BAB III. METODOLOGI PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT a. Bahan Bahan baku yang digunakan adalah kacang komak (Lablab purpureus (L.) Sweet) yang diperoleh dari daerah Probolinggo, Jawa Timur. Sedangkan bahan kimia yang digunakan adalah heksana, HCl pekat, NaOH 1 N, K 2 SO 4, HgO, H 2 SO 4 pekat, akuades, NaOH-Na 2 S 2 O 3 pekat, H 3 BO 3, HCl 0.02 N, indikator merah metil serta metil biru, HCl 25%, HCl 6 N, HCl 0.01 N, NaOH 0.01 N, HNO 3 pekat, NaOH 2 N, minyak jagung, HCl 0.1 N, NaOH 0.1 N, larutan multienzim (tripsin, kimotripsin, dan pankreatin), buffer asetat 0.1 M (ph 5.50), radikal bebas DPPH 3mM dalam metanol, asam askorbat, metanol 80%, buffer Tris-HCl 100mM, buffer fosfat 0.2 M ph 6.60, kalium ferri sianida (K 3 Fe(CN) 6 ) 1%, larutan trikloroasetat (TCA) 10%, larutan FeCl 3 0.1%, HNO M, etanol 95 %, pereaksi Folin Ciocalteau 50% (v/v), Na 2 CO 3 5 % (w/v), dan larutan standar asam galat. b. Alat Alat-alat yang digunakan antara lain wadah germinasi, ember, daun pisang, refrigerator, blender, pin disc mill, ayakan 60 mesh, kain saring, waterbath, kertas saring, sentrifus, oven pengering, oven vakum, desikator, ph meter, cawan porselen, cawan aluminium, pipet tetes, pipet volumetrik, pipet mohr, neraca analitik, labu Kjeldahl 100 ml, alat destilasi, labu lemak, alat ekstraksi soxhlet, gelas piala, batu didih, gelas arloji, tanur, Chromameter CR-310 Minolta, Aw meter, whiteness meter, gelas ukur 100 ml, tabung reaksi, erlenmeyer 125 ml, batang gelas, magnetic stirer, ultratorax, tabung sentrifus, vortex, alumunium foil, shaker, botol gelap, tabung reaksi bertutup, alat spektrofotometer, dan hot plate.

2 B. METODE PENELITIAN Kacang komak Kondisi germinasi terbaik yaitu waktu perendaman 12 jam dan waktu germinasi 30 jam Produksi kecambah dengan waktu perendaman 12 jam dan waktu germinasi 30 jam Penepungan dengan pin disc mill ayakan 60 mesh Pembuatan konsentrat protein kecambah dan kontrol Pembuatan fraksi protein dan nonprotein tepung kecambah serta kontrol Pengujian proksimat Pengujian fisikokimia Pengujian fungsional protein Pengujian kapasitas antioksidan Kadar air Kadar abu Kadar protein Kadar lemak Kadar karbohidrat Total Colour Derajat putih Densitas kamba Aw Daya cerna protein in vitro Daya serap air Daya serap minyak Daya emulsi Kekuatan gel Kapasitas busa Stabilitas busa PDI & NSI WAI & WSI Uji DPPH Kemampuan mereduksi Total fenol Gambar 5. Skema metode penelitian studi sifat fisikokimia, fungsional protein, dan kapasitas antioksidan pada konsentrat protein kecambah kacang komak (Lablab purpureus (L.) Sweet)

