SAAT PARASIT MEMBASMI PARASIT: UJI EFEKTIVITAS EKSTRAK BENALU SEBAGAI TERAPI MALARIA BARU

Transkripsi

1 SAAT PARASIT MEMBASMI PARASIT: UJI EFEKTIVITAS EKSTRAK BENALU SEBAGAI TERAPI MALARIA BARU Danang Setia Budi 1), Anak Agung Ngurah Nata Baskara 2), Pramana Pananja Putra 3), Zulfa Faiqoh 4), Eti Nurwening Solikhah 5) 1 Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada danangsetiabudi@gmail.com 2 Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada natabaskara_aangurah@yahoo.com 3 Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada njputra@yahoo.com 4 Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada zulfaiqoh@gmail.com 5 Bagian Farmakologi dan Terapi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada etinurwening@yahoo.com Abstract Nowadays, the antimalarial drug used showed resistances. Scientists look for new drugs by research especially using herbal plans. The mistletoe(dendrophthoe pentandra) is previously known having antimalarial activity. This study was conducted to determine in vitro antiplasmodial activity, mechanism of heme polymerase inhibition, and cytotoxicity of water and ethanol extracts of Dendrophthoe pentandra against Vero cells.the results showed that water and ethanol extract of Dendrophthoe pentandra has in vitro antiplasmodial activity, inhibition of polymerase heme, and cytotoxic effect on Vero cells with IC 50 values.it can be concluded that Dendrophthoe pentandra has potency as an antiplasmodial. Keywords :Dendrophthoe pentandra, antiplasmodium, heme polymerase, cytotoxic, Vero cell 1. PENDAHULUAN Malaria merupakan penyakit yang sampai saat ini masih menjadi masalah kesehatan dunia. Selama 100 tahun, dunia belum dapat memberikan kontribusi yang jelas terhadap pengobatan penyakit ini (Riley, 2000). European Commision (2002) mengatakan bahwa penyakit tersebut tidak hanya menyerang daerah tropis tetapi juga menyerang daerah subtropis di seluruh dunia. Hal tersebut didukung pernyataan Phair dan Sommers (1994) yang mengatakan bahwa kematian banyak terjadi pada negara-negara yang menjadi daerah endemik malaria, termasuk Indonesia, India, Meksiko, Haiti, Amerika Tengah, dan negara-negara Afrika. Data WHO menunjukkan bahwa setiap tahun sekitar 300 juta orang di dunia mempunyai resiko yang sama untuk terjangkit penyakit malaria, dengan tingkat kematian dapat mencapai angka 1-1,5 juta orang (Yuliandini, 2000). Sedangkan, Lawrence (2000) menyatakan sebanyak 3 juta orang diketahui meninggal dunia tiap tahun selama satu dekade ini disebabkan oleh malaria. Kematian akibat malaria banyak disebabkan oleh lingkungan yang sesuai untuk penyebaran parasit dan sudah resistennya Plasmodium falciparum terhadap

