik Oshox4 tidak bisa bertahan hidup lebih lama. Setelah 30 hari dalam kondisi kekeringan tidak satupun tanaman transgenik A.rabidopsis thaliana mengandung 35S-Oshox4 yang dapat hidup. Fenotipe transgenik A.rabidopsis thaliana 35S-Oshox4 menunjukkan penurunan tinggi yang tidak begitu nyata dibanding transgenik Arabidopsis 35Shph (kontrol). Belum diketahui apakah ppenurunan tinggi pada tanaman A. thaliana berhubungan dengan penurunan jumlah dan elongasi sel seperti pada transgenik padi 35S-Oshox4 belum diketahui. Formatted: Swedish (Sweden), Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden), Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden), Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden), Spanish (Mexico), Spanish (Mexico) 1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4 RNAi dilakukan dengan mengintroduksi sense-intron-anti-sense Oshox4 pada tanaman padi kultivar Nipponbare. Hasil analisis Northern menunjukkan bahwa ekspresi pada tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi Oshox4 memperlihatkan penurunan transkripsi Oshox4 (Gambar 34B). Fakta ini diambil setelah membandingkan ketebalan pita transkripsi Oshox4 pada tanaman padi yang mengandung gen Oshox4 dengan pita transkripsi RNAi Oshox4 (Gambar Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold

90 74 34A). Tanaman transgenik yang mengandung konstruksi RNAi menunjukkan pita yang lebih tipis, yang berarti ada penurunan pada level transkripsi. Tanaman padi transgenik yang mengandung konstruksi RNAi memperlihatkan fenotipe yang tidak berbeda dengan fenotipe tanaman PO4 yang mengekspresikan gen Oshox4 pada kondisi alami. Namun fenotipe tanaman transgenik RNAi berbeda dengan tanaman transgenik T1 35S-Oshox4 yangg mengeksperikan Oshox4 secara terus menerus. Fakta ini menyiratkan bahwa penurunan level ekspresi Oshox4 pada tanaman padi tidak mengakibatkan perubahan fenotipe padi. Formatted: Centered

91 75 Gambar 34 Analisis Northern tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi menggunakan konstruksi Hannibal. A. Analisis Northern tanaman mengandung konstruksi PO4 dan T 1 tanaman 35S-Oshox4. B. Analisis Northern tanaman transgenik Nipponbare mengandung konstruksi RNAi-Oshox4. Angka atau kode menunjukkan asal kalus. Tidak dijumpainya perubahan fenotipe yang nyata padi transgenik yang mengandung konstruksi RNAi Oshox4 menunjukkan bahwa mungkin Oshox4 tidak memiliki pengaruh pada fenotipe apabila transkripsinya levelnya diturunkan. Tanaman padi memiliki basal ekspresi Oshox4 yang berbeda-beda. Level ekspresi dibawah basal mungkin tidak memberi pengaruh pada tanaman akan tetapi membawa pengaruh pada penurunan tingkat ketahanan terhadap cekaman kekeringan. Formatted: Swedish (Sweden) Formatted: Swedish (Sweden) 1.6 Analisis pola ekspresi gen Oshox4 Daerah promoter gen Oshox4 yang berukuran kira-kira 2.5 kb difusikan dengan gen penanda GUS selanjutnya disebut dengan PO4. Gen GUS diekspresikan pada jaringan pada daerah daun, akar, lema dan palea, serta embrio. (Gambar 35A, D, G, dan I), dibuktikan dengan adanya warna biru pada daerah tersebut. Pada daun, akar, lema dan palea, gen GUS diekspresikan pada bagian jaringan pembuluh. Pada jaringan pembuluh daun, gen GUS terekspresi khusus pada jaringan pembuluh ayak (Gambar 35F). Ekspresi GUS juga tampak pada jaringan pembuluh di skutelum (Gambar 35H). Ekspresi GUS tidak muncul pada ujung akar melainkan hanya pada bagian akar yang telah berdeferensiasi (Gambar 35C). Pada embrio memperlihatkan Oshox4 terekspresi sejak dini.

92 76 Gambar 35 Lokasi ekspresi gen GUS yang dikendalikan oleh promoter Oshox4 pada jaringan tanaman padi kultivar Nipponbare. A. Jaringan daun. B. Jaringan daun setelah diberikan perlakuan cekaman kekeringan 24 jam. C. Kecambah padi. D. Akar dengan potongan longitudinal. E. Akar dengan potongan transversal. F. Jaringan pembuluh pada daun. G. Lemma dan palea. H. Potongan longitudinal benih padi. I. Embrio padi. V: jaringan pembuluh. SC: skutelum. PH: pembuluh floemayak. Tanaman yang mengandung PO4 menunjukkan penurunan ekspresi gen GUS pada saat tanaman terpapar kekeringan (Tabel 9). Gen GUS masih terdeteksi pada saat 8 jam setelah tanaman mendapat cekaman kekeringan. Setelah 24 jam cekaman kekeringan gen GUS tidak berhasil dideteksi lagi, sementara tanaman yang tidak diberi cekaman kekeringan masih mengekspresikan gen GUS. Formatted: Dutch (Netherlands) Formatted: Dutch (Netherlands)

93 77 Tanaman yang mengandung PO4 menunjukkan penurunan ekspresi gen GUS pada saat tanaman terpapar kekeringan (Tabel 9). Gen GUS masih terdeteksi pada saat 8 jam setelah tanaman mendapat cekaman kekeringan. Setelah 24 jam cekaman kekeringan gen GUS tidak berhasil dideteksi lagi, sementara tanaman yang tidak diberi cekaman kekeringan masih mengekspresikan gen GUS. Tabel 9 Ekspresi GUS pada tanaman transgenik poshox4-gus saat terpapar cekaman kekeringan Lama Cekaman Kontrol Perlakuan jam jam jam jam jam : ada ekspresi gen GUS -: tidak ada ekspresi gen GUS 2 Hasil penelitian introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri ke tanaman padi Gen entc dan gen pmsb (Verberne et al. 2000) yang merupakan gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri disisipkan ke dalam plasmid pc1300. Ekspresi dari kedua gen pada tanaman padi diatur oleh promoter 35S-CaMV. 2.1 Analisis Northern gen hph Analisis Northern menggunakan gen hph ditujukan untuk melihat transkripsi gen hph pada tanaman transgenik mengandung gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri. Gen hph merupakan gen resistensi antibiotik higromisin. Hampir semua sampel tanaman transgenik yang dianalisis menunjukkan kemampuan untuk mentranskripsi gen hph, kecuali pada 3 sampel tanaman (No. 8C, 8D dan.6b) (Gambar 36). Artinya ada sejumlah tanaman yang tadinya lolos dalam media seleksi antibiotik higromisin ternyata tidak mengekspresikan gen antibiotik tersebut.

94 Analisis Northern gen entc Analisis Northern menggunakan gen entc dilakukan untuk melihat ekspresi gen entc pada tingkat transkripsi. Hasil analisis memperlihatkan ada dua tanaman transgenik Nipponbare (7B dan 4E) yang mampu mentranskripsi gen entc (Gambar 37). Dari galur 7B terdapat dua individu tanaman yang memperlihatkan transkripsi gen entc, sementara itu dari galur 4E hanya satu individu tanaman yang dapat mengekspresikan gen tersebut. Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 36 Northern blot dari tanaman padi mengandung gen entc dan pmsb konstruksi asam salisilat yang berasal dari asal mikroba dengan menggunakan higromisin fosfotransferase (hph) sebagai penanda. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus. 2.2 Analisis Northern gen entc Analisis Northern menggunakan gen entc dilakukan untuk melihat ekspresi gen entc pada tingkat transkripsi. Hasil analisis memperlihatkan ada dua tanaman transgenik Nipponbare (7B dan 4E) yang mampu mentranskripsi gen entc (Gambar 37). Dari galur 7B terdapat dua individu tanaman yang memperlihatkan transkripsi gen entc, sementara itu dari galur 4E hanya satu individu tanaman yang dapat mengekspresikan gen tersebut. Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 37 Northern blot menggunakan penanda entc pada tanaman padi transgenik Nipponbare mengandung biosintesis asam salisilat asal bakteri. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus. Angka yang tidak diikuti oleh kode huruf menunjukkan individu tanaman. Formatted: Swedish (Sweden)

95 79 Formatted: Swedish (Sweden) 2.3 Analisis Southern gen pmsb Analisis Southern gen pmsb dilakukan untuk verifikasi keberadaan gen pmsb pada genom padi transgenik Nipponbare. Hasil analisis Southern pada gen pmsb menghasilkan pita DNA yang kurang jelas (Gambar 38). Walaupun demikian, masih bisa diidentifikasi tanaman yang mengandung sisipaninsert gen pmsb. Gen pmsb berhasil terintegrasi pada tanaman no.4a, 4C, 4D, 6B, 7B, 8C dan 8D. Sejumlah tanaman transgenik padi lainnya (3A, 6D, 11B, 11C, dan 11D) tidak memperlihatkan integrasi gen pmsb ke dalam genom tanaman (Gambar 38). Keadaan ini diduga karena besarnya ukuran T-DNA yang diintegrasikan. Formatted: Swedish (Sweden) Gambar 38 Southern blot dari tanaman transgenik padi mengandung konstruksiasam salisilat asal bakteri dengan menggunakan pmsb sebagai pelacak. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus. 2.4 Kandungan asam salisilat Kandungan asam salisilat pada tanaman padi secara umum bervariasi. Padi kultivar IRAT112 memiliki kandungan asam salisilat paling rendah dibandingkan kultivar yang diuji (Gambar 39). Pada fase bibit rata-rata kandungan asam salisilat lebih tinggi dibandingkan kandungan asam salisilat glukosida (SAG) yang merupakan bentuk tidak aktif dari asam salisilat. Fenomena ini terjadi pada semua kultivar padi yang diuji.