3 a. Penelitian pendahuluan Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui waktu perendaman dan waktu germinasi terbaik untuk memproduksi kecambah kacang komak. Waktu perendaman yang diujikan adalah 12 jam dan 24 jam perendaman dengan air hangat (suhu 50 o C). Sedangkan waktu germinasi yang diujikan adalah 24, 30, 36, dan 42 jam germinasi dalam wadah berlubang yang dilapisi daun pisang. Perlakuan yang menghasilkan rendemen terbanyak dan panjang kecambah yang terpanjang diambil sebagai waktu perendaman dan waktu germinasi untuk produksi kecambah kacang komak. b. Penelitian utama 1. Pembuatan kecambah dan tepung kecambah kacang komak Proses germinasi (perkecambahan) kacang komak dibuat dengan cara kacang komak yang telah disortasi, dicuci dengan air kemudian direndam dalam air hangat bersuhu 50 o C (kacang komak:air = 1:3) pada suhu ruang (35 o C) selama 12 jam. Setelah direndam, kacang komak ditiriskan dan ditempatkan dalam wadah (keranjang) berlubang yang dilapisi dengan daun pisang untuk menjaga kelembaban dan menghindari terjadinya genangan air dalam wadah. Kacang komak kemudian digerminasi selama 30 jam dalam wadah tersebut dan disemprot dengan air dua kali sehari untuk menjaga kelembaban. Kecambah kacang komak yang dihasilkan kemudian dikeringkan dengan oven pengering bersuhu 50 o C selama 24 jam. Kemudian kecambah kering digiling menggunakan pin disc mill menggunakan ayakan ukuran 60 mesh. Prosedur pembuatan tepung kecambah kacang komak dapat dilihat pada Gambar 6.

4 Kacang komak (Lablab purpureus (L.) Sweet) Disortasi Direndam dengan air hangat 50 o C (1:3) selama 12 jam Ditiriskan kemudian ditempatkan di keranjang berlubang yang dilapisi daun pisang Ditutup rapat kembali dengan daun pisang Dikecambahkan selama 30 jam, disemprot 2x sehari Kecambah kacang komak Dikeringkan di oven pengering suhu 50 o C selama 24 jam Digiling dengan pin disc mill ayakan 60 mesh Tepung Kecambah Kacang Komak Gambar 6. Prosedur pembuatan tepung kecambah kacang komak 2. Pembuatan konsentrat protein tepung kecambah kacang komak Konsentrat protein kecambah kacang komak dapat dibuat dengan cara tepung kecambah dilarutkan dalam air dengan perbandingan 1:6-8. Kemudian larutan tersebut diatur ph-nya hingga ph 9.0 menggunakan NaOH 1 N. Larutan dipanaskan sambil diaduk pada suhu o C selama 1 jam. Biarkan mengendap, kemudian filtrat yang telah terpisah dari endapan diambil. Selanjutnya filtrat diendapkan kembali pada suhu refrigerator selama 1 malam. Filtrat yang telah terpisah kemudian diambil kembali dan diendapkan pada ph isoelektrik yaitu ph 4.5

5 menggunakan HCl pekat kemudian disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm. Endapan yang terbentuk dikeringkan dengan oven vakum 45 o C selama 24 jam. Konsentrat kering lalu dihaluskan dengan blender kering dan disimpan di dalam refrigerator untuk analisis selanjutnya. Tepung Kecambah Kacang Komak Ditambah air (1:6-8) Ditambah NaOH 1 N hingga ph 9.0 Dipanaskan sambil diaduk pada suhu o C selama 1 jam Dibiarkan mengendap Diambil filtrat, diendapkan pada suhu refrigerator selama 1 malam Diambil filtrat, diendapkan pada ph isoelektrik (4.5) dengan HCl pekat Disentrifus kecepatan 4000 rpm, 25 menit, ambil endapan Dikeringkan dengan oven vakum suhu 45 o C selama 24 jam hingga kering Dihaluskan dengan blender kering Konsentrat Protein Kecambah Kacang Komak Gambar 7. Pembuatan konsentrat protein kecambah kacang komak

6 3. Pembuatan fraksi protein dan non protein tepung kecambah kacang komak Tepung Kecambah Kacang Komak Ditambah 1 liter akuades (1:10) bersuhu 60 o C Ekstraksi alkalik pada ph dengan NaOH 2N pada suhu 60 o C selama 30 menit Disentrifugasi 2000 rpm selama 15 menit Residu (fraksi nonprotein) Supernatan fraksi protein Ekstraksi asidik pada ph 4.5 dengan penambahan HCl 2N Disentrifus 2000 rpm selama15 menit Supernatan Residu Dikeringkan pada 50 o C selama 12 jam Penepungan lolos 60 mesh Fraksi Protein Gambar 8. Pembuatan fraksi protein dan nonprotein tepung kecambah kacang komak (Suwarno, 2003)

7 4. Analisis proksimat 4.1. Kadar air (Apriyantono, et al., 1989) Cawan kosong dikeringkan dalam oven 105 o C selama 15 menit, dinginkan dalam desikator 10 menit kemudian timbang (a gram). Timbang sampel sebanyak 5 gram di dalam cawan (x gram). Keringkan dalam oven 105 o C selama 6 jam atau hingga diperoleh berat tetap ( g). Setelah dingin, timbang kembali (y gram). Kadar air (% bb) = x - y 100 x - a Kadar air (% bk) = x y 100 y - a 4.2. Kadar abu (Apriyantono, et al., 1989) Cawan porselen kosong dikeringkan dalam oven 105 o C selama 15 menit, lalu dinginkan dalam desikator selama 5 menit, kemudian timbang (a gram). Sebanyak 5 gram sampel ditimbang dalam cawan kering. Keringkan dalam tanur hingga beratnya tetap. Kemudian dinginkan dalam desikator dan timbang (b gram). b - a Kadar abu (% bb) = 100 Berat sampel Kadar abu (% bk) = kadar abu (bb) (100-kadar air (bb)) Kadar protein (metode Kjeldahl) Sebanyak mg sampel dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, kemudian ditambahkan 1.9 ± 0.1 g K 2 SO 4, 40 ± 10 mg HgO, dan 2 ± 0.1 ml H 2 SO 4. Setelah itu sampel didihkan selama jam sampai cairan menjadi jernih. Sampel didinginkan dan ditambah sejumlah kecil air destilata.

8 Lalu isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi, labu dicuci dan dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml air destilata kemudian ditambahkan 8-10 ml larutan 60 % NaOH-5 % Na 2 S 2 O 3. Di bawah kondensor diletakkan erlemeyer berisi 5 ml larutan H 3 BO 3 dan 2-4 tetes indikator metilen red-metilen blue. Destilasi dilakukan hingga diperoleh sekitar 15 ml destilat. Setelah itu, destilat diencerkan sampai ± 50 ml. Kemudian dititrasi dengan HCl 0.02 N sampai warna sampel berubah menjadi abu-abu. Kandungan nitrogen yang diperoleh dikonversi menjadi kandungan protein menggunakan faktor konversi %N = (ml sampel-ml blanko) N HCl Berat sampel basis kering (mg) Kadar protein (% bb) = % N x 6.25 Kadar protein (% bk) = kadar protein (bb) 100 (100-kadar air (bb)) 4.4. Kadar lemak (Apriyantono, et al., 1989) Labu lemak dikeringkan dalam oven, dinginkan dalam desikator dan timbang (x gram). Sampel sebanyak 5 gram ditimbang dalam kertas saring kemudian letakkan dalam alat ekstraksi soxhlet. Alat kondenser dipasang di atasnya dan labu lemak di bawahnya. Pelarut heksana dituang ke labu lemak dan lakukan refluks selama minimal 5 jam. Setelah ekstraksi selesai, pelarut dikeluarkan dari labu lemak. Labu lemak hasil ekstraksi dikeringkan dalam oven 105 o C, kemudian dinginkan dan timbang (y gram). y - x Kadar lemak (% bb) = 100 Berat sampel

9 Kadar lemak (% bk) = kadar lemak (bb) 100 (100-kadar air (bb)) 4.5. Kadar karbohidrat (by difference) Kadar karbohidrat (% bb) = 100 % - (kadar air (%bb) + kadar abu (%bb) + kadar protein (%bb) + kadar lemak %bb)) Kadar karbohidrat (% bk) = 100 % - (kadar air (%bk) + kadar abu (%bk) + kadar protein (%bk) + kadar lemak %bk)) 5. Analisis sifat fisikokimia 5.1. Derajat warna dengan Chromameter CR-310 Minolta (modifikasi Hutching, 1999) Pengukuran dilakukan dengan meletakkan sampel di dalam wadah sampel berukuran seragam dan selanjutnya dilakukan pengukuran pada skala nilai L, a, dan b. Nilai L menyatakan parameter kecerahan (lightness) yang mempunyai nilai dari 0 (hitam) sampai 100 (putih). Nilai a menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai +a (positif) dari untuk warna merah dan nilai a (negatif) dari 0 (-80) untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b (positif) dari 0 70 untuk kuning dan nilai b (negatif) dari 0 (-70) untuk warna biru Derajat putih (Whiteness) Pengukuran dilakukan dengan menggunakan whiteness meter. Pastikan filter warna biru terpasang dan masukkan plat kalibrasi ke dalam cawan contoh, kemudian masukkan wadah contoh ke tempat pengukuran. Tombol ON dinyalakan, LED akan menampilkan nilai derajat putih dari plat kalibrasi. Untuk pengukuran contoh, tempatkan contoh ke dalam cawan contoh

10 kemudian tempatkan ke dalam wadah contoh. Masukkan wadah contoh ke tempat pengukuran. LED akan menampilkan nilai derajat putih dan nomor urut pengukuran. Nilai derajat putih BaSO 4 sebagai standar yaitu sebesar Nilai derajat putih contoh = Nilai derajat putih Nilai derajat putih BaSO 4 100% 5.3. Densitas kamba (Muchtadi dan Sugiyono, 1992) Gelas ukur 10 ml ditimbang, kemudian sampel dimasukan ke dalamnya sampai volumenya mencapai 10 ml. Pengisian diusahakan tepat tanda tera dan tidak dipadatkan. Gelas ukur berisi sampel ditimbang dan selisih berat sampel menyatakan berat sampel per-10 ml. Densitas kamba (Bulk Density) dinyatakan dalam g/ml atau g/cm 3. Densitas kamba (g/cm 3 a b ) = 10 Keterangan : a = berat gelas ukur berisi sampel 10 ml (g) b = berat gelas ukur kosong (g) 5.4. Aktivitas air (Aw) Pengukuran aktivitas air (Aw) dilakukan dengan menggunakan alat Aw meter Shibaura Aw meter WA-360. Alat dikalibrasi dengan NaCl jenuh yang memilki Aw ; dan yang berturut-turut pada suhu dan 29 o C dengan cara memasukan NaCl jenuh tersebut dalam wadah Aw dapat dibaca setelah ada tulisan completed di layar. Bila Aw yang terbaca tidak tepat maka bagian switch diputar sampai mencapai tepat Pengukuran Aw sampel dilakukan dengan cara yang sama dengan kalibrasi alat yaitu sampel dimasukkan dalam wadah Aw meter. Nilai Aw

11 dan suhu pengukuran akan terbaca setelah ada tulisan completed di layar Daya cerna protein in vitro (metode Hsu, et al., 1977 yang dimodifikasi di dalam Muchtadi, 1989) Sebanyak 1.5 gram konsentrat ditambahkan 30 ml akuades ph 8.0 yang telah ditepatkan dengan NaOH. Larutan divorteks kemudian sebanyak 10 ml suspensi dipipet secara homogen dan sisa campuran diukur ph nya. Larutan enzim protease (1,6 mg tripsin mg kimotripsin + 4 mg pankreatin per ml akuades ph 8.0) 1 ml ditambahkan sambil dicatat waktu penambahan. Larutan diinkubasi 37 o C selama 15 menit. Ambil 2 ml larutan secara homogen dan sisa campuran diukur ph nya sesegera mungkin lalu hitung selisih ph nya. Tambahkan 2 ml akuades dan 4 ml TCA 0.1 M. Larutan divorteks lalu disentrifus 3800 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil 1.5 ml kemudian ditambahkan 5 ml Na 2 CO M dan 1 ml pereaksi Folin. Larutan didiamkan selama 20 menit pada suhu 37 o C. Absorbansi dibaca pada λ 578 nm. Blanko yang digunakan adalah akuades dan kasein sebagai kontrol. A sampel DC relatif = 100 % A kontrol 6. Analisis sifat fungsional protein 6.1. Daya serap air (Lin et al., 1974 di dalam Widowati, dkk, 1998) Sebanyak 0.5 gram sampel ditambah 5 ml air destilata dalam tabung reaksi, diaduk dengan vorteks selama 2 menit. Campuran didiamkan 1 jam pada suhu kamar, disentrifus pada 3000 rpm selama 25 menit. Filtrat dibuang secara hati-hati dan sampel basah diletakkan terbalik dalam oven 45 0 C selama 30 menit lalu ditimbang. Perbedaan antara bobot basah dan bobot awal adalah air yang terserap untuk setiap gram sampel.

12 Daya serap air (%) = berat air terserap 100% berat protein 6.2. Daya serap minyak (Widowati, 1998) Sebanyak 0.5 gram konsentrat protein ditambah 3 ml minyak jagung. Campuran divorteks selama 2 menit. Lalu didiamkan pada suhu kamar dan disentrifus 3000 rpm selama 25 menit. Volume minyak bebas dapat dibaca. Daya serap minyak (%) = Volume minyak terserap 100% berat protein 6.3. Daya emulsi (Franzen dan Kinsella, 1976) Sampel sebanyak 2 gram ditambah 100 ml air, diatur ph 8. Sampel diaduk dengan magnetic stirrer selama 5 menit. Sebanyak 25 ml sampel ditambah 25 ml minyak jagung. Campuran didispersikan dengan blender selama 1 menit, kemudian disentrifus 3000 rpm selama 10 menit. Volume emulsi diukur. Aktivitas emulsi (%) = volume campuran teremulsi 100% volume total campuran 6.4. Kekuatan gel (Schmidt, 1981 di dalam Widowati, dkk, 1998) Konsentrat protein sebanyak 0.75, 1.00, 1.25, dan 1,50 gram dilarutkan dalam 10 ml akuades sehingga diperoleh konsentrasi larutan 7.5, 10, 12.5, dan 15 %. Larutan ditepatkan ph 8.0 menggunakan NaOH 2 N. Larutan tersebut dipipet sebanyak 3.0 ml ke dalam tabung reaksi. Tabung reaksi dimasukkan ke dalam penangas air bersuhu C selama 15 menit. Tabung dikeluarkan dan disimpan pada suhu 4 0 C selama 2 jam. Kekuatan gel diukur secara kualitatif.

13 Skala yang digunakan untuk pengukuran gel adalah 0 = tidak berbentuk gel 1 = gel sangat lemah, yaitu bila dimiringkan gel jatuh 2 = bila tabung dibalik vertikal gel tidak jatuh 3 = bila tabung dibalik vertikal dan dihentak sekali, gel tidak jatuh 4 = bila tabung dihentak berkali-kali, gel tidak jatuh 6.5. Penentuan kapasitas dan stabilitas busa (Widowati, 1998) Stabilitas buih merupakan perbandingan antara volume buih setelah satu jam dengan volume buih setelah 30 detik. Konsentrat sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 100 ml akuades dan diaduk dengan magnetic stirrer. Larutan diatur ph-nya menjadi 8.0 dengan NaOH 2 N. Volume awal dicatat. Kemudian diblender selama 2 menit. Volume buih setelah 30 detik dan setelah 1 jam diukur. Kapasitas busa (%) = volume busa setelah 30 detik 100% volume awal Stabilitas busa (%) = volume busa setelah 1 jam 100% volume busa setelah 30 detik 6.6. Protein Dispersibility Index (PDI) (AOCS, 1970) Sebanyak 4 g sampel dilarutkan dalam 60 ml akuades sambil diaduk dengan batang gelas. Bila sampel sudah larut, batang gelas dibilas dengan sisa akuades. Larutan tersebut kemudian ditepatkan phnya hingga 8.0 dengan larutan NaOH 2 N. Larutan diaduk dengan magnetic stirer pada skala 7 selama 5 menit. Sebanyak 50 ml larutan dipipet ke dalam tabung sentrifus dan disentrifus dengan kecepatan 2700 rpm selama 10 menit. Filtrat yang diperoleh dipipet sebanyak 2 ml untuk dianalisis dengan metode Kjeldahl.

14 PDI (%) = % protein terdispersi 100% %protein total 6.7. Nitrogen Solubility Index (NSI) Sebanyak 2 g sampel dilarutkan dalam 40 ml akuades sambil diaduk dengan batang gelas. Bila sampel sudah larut, batang gelas dibilas dengan sisa akuades. Larutan tersebut kemudian ditepatkan phnya hingga 8.0 dengan larutan NaOH 2 N. Larutan tersebut kemudian diaduk dengan magnetic stirer dengan skala 4 selama 45 menit. Seluruh larutan tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Filtrat yang diperoleh kemudian dipipet sebanyak 1 ml untuk dianalisis dengan metode Kjeldahl. NSI (%) = % nitrogen terlarut 100% %nitrogen total 6.8. Water Absorption Index (WAI) dan Water Solubility Index (WSI) (AOAC, 1980) Tiap sampel konsentrat (0.5 gram) dicampur dengan 5 ml akuades dalam tabung sentrifus. Larutan tersebut divorteks selama 1 menit kemudian didiamkan selama 15 menit. Larutan disentifugasi pada 2000 rpm selama 15 menit. Supernatan dituang ke dalam wadah lain. Sebanyak 2 ml supernatan dituangkan ke dalam cawan evaporasi kemudian dikeringkan di oven 105 o C selama 1 jam. Cawan yang telah didinginkan lalu ditimbang. Sedangkan residu yang tersisa dalam tabung dipanaskan di oven 50 o C selama 25 menit, lalu timbang setelah dingin. WAI dihitung dari berat gel yang terbentuk dan dinyatakan dalam gram solid/gram solid awal, sedangkan WSI dihitung dari berat solid kering yang terbentuk dari evaporasi supernatan pada suhu 105 o C selama 1 jam.

15 berat bahan terlarut dalam 2 ml WSI = 2 ml larutan WAI = berat bahan terserap Berat awal-berat bahan terlarut 7. Analisis kapasitas antioksidan 7.1. Uji DPPH (Kubo et al., 2002 di dalam Radianti, 2005) Buffer asetat 0.1 M 4 ml (ph 5.50), 7.5 ml metanol, dan 400 µl radikal bebas DPPH 3mM dalam metanol dimasukkan dalam tabung reaksi. Larutan kemudian divorteks. Sebanyak 100 µl larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung reaksi tersebut dan diinkubasi 25 o C selama 20 menit. Absorbansi larutan tersebut dibaca pada panjang gelombang 517 nm. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan asam askorbat 1000 ppm sehingga satuannya dinyatakan dalam AEAC (Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity). Kapasitas antioksidan (%) = (A kontrol negatif A sampel) 100% A kontrol negatif 7.2. Uji Aktivitas Kemampuan Mereduksi dengan Metode Baku (Oyaizu, 1986 di dalam Kardono dan Dewi, 1998) Ekstrak sampel ( μg) dalam 1 ml air suling dicampur dengan 2.5 ml buffer fosfat 0.2 M, ph 6.60 dan 2.5 ml kalium ferri sianida (K 3 Fe(CN) 6 ) 1%. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 50 o C selama 20 menit. Ke dalam campuran kemudian ditambahkan 2.5 ml larutan trikloroasetat (TCA) 10%. Larutan tersebut disentrifus dengan kecepatan 300 rpm selama 10 menit. Lapisan atas larutan hasil sentrifus diambil sebanyak 2.5 ml dan ditambahkan dengan 2.5 ml air suling dan 0.5 ml larutan FeCl 3 0.1%. Absorbansi larutan tersebut kemudian diukur pada panjang gelombang 700 nm.

16 Peningkatan absorbansi menunjukkan kekuatan mereduksi yang tinggi Total fenol dengan metode Chandler dan Dodds yang dimodifikasi (Shetty, et al., 1995 di dalam Radianty, 2005) Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih dan ditambahkan 1 ml etanol 95 % dan 5 ml akuades. Larutan kemudian divorteks. Tambahkan pada masing-masing sampel 5 ml reagen Folin Ciocalteu 50 % (v/v) lalu vorteks. Setelah 5 menit, 1 ml Na 2 CO 3 5 % (w/v) ditambahkan dan diencerkan kembali dengan air bebas ion (jika terlalu pekat). Setelah itu divorteks dan disimpan pada ruangan gelap selama 60 menit. Sampel divorteks dan absorbansinya diukur pada λ 725 nm. Sebagai standar digunakan asam galat. Pembuatan standar asam galat yaitu dengan cara membuat larutan induk 250 ppm. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan total fenol sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. 8. Analisis data Analisis data dilakukan dengan menggunakan program SPSS 13 dengan pengujian paired sample t-test kecuali untuk parameter kekuatan gel digunakan uji non parametric two-related samples pada selang kepercayaan 95%.