2 obat antimalaria yang sering digunakan, seperti klorokuin (CQ) (Najera, 1996). Laporan pertama tentang resistensi P. falciparum terhadap klorokuin ialah pada awal tahun 1960 di Amerika Selatan dan Asia Tenggara. Menurut D Alessandro dan Buttiens (2001) kejadian tersebut terulang kembali di Afrika pada akhir tahun Sedangkan, kasus resistensi P. falciparum terhadap CQ di Indonesia seperti yang dilaporkan Arbani (1991) sudah menyebar sampai 27 provinsi di Indonesia. Kayser et al., (2000) mengatakan banyak senyawa alam dari tumbuhan dapat dijadikan antimalaria alternatif pengganti obat malaria yang resisten. Menurut Dzulkarnain (1998) tanaman obat di Indonesia dapat dijadikan sebagai antimalaria, yang bersifat antiplasmodium dan meningkatkan daya tahan tubuh. Adanya pemberian tanaman obat tersebut terbukti dapat memperpanjang umur mencit terserang malaria dan mencegah kerusakan hati (hepatoprotektif) & limpa. Benalu (Dendrophthoe pentandra) adalah tumbuhan parasitik yang memiliki potensi sebagai tanaman obat (herba medicina). Bagian dari tumbuhan benalu yang berkhasiat sebagai herba medicina adalah bagian daun benalu (Djoko, 1997) seperti benalu teh dan benalu mangga. Penggunaan ekstrak benalu sebagai antimalaria akan membantu mengurangi kejadian resistensi obat antimalarial yang semakin banyak di seluruh dunia. Namun, data mengenai efektifitas benalu yang ditunjukkan dengan aktivitas dan mekanisme antiplasmodium, serta efek sitotoksiknya kepada tubuh sebagai antimalaria masih sangat kurang. Oleh karena itu, dibutuhkan penelitian mengenai aktivitas antiplasmodium terhadap P. falciparum, penghambatan polimerase heme, dan efek sitotoksik terhadap Sel Vero secara in vitro. Kandungan flavonoid pada tanaman Dendrophthoe pentandra diduga memiliki aktivitas antiplasmodium, namun publikasi ilmiah yang menunjukkan penelitian untuk membuktikan aktivitas antiplasmodium ini belum pernah dilakukan. Karena itu pokok permasalahan yang dirumuskan dalam penelitian ini adalah untuk menjawab pertanyaan tentang apakah ekstrak Dendrophthoe pentandra memiliki aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum FCR-3, apakah ekstrak Dendrophthoe pentandra memiliki aktivitas penghambatan polimerase heme, serta apakah ekstrak Dendrophthoe pentandra memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel Vero. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui: 1) aktivitas antiplasmodium ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra pada P. falciparum FCR-3, 2) mekanisme aktivitas antiplasmodium ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra melalui penghambatan polimerase heme, 3) efek sitotoksik ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra terhadap sel Vero. Dari penelitian ini akan dihasilkan luaran berupa informasi tentang seberapa besar aktivitas antiplasmodium ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra terhadap P. falciparum FCR-3, informasi mengenai mekanisme aktivitas antiplasmodium ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra melalui penghambatan polimerase heme, dan informasi tentang tingkat toksisitas ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra terhadap sel Vero. Informasi ilmiah yang diperoleh berguna untuk mengkaji lebih lanjut pemanfaatan Dendrophthoe pentandra sebagai terapi baru antimalaria. Di sisi lain, hasil penelitian ini juga dapat menjadi bahan pertimbangan bagi masyarakat untuk menggunakan Dendrophthoe pentandra sebagai salah satu alternatif terapi pengobatan malaria. 2. METODE a. Desain Penelitian Desain penelitian ini adalah eksperimental kuasi dengan rancangan percobaan posttest only with non equivalent control group design. b. Rancangan Penelitian

3 Uji aktivitas antiplasmodium + Menghambat polimerase heme + Ekstrak Dendrophthoe pentandra P. falciparum mati P. falciparum FCR-3 - Menghambat polimerase heme - Ekstrak Dendrophthoe pentandra P. falciparum tidak mati Gambar 1.Rancangan Uji Antiplasmodium dan Penghambatan Polimerase Heme. Gambar 2. Rancangan Uji Sitotoksik Sel Vero. c. Ruang Lingkup Penelitian ini menggunakan biakan P. falciparum strain FCR-3 dan sel Vero yang didapat dari Laboratorium Farmakologi dan Laboratorium Parasitologi FK UGM. d. Bahan Penelitian 1) Bahan uji Bahan uji dalam penelitian ini adalah ekstrak Dendrophthoe pentandradalam pelarut etanol dan air yang diekstraksi secara maserasi bertingkat. 2) P. falciparum dan sel Vero Penelitian ini menggunakan biakan P. falciparum strain FCR-3 dan sel Vero yang didapat dari Laboratorium Farmakologi dan Laboratorium Parasitologi FK UGM. 3) Medium kultur P. falciparum Medium kultur P. falciparum terdiri dari darah manusia golongan O, MCM (malaria culture medium) yang terdiri dari RPMI 1640, larutan HEPES, gentamisin, NaHCO 3, dan aquades steril 4) Bahan uji aktivitas P. falciparum Bahan uji aktivitas P. falciparum terdiri dari DMSO (Dimethyl sulfoxide), Giemsa, aquades, NaCl, asam hidroklorid, sorbitol, dekstrosa, & metanol. 5) Bahan uji penghambatan polimerase heme Bahan uji ini terdiri dari Hematin, NaOH 0,1M, NaOH 0,2M, asam asetat glasial 100%, DMSO (Dimethyl sulfoxide), dan akuades. 6) Bahan uji sitotoksik Bahan uji sitotoksik terdiri dari FBS (Foetal Bovine Serum), fungizone, Penicillin, Streptomisin, M 199, akuades, Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT), SDS (Sodium Duodecyl Sulphate), dan HCl 0,01M e. Instrumen Penelitian Dalam pelaksanaan penelitian ini untuk pembuatan ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra digunakan Bekerglas, Neraca analitik (Sartorius), Blender penyerbuk, Penyaring, Rotatory evaporator. Instrumen untuk kultur sel adalah Microplate, Tissue culture flask (TCF) 75 cm 2, Inkubator CO 2 5%, Laminary air flow cabinet, Water bath, Pipet Eppendorf, Tabung 15 ml, Tabung 50 ml, Yellow tip, Blue tip. Sementara itu untuk Uji antiplasmodium in vitro digunakan Microplate 96 sumuran, Cover slip, Tabung 15 ml, Yellow tip, Blue tip, Mikropipet, Inkubator CO 2 5%, Laminary air flow cabinet, Gelas obyek, Mikroskop cahaya, Kamera digital, sedangkan Uji penghambatan polimerase heme menggunakan perangkat Microplate 96 sumuran, Inkubator CO 2 5%, Laminary air flow cabinet, Hemositometer, Mikroskop cahaya, Tabung 15 ml, Yellow tip, Blue tip, ELISA plate reader. Terakhir untuk Uji sitotoksik Sel Vero digunakan instrumen Microplate 96 sumuran, Inkubator CO 2 5%, Laminary air flow cabinet, Hemositometer, Mikroskop cahaya, Tabung 15 ml, Yellow tip, Blue tip, ELISA plate reader.

4 f. Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan antara Februari 2013 Juli 2013.Pembuatan larutan uji dilakukan dan pelaksanaan penelitian dilakukan dilaboratorium Farmakologi FK UGMdan Laboratorium Parasitologi. g. Teknik Pengumpulan Data Pengumpulan data dilakukan berdasarkan hasil uji setelah perlakuan. h. Teknik Pengolahan Data dan Analisis Data Subyek dikelompokkan sesuai dengan dosis ekstrak benalu (Dendrophtoe pentandra) yang diberikan. Dosis efektif yang mampu menghambat pertumbuhan parasit, menghambat polimerase heme, dan menunjukkan viabilitas sel Vero hingga 50% (IC 50) dihitung berdasarkan hubungan antara dosis dan persentase hambatan pertumbuhan parasit oleh senyawa uji dengan analisis probit. 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil a. Uji Aktivitas Antiplasmodium Pada uji aktivitas antiplasmodium menggunakan pewarnaan Giemsa, jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit dihitung untuk mendapatkan persentase penghambatan parasitemia. Hasil pewarnaan disajikan dalam Gambar 3 dan hasil perhitungan persentase penghambatan parasitemia setelah perlakuan disajikan dalam Gambar 4. Gambar 4. Grafik persentase penghambatan parasitemia setelah perlakuan Kemampuan aktivitas antiplasmodium ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra terhadap P. falciparumfcr-3diuji secara statistik dengan analisis probit. Dari hasil penghitungan, didapatkan nilai dosis IC 50 sebesar 45,4μg/mL untuk ekstrak air, 169,7 μg/ml untuk ekstrak etanol, dan 13,19 μg/ml untuk klorokuin.nilai dosis IC 50 ini menunjukkan bahwa jumlah dosis yang dibutuhkan untuk menghambat parasitemia dari P. falciparumsebanyak 50%. b. Uji Penghambatan Polimerase Heme Pada uji penghambatan polimerase heme, sumuran yang berwarna lebih merah menandakan konsentrasi hematin yang tinggi, yang berarti memiliki aktivitas penghambatan polimerase heme rendah karena polimerase heme mengubah FPIX menjadi hemozoin/hematin. Persentasepenghambatan polimerase heme dihitung untuk mendapatkan rerata penghambatan polimerase hemesetelah inkubasi ekstrak air &etanol Dendrophthoe pentandra selama 24 jam yang ditunjukkan pada Gambar 6. Gambar 3.Hasil apusan darah tipis setelah pewarnaan Giemsa

5 Gambar 6.Grafik rerata persentase penghambatan polimerase heme. Aktivitas penghambatan polimerase heme ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandradiuji secara statistik dengan analisis probit. Dari hasil penghitungan, didapatkan nilai dosis IC 50 sebesar 1,6μg/mL untuk ekstrak air dan 1969,8 μg/ml untuk ekstrak etanol, dan 0,6 μg/ml untuk klorokuin.nilai dosis IC 50 ini menunjukkan bahwa jumlah dosis yang dibutuhkan untuk menghambat polimerase heme sebanyak 50%. c. Uji Sitotoksik Dari uji sitotoksik menggunakan pewarnaan MTT, didapatkan nilai absorbansi yang kemudian digunakan sebagai acuan untuk menentukan persentase kehidupan sel.hasil pengamatan sel dengan mikroskop disajikan pada Gambar 7. Gambar 7.Hasil pengamatan sel Vero dengan mikroskop. Hasil selengkapnya disajikan dalam Gambar 8 berikut: Gambar 8. Grafik persentase kehidupan sel Vero setelah perlakuan. Aktivitas sitotoksik ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra diuji secara statistik dengan analisis probit. Dari hasil penghitungan ini, didapatkan nilai dosis IC 50 sebesar 1484,5μg/mL untuk ekstrak air dan 845,6 μg/ml untuk ekstrak etanol, dan 180,05 μg/ml untuk klorokuin.nilai dosis IC 50 menunjukkan jumlah dosis yang berefek mematikan sel Vero sebanyak 50%. Pembahasan Berdasarkan uji aktivitas antiplasmodium, didapatkan nilai dosis IC 50Dendrophthoe pentandra adalah 45,4μg/mL untuk ekstrak air dan 169,7 μg/ml untuk ekstrak etanol. Suatu ekstrak dianggap berpotensi untuk dikembangkan sebagai terapi antimalaria jika memiliki IC 50 kurang dari 50 μg/ml (Syarif et al., 2010). Dari hasil uji antiplasmodium dapat dilihat bahwa ekstrak air memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi antimalaria karena memiliki IC 50 45,4μg/mL (< 50 μg/ml). Sementara itu, tingginya nilai IC 50 pada ekstrak etanol Dendrophthoe pentandra dapat disebabkan oleh penggunaan pelarut etanol yang diduga tidak sepenuhnya melarutkan kandungan zat aktif yang ada pada tanaman Dendrophthoe pentandra. Berbeda dengan klorokuin yang merupakan zat murni, ekstrak mengandung berbagai zat aktif nonspesifik sehingga membutuhkan dosis lebih besar untuk menimbulkan efek yang sama.

6 Suatu senyawa dapat memiliki aktivitas antiplasmodium dengan beberapa mekanisme yang berbeda, yaitu melalui penghambatan polimerase heme, inhibisi jalur folat, serta mengubah sintesis DNA.Semua proses ini merupakan efek toksik yang pada akhirnya menimbulkan kematian pada plasmