3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Bahan dan Alat

Transkripsi

1 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2009 hingga Januari 2010 bertempat di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Balai Penelitian Tanah. 3.2 Bahan dan Alat Sumber sedimen laut yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari perairan Teluk Jakarta (Lampiran 1) yang diambil pada bulan Juni. Tempat pengambilan sedimen laut dilakukan menggunakan Ekman grab yang telah diikat dengan tali tambang berskala, pada jarak 200 m dari garis pantai dan kedalaman ±4 m. Sedimen kemudian dikemas dengan kantong plastik dan diikat. Selain itu juga dilakukan pengambilan air laut pada lokasi yang sama (Holmes et al. 2004). Semua sampel sedimen dan air laut yang telah diambil disimpan pada cool box dengan suhu 5-10 C. Bahan-bahan yang digunakan untuk pretreatment terhadap elektroda adalah HCl 1 N, NaOH 1 N, dan akuades. Bahan-bahan yang digunakan untuk penyusunan SMFC adalah air laut yang diperoleh dari lokasi yang sama dengan pengambilan sampel sedimen dan air deionisasi. Bahan-bahan yang digunakan untuk karakterisasi sedimen laut dan substrat SMFC meliputi akuades, air bebas ion, air bebas ion yang bebas CO2, NaCl, KCl, HCl, larutan ekstraksi Olsen, karbon hitam, amonium asetat, kalium dikromat, larutan standar 5000 ppm C, etanol 96 %, pasir kuarsa bersih, filter pulp. Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi bakteri pada anoda adalah media Alkaline Peptone Water (APW) yang terdiri dari NaCl, KCl, NH4Cl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaHCO3, MgCl2.6H2O, FeCl2.2H2O, gas murni N2, NaOH 5 M, media TrypticaseTM Soy Agar (TSA), dan agar murni. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis secara biokimiawi ialah kristal ungu, garam fisiologis, alkohol 95%, spirtus, safranin, akuades, dan larutan iodium. Bahan yang dibutuhkan untuk uji katalase adalah hidrogen peroksida 3%. Bahan yang digunakan untuk identifikasi bakteri adalah isolat bakteri murni pada

2 12 agar miring, garam fisiologis, minyak mineral, reagen VP I, reagen VP II, reagen nitrate A, reagen nitrate B, reagen TDA, dan reagen Kovac s. Alat-alat yang digunakan untuk mengambil sedimen dan air laut ialah botol tempat sampel air laut, tali, Ekman grab, cool box, kertas label, kantong plastik, dan kamera. Alat-alat yang digunakan untuk membuat rangkaian SMFC ialah gelas piala 1000 ml, timbangan digital (ketelitian 0,0001), multitester (Masda DT830D), elektroda karbon, solder, resistor tetap 820±5% Ω, dan kabel. Alat-alat yang digunakan untuk karakterisasi sedimen laut dan substrat SMFC ialah neraca analitik, ph meter, gelas piala, Bausch & Lomb Spectronic 70 Electrophtometric 70, shaker, erlenmeyer, labu ukur, gelas ukur, labu semprot, konduktometer dengan sel platina, kertas saring, tabung perkolasi, flamefotometer, dan atomic absorption spectrofotometer (AAS). Alat-alat yang digunakan untuk mengisolasi bakteri ialah botol bersumbat karet, tabung reaksi bersumbat karet, cawan petri, sudip, jarum ose, syiringe, hot plate, kapas, platik wrapping, gelas ukur, gelas erlenmeyer, pipet volumetrik, bunsen, jar anaerobik dan autoklaf. Alat yang dibutuhkan untuk pewarnaan gram ialah kaca objek, jarum ose, bunsen, dan mikroskop (Olympus CX21FS1). Pengujian oksidase dilakukan dengan menggunakan Oxidase Test Strip. Alat untuk uji katalase ialah kaca objek. Alatalat yang digunakan untuk identifikasi bakteri ialah MicrogenTM GN-ID Identification, tabung reaksi, pipet mikro, vortex, bunsen, ruang inkubator, tabel warna untuk membaca hasil, dan Microbact Metode Penelitian Pelaksanaan penelitian ini dilakukan dalam tujuh tahapan, yaitu: (1) karakterisasi sedimen laut Teluk Jakarta, (2) pembuatan rangkaian SMFC yang mengacu pada penelitian Holmes et al. (2004), (3) pengukuran arus listrik dengan multitester, (4) karakterisasi substrat SMFC, (5) isolasi bakteri pada anoda SMFC, (6) karakterisasi bakteri pada anoda SMFC, dan (7) identifikasi bakteri pada anoda SMFC Karakterisasi Sedimen Laut Teluk Jakarta Karakterisasi sedimen laut dilakukan terhadap tekstur tanah, ph (H2O dan KCl), daya hantar listrik (DHL), jumlah karbon organik, jumlah nitrogen total,

3 13 fosfor tersedia, dan kapasitas tukar kation (KTK). Parameter yang diuji pada karakterisasi sedimen laut Teluk Jakarta ini mengacu pada penelitian Hong et al. (2009c) Pembuatan Rangkaian SMFC Elektroda yang digunakan untuk penyusunan SMFC adalah karbon berbentuk silinder dengan dimensi 39 x 7 mm yang diperoleh dari baterai. Penentuan jenis elektroda ini mengacu dari hasil penelitian Logan (2008), dimana karbon cocok untuk pertumbuhan bakteri, mudah dihubungkan dengan kabel dan harganya yang relatif murah. Sebelum digunakan, elektroda karbon dinetralkan (Holmes et al. 2004) dengan perlakuan: 1) elektroda direndam dengan 1N HCl selama 1 hari kemudian dibilas dengan akuades. 2) elektroda direndam dengan 1N NaOH selama 1 hari kemudian dibilas dengan akuades. 3) elektroda direndam dengan akuades hingga saat akan digunakan. Masing-masing elektroda yang telah diberi perlakuan, dililit dengan kabel yang telah dibuka isolatornya dan ditutup dengan karet. Penutupan kabel dan elektroda disempurnakan dengan menggunakan silicone rubber hingga kedap air. Pengujian hasil perangkaian elektroda dan kabel dilihat dari adanya resistansi menggunakan multitester. Kegiatan pembuatan rangkaian SMFC (Gambar 3) mengacu pada penelitian Holmes et al. (2004), dimana sedimen laut Teluk Jakarta dimasukkan ke dalam gelas piala hingga ketinggian 3 cm, kemudian sebuah elektroda yang terbuat dari karbon berbentuk silinder dengan dimensi 39 x 7 mm (anoda) ditutup dengan sedimen laut setinggi 2 cm. Selanjutnya air laut sebanyak 400 ml dimasukkan ke dalam gelas ukur dan didiamkan selama 24 jam untuk membuat kondisi yang mengendapkan partikel-partikel sedimen laut. Pada hari berikutnya, sebuah elektroda yang juga terbuat dari karbon berbentuk silinder dengan dimensi 39 x 7 mm (katoda) ditempatkan 1 cm di atas permukaan sedimen laut. Kabel dari anoda dan katoda dihubungkan dengan resistor (820 Ω ± 5 %) membentuk rangkaian tertutup. SMFC dioperasikan pada kondisi gelap (tanpa pencahayaan)

4 14 dan suhu ruang (± 27 C). Air yang hilang karena penguapan selama masa pengukuran arus listrik diganti dengan akuades demineralisasi. 820±5% Ω Kanoda 1 cm 2 cm Anoda 3 cm Gambar 3 Susunan SMFC Pengukuran Arus Listrik dengan Multitester Pengukuran arus listrik dilakukan menggunakan multitester dan hasilnya dikonversi menjadi current density dengan lama pengukuran 40 hari. Penentuan lamanya pengukuran arus listrik didasarkan pada pola kecenderungan perubahan arus listrik oleh kandungan organik pada sedimen dan mikroorganisme, dimana dalam pengukuran diperoleh puncak produksi arus listrik dan penurunan arus listrik hingga hari akhir pengukuran (Holmes et al. 2004). Konversi current density diperhitungkan dengan membagi jumlah arus yang dihasilkan dengan luas permukaan anoda Karakterisasi Substrat SMFC Analisis karakteristik substrat SMFC yang dilakukan bertujuan untuk melihat perubahan kandungan bahan organik pada sedimen laut yang digunakan akibat proses dalam SMFC. Jenis analisis yang digunakan sama dengan analisis karakterisasi sedimen laut yang berasal dari Teluk Jakarta yang meliputi analisis kandungan karbon organik, nitrogen, dan fosfat, pengukuran ph, daya hantar listrik (DHL), serta kapasitas tukar kation (KTK). Analisis parameter ini mengacu pada penelitian Hong et al. (2009c).

5 Pengisolasian Bakteri pada Anoda SMFC Tahapan isolasi bakteri terdiri dari beberapa langkah, yaitu persiapan media cair, persiapan media padat, inokulasi bakteri, dan isolasi bakteri Persiapan Media Media kultur pengkayaan (enrichment) yang digunakan adalah media APW yang telah dimodifikasi (Holmes et al. 2004). Tiap liter media APW modifikasi mengandung 20 g NaCl; 0,77 g KCl; 0,25 g NH4Cl; 0,1 g KH2PO4; 0,2 g MgSO4.7H2O, dan 2,0 g NaHCO3. Sebelum NaHCO3 ditambahkan, ph diatur menjadi 7 dengan 5 N NaOH. Media kultur kemudian dituang pada tabung bersumbat karet dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C. Media kemudian ditambahkan dengan 1 mm FeCl2 (dari 0,1 M FeCl2) steril. Selanjutnya media cair dialiri dengan perbandingan gas N2 (99,999 %) selama 15 menit untuk menghilangkan oksigen yang terlarut Persiapan Media Padat Media isolasi bakteri menggunakan media APW modifikasi (Holmes et al. 2004) yang ditambahkan agar murni (2%, b/v). Media kemudian dididihkan dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C. Media kemudian ditambahkan dengan 1 mm FeCl2 (dari 0,1 M FeCl2) steril Inokulasi Bakteri Inokulasi bakteri pada SMFC dilakukan dengan cara memasukkan elektroda pada media cair. Media yang telah diinokulasikan kemudian segera dialiri gas N2 selama 30 menit. Setelah itu dilakukan inkubasi bakteri selama 3 hari pada suhu ruang dalam kondisi gelap. Bakteri yang telah tumbuh pada media cair selanjutnya diencerkan pada media yang sama dengan menggunakan syringe steril secara aseptik. Bakteri tunggal diperoleh dengan cara menumbuhkan bakteri pada media padat dengan menggunakan metode cawan tuang. Masing-masing pengenceran bakteri diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan syringe steril secara aseptik. Kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri steril. Setiap pengenceran dipindahkan ke dalam 2 cawan petri steril (duplo). Selanjutnya ditambahkan 15 ml media agar APW yang telah dicairkan. Cawan petri digoyangkan secara

6 16 perlahan membentuk angka delapan supaya bakteri dan media menyebar merata. Setelah agar membeku sempurna, cawan petri disimpan dengan posisi terbalik pada anaerob jar. Kondisi anaerob dicapai dengan cara memasukkan Gas Pak ke dalam anaerob jar. Media diinkubasi pada suhu ruang pada kondisi gelap selama 48 jam Isolasi Bakteri Bakteri diisolasi dengan menggunakan metode kuadran atau streak plate (Gambar 4). Bakteri yang terpilih diambil secara aseptik dengan mengunakan jarum ose dan digoreskan pada media agar APW steril. Setiap koloni murni pada cawan ditumbuhkan (disegarkan) pada media agar-agar APW miring pada tabung reaksi dengan metode gores. Hal ini bertujuan untuk menghindarkan isolat dari kontaminasi bakteri yang masih terdapat pada media cawan petri dan juga menyegarkan bakteri agar selalu mendapatkan nutrisi yang cukup sehingga tidak cepat mati. Setiap akan memindahkan bakteri sebaiknya dilakukan pengujian pewarnaan Gram bakteri untuk mendapatkan informasi yang sama seperti sebelumnya, apabila data yang didapatkan berubah maka bakteri yang diisolasi terdahulu mungkin saja telah terkontaminasi. Kolonikoloni terpisah yang telah murni ditumbuhkan ke dalam agar miring sebagai stok dan disimpan dalam referigator (suhu 0-(-4) C). Gambar 4 Isolasi dengan metode cawan gores (Benson 2001) Setiap isolat murni yang didapat, dipindahkan pada agar miring yang dipergunakan sebagai stok bakteri dan disegarkan setiap 1 minggu sekali untuk mensuplai kebutuhan nutrien dalam media dan diharapkan berfungsi untuk mengurangi terjadinya kontaminasi.

7 Karakterisasi Bakteri pada Anoda SMFC Karakterisasi terhadap isolat bakteri bertujuan untuk mengetahui sifat morfologi dan fisiologinya. Sifat morfologi yang diamati meliputi morfologi koloni dan morfologi sel. Morfologi koloni terdiri atas bentuk atas, bentuk pinggir, bentuk penonjolan, dan warna koloni. Morfologi sel terdiri atas bentuk sel, pewarnaan Gram, endospora, dan motilitas. Pengamatan fisiologis meliputi katalase dan oksidase. Media yang digunakan pada karakterisasi bakteri ialah media APW yang ditambahkan dengan TSA sebanyak 4 g/liter Identifikasi Bakteri pada Anoda SMFC Identifikasi bakteri ialah membandingkan bakteri yang telah teridentifikasi dengan bakteri yang belum diketahui. Identifikasi sendiri merupakan proses pencarian kekerabatan suatu organisme agar mempermudah dalam proses pemberian tata nama (Manclark & Pickett 1961 dalam Cowan & Steel s 1993). Buku manual yang digunakan ialah Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 9th Ed. (Holt et al. 1994). Penggunaan buku manual tersebut dapat menelaah sistem identifikasi hingga tingkat genus. Identifikasi bakteri hingga tingkat spesies memerlukan uji lanjutan. Salah satu metode identifikasi lanjutan ialah MicrogenTM GN-ID Identification. MicrogenTM GN-ID Identification adalah alat pengidentifikasian yang dapat digunakan untuk mengetahui reaksi biokimia bakteri. Alat ini cukup praktis digunakan dan dapat meminimalkan waktu identifikasi. Alat ini juga sangat mudah digunakan dan terdiri well (sumur tempat mengkultur isolat) dan reagen (cairan kimia) yang mewakili uji pada identifikasi yang telah tersedia. Hasil identifikasi selanjutnya diolah dengan menggunakan Software Microbact Prosedur Pengujian Pengujian yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pengujian karakteristik sedimen laut Teluk Jakarta, karakteristik substrat SMFC, karakterisasi bakteri pada anoda, dan identifikasi bakteri. Pengujian karakteristik sedimen laut Teluk Jakarta dan karakteristik substrat SMFC meliputi penentuan tekstur tanah dengan metode pipet, pengukuran ph, penentuan daya hantar listrik,

8 18 penetapan C-organik metode Walkey & Black, penetapan jumlah N total metode Kjeldhal, penetapan P-tersedia metode Olsen, dan penetapan kapasitas tukar kation. Karakterisasi bakteri yang dilakukan ialah pewarnaan Gram, uji oksidase, uji katalase dan uji motilitas. Identifikasi bakteri dilakukan menggunakan MicrogenTM GN-ID Identification Penentuan Tekstur Tanah dengan Metode Pipet (Sudjadi et al. 1971) Contoh tanah ukuran <2 mm ditimbang sebanyak 10 g dan dimasukkan ke dalam piala gelas 800 ml, kemudian ditambah 50 ml H2O2 10% dan dibiarkan semalam. Keesokan harinya campuran tersebut ditambah 25 ml H2O2 30% dan dipanaskan sampai tidak berbusa. Selanjutnya ditambahkan 180 ml air bebas ion dan 20 ml HCl 2 N kemudian dididihkan di atas pemanas listrik selama lebih kurang 10 menit. Setelah diangkat dan agak dingin, campuran tersebut diencerkan dengan air bebas ion menjadi 700 ml dan dicuci dengan air bebas ion menggunakan penyaring Berkefield sampai bebas asam. Kemudian ditambah 10 ml larutan peptisator Na4P2O7 4 %. Pemisahan pasir dilakukan dengan pengayakan suspensi tanah yang telah diberi peptisator dengan ayakan 50 mikron sambil dicuci dengan air bebas ion. Filtrat ditampung dalam silinder 500 ml untuk pemisahan debu dan liat. Butiran yang tertahan ayakan dipindahkan ke dalam pinggan aluminium yang telah diketahui bobotnya dengan air bebas ion menggunakan botol semprot. Selanjutnya dilakukan pengeringan (hingga bebas air) dalam oven pada suhu 105 C, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang (berat pasir = A g). Pemisahan debu dan liat dilakukan dengan pengenceran filtrat dalam silinder menjadi 500 ml dan diaduk selama 1 menit. Setelah itu, filtrat segera dipipet sebanyak 20 ml ke dalam pinggan aluminium. Kemudian filtrat dikeringkan pada suhu 105 C selama semalam, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang (berat debu + liat + peptisator = B g). Pemisahan liat dilakukan dengan pengadukan lagi selama 1 menit lalu dibiarkan selama 3 jam 30 menit pada suhu kamar. Suspensi liat dipipet sebanyak 20 ml pada kedalaman 5,2 cm dari permukaan cairan dan dimasukkan ke dalam pinggan aluminium. Suspensi liat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang (berat liat + peptisator = C g). Penentuan jumlah pasir, debu, dan liat dilakukan berdasarkan perhitungan berikut:

9 19 fraksi pasir = A g fraksi debu = 25 (B - C) g fraksi liat = 25 (C - 0,0095) g Jumlah fraksi = A + 25 (B - 0,0095) g Pasir (%) = A / {A + 25 (B - 0,0095)} x 100 Debu (%) = {25(B - C)} / {A + 25 (B - 0,0095)} x 100 Liat (%) = {25 (C - 0,0095)} / {A + 25 (B - 0,0095)} x 100 Keterangan: A: berat pasir B: berat debu + liat + peptisator C: berat liat + peptisator Pengukuran ph (Rayment & Hingginson 1992) Pengukuran ph tanah dalam KCl dilakukan dengan penimbangan 20 g tanah yang dimasukkan pada gelas piala. Kemudian ditambahkan 20 ml 1 N KCl dan didiamkan selama 30 menit sambil diaduk beberapa kali. Penentuan ph dengan menggunakan ph meter. Pengukuran ph tanah dalam H2O dilakukan dengan penimbangan 20 g tanah kering yang dimasukkan pada gelas piala.berukuran 50 ml. Kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan didiamkan selama 30 menit sambil diaduk beberapa kali. Pengukuran ph tanah dengan menggunakan ph meter Pengukuran Daya Hantar Listrik (Rayment & Hingginson 1992) contoh tanah ditimbangan sebanyak 10 g ke dalam botol kocok dan tambahkan 50 ml air bebas ion. Kemudian botol dikocok dengan mesin pengocok selama 30 menit. pengukuran DHL suspensi tanah dilakukan dengan konduktometer yang telah dikalibrasi menggunakan larutan baku NaCl dan dibaca setelah angka mantap (konstan). Nilai DHL dilaporkan dalam satuan ds m Penetapan C-organik metode Walkey & Black (Rayment & Hingginson 1992) Tanah ukuran <0,5 mm ditimbangan sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Kemudian ditambahkan 5 ml K2Cr2O7 1 N dan dikocok. Selanjutnya ditambahkan 7,5 ml H2SO4 pekat dan dikocok lalu didiamkan selama 30 menit. Larutan tersebut kemudian diencerkan dengan air bebas ion lalu dibiarkan dingin dan diimpitkan. Keesokan harinya dilakukan pengukuran

10 20 absorbansi larutan jernih dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 561 nm. Sebagai pembanding dibuat standar 0 dan 250 ppm, dengan memipet 0 dan 5 ml larutan standar ppm ke dalam labu ukur 100 ml dengan perlakuan yang sama dengan pengerjaan sampel. Penetapan C-organik dilakukan berdasarkan perhitungan dibawah ini. C-organik (%) = ppm kurva x ml ekstrak ml-1 x 100 mg contoh-1 x fk = ppm kurva x x x fk = ppm kurva x x fk Keterangan ppm kurva : kadar contoh yang didapat dari kurva hubungan antara kadar deret standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi blanko. 100 : konversi ke % Fk : faktor koreksi kadar air = 100/(100 % kadar air) Penetapan N metode Kjeldhal (Burt 2004) Tanah ditimbangan sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldhal 25 ml. Selanjutnya ditambahkan 1,9 g campuran Se, CuSO4, dan NaSO4. Kemudian ditambahkan 5 ml H2SO4 pekat ke dalam labu dan digoyangkan perlahan agar semua tanah terbasahi oleh H2SO4. Campuran tersebut lalu ditetesi dengan parafin cair sebanyak 5 tetes. Labu Kjeldhal dipanaskan dengan api kecil kemudian secara bertahap api dibesarkan hingga diperoleh cairan yang bewarna terang (hijau-biru). Labu Kjeldhal tetap dipanaskan hingga 15 menit kemudian didinginkan. Selanjutnya ditambahkan air sebanyak 50 ml dan dihomogenkan dengan cara digoyangkan. Setelah itu, ditambahkan 5 ml NaOH 50 %. Proses destilasi dimulai dan hasil destilat ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml H3BO4 4% dan 5 tetes indikator Conway. Destilasi dilakukan sampai isi destilasi mencapai 1000 ml. Hasil destilasi dititrasi dengan HCl yang telah dibakukan sampai terjadi perubahan warna, dari hijau ke merah. Lakukan juga penetapan blanko. Penetapan N ditentukan berdasarkan perhitungan di bawah ini. Kadar N (%) = isi HCl (contoh-blanko) x N HCl x 14 x 100 BKM

11 Penetapan P-tersedia metode Olsen (Watanabe & Olsen 1965) Tanah ukuran <0,2 mm ditimbangan sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam botol kocok. Kemudian ditambahkan 20 ml pengekstrak Olsen dan dikocok selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan kertas saring. Apabila larutan keruh maka dilakukan penyaringan kembali. Ekstrak yang didapat, dipipet sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya bersama deret standar ditambahkan 10 ml pereaksi pewarna fosfat dan dikocok hingga homogen. Larutan tersebut dibiarkan selama 30 menit. Absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 693 nm. Penetapan P-tersedia ditentukan berdasarkan perhitungan di bawah ini: Kadar P2O5 tersedia (ppm) = ppm kurva x ml ekstrak/1.000 ml x g/g contoh x fp x 142/90 x fk = ppm kurva x 20/1.000 x 1.000/1 x 142/90 x fk = ppm kurva x 20 x 142/90 x fk Keterangan: ppm kurva fp 142/190 fk : kadar contoh yang didapat dari kurva hubungan antara kadar deret standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi blanko. : faktor pengenceran (bila ada) : faktor konversi bentuk PO4 menjadi P2O5 : faktor koreksi kadar air = 100/(100 % kadar air) Penetapan Kapasitas Tukar Kation (Burt 2004) Tanah kering yang telah diayak ditimbangan sebanyak 2,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 15 ml. Kemudian ditambahkan 1 ml larutan NH4OAc ph 7. Campuran dikocok sampai merata dan dibiarkan selama semalam. Selanjutnya campuran dikocok kembali lalu disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Ekstrak NH4OAc didekantasi, disaring dengan saringan, dan filtrat ditampung dalam labu takar 100 ml. Penambahan NH4OAc diulangi sampai 3 kali. Setiap kali penambahan diaduk merata, disentifuse dan ekstraksinya didekantasi ke dalam labu ukur 100 ml. Setelah itu filtrat ditambahkan larutan NH4OAc sampai tanda tera. Ekstrasi ini digunakan dalam penetapan kadar K, Na, Ca, dan Mg yang dapat dipertukarkan serta untuk penetapan kejenuhan basa. Pencucian kelebihan NH4+ dilakukan dengan penambahkan 10 ml alkohol 80 % ke dalam tabung sentrifuse yang berisi residu tanah tersebut. Campuran tersebut diaduk sampai merata, disentrifuse, dekantasi,

12 22 dan filtratnya dibuang. Pencucian kelebihan NH4 dengan alkohol ini dilakukan sampai tanah dalam tabung sentrifuse bebas NH4. Hal ini dapat diketahui dengan menambahkan beberapa tetes pereaksi Nessier pada filtrat tersebut. Apabila terdapat endapan kuning berarti masih terdapat ion NH4+. Setelah bebas dari NH4+, tanah dipindahkan secara kuantitatif dari tabung sentifuse ke dalam labu didih. Kemudian air ditambahkan sebanyak 450 ml ke dalam labu didih. Labu didih ditambahkan beberapa butir batu didih, 5-6 tetes paraffin cair, dan 20 ml NaOH 50 %, kemudian didestilasi. Destilat ditampung dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi 25 ml H2SO4 0,4 N dan 5-6 tetes indikator Conway. Destilasi dihentikan jika destilat yang ditampung mencapai 150 ml. Kelebihan asam dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Titik akhir titrasi dicapai bila warna berubah menjadi hijau. Destilasi tanpa tanah digunakan sebagai blanko. Penetapan nilai KTK dihitung berdasarkan rumus. KTK (ml blanko-ml contoh)x N NaOH me = X100 bobot contoh tanah 105 C 100g Pewarnaan Gram (Harley & Prescott 2002) Pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui morfologi sel bakteri dan untuk mengetahui kelompok bakteri berdasarkan Gram positif atau Gram negatif. Kaca objek yang telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol diolesi inokulum secukupnya kemudian difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek diletakkan pada rak dan digenangi dengan larutan kristal violet dan didiamkan selama satu menit. Larutan kristal violet dibuang dengan memiringkan kaca objek dan dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan tisu. Selanjutnya kaca objek digenangi dengan larutan iodin selama dua menit dan dibilas dengan alkohol 95 %. Tahap akhir kaca objek digenangi dengan larutan safranin selama 30 detik dan dibilas dengan akuades serta dikeringkan dengan kertas tisu. Saat pemeriksaan dengan mikroskop, ditetesi dengan minyak imersi. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan perbesaran 100 kali pada lensa objek dan perbesaran 10 kali pada lensa okuler Pewarnaan Endospora (Harley & Prescott 2002) Kaca objek yang telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol diolesi inokulum secukupnya kemudian difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek

13 23 diletakkan pada rak dan digenangi dengan larutan malacite green dan dipanaskan selama lima menit. Kaca objek ditambahkan larutan malacite green jika larutan tersebut menguap. Selanjutnya kaca objek didinginkan dengan mengalirkan akuades selama 30 detik. Tahap akhir kaca objek digenangi dengan larutan safranin selama 90 detik dan dibilas dengan akuades serta dikeringkan dengan kertas tisu. Saat pemeriksaan dengan mikroskop, ditetesi dengan minyak imersi. Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan perbesaran 100 kali pada lensa objek dan perbesaran 10 kali pada lensa okuler Uji Oksidase (Harley & Prescott 2002) Sebanyak 1 ose koloni bakteri diambil dari media padat kemudian digoreskan pada kertas Oxidase Test Strip. Perubahan warna yang terjadi pada tes strip tadi diamati setelah didiamkan selama detik. Apabila terjadi perubahan warna manjadi biru violet maka uji oksidase dinyatakan positif dan menandakan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri non-enterik. Sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna maka uji oksidase dinyatakan negatif dan menandakan bakteri tersebut adalah bakteri enterik Uji Katalase (Harley & Prescott 2002) Koloni bakteri dari media padat diambil sebanyak 1 ose, kemudian digoreskan di atas kaca objek yang kering. Hidrogen peroksida 3% diteteskan sebanyak 2-3 tetes pada usapan bakteri tadi. Apabila terbentuk gelembung udara maka uji katalase dinyatakan positif. Baktei aerob memberikan reaksi yang positif terhadap uji katalase sedangkan anaerob tidak menunjukkan reaksi yang positif Uji Motilitas (Harley & Prescott 2002) Uji motilitas dilakukan dengan membuat preparat basah dan mengamati gerak bakteri di bawah mikroskop. Kaca objek yang telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol ditambahkan biakan bakteri murni dari media cair. Kemudian preparat ditutup dengan kaca penutup. Motilitas bakteri diamati menggunakan miroskop dengan perbesaran 10 x Uji MicrogenTM GN-ID Identification Uji bakteri dengan MicrogenTM GN-ID Identification memiliki tahapan dalam menguji sebagai berikut:

14 24 1) Bakteri yang akan di uji pada Microgen TM GN-ID Identification sebaiknya disegarkan terlebih dahulu selama jam dalam keadaan steril dan murni koloninya. 2) Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis (0,85 %) sebanyak 6 ml dan dihomogenisasi. Jumlah bakteri harus dalam keadaan cukup banyak untuk diidentifikasi (> 2 x 10 9 ). 3) Penutup Microgen TM GN-ID Identification dibuka secara hati-hati. Kemudian suspensi bakteri dipipet dengan pipet mikro steril sebanyak ± 200 µl dan dimasukkan ke setiap sumur Microgen TM GN-ID Identification. Sumur-sumur tersebut terdiri dari 24 lubang atau 24 tes. 4) Setelah inokulasi ditambahkan minyak mineral sebanyak 3-4 tetes pada sumur lysine, ornithine, H 2 S, arabinose, dan arginine. Jika isolat bersifat oksidase positif maka tidak ditambahkan minyak mineral pada sumur arabinose. 5) Microgen TM GN-ID Identification ditutup kembali kemudian dilakukan inkubasi pada suhu C. 6) Hasil dibaca setelah jam untuk Enterobacteriaceae dan setelah 48 jam untuk isolat yang bersifat oksidase positif. 7) Setelah inkubasi dapat dilihat perubahan warna pada setiap sumur. Reagen VP1 dan VP2 diteteskan pada sumur VP kemudian hasil dibaca setelah menit. Reagen Kovac s ditambahkan sebanyak 2 tetes pada sumur indole dan dibaca setelah 2 menit. Reagen TDA ditambahkan sebanyak 1 tetes pada sumur TDA dan hasil dibaca segera. Setelah pembacaan reaksi ONPG (sumur ke-7) telah dilakukan, pembacaan reduksi nitrat dilakukan pada sumur yang sama dengan menambahakan reagen Nitrate A dan Nitrate B. 8) Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil dan dimasukkan pada software Microbact Kemungkinan spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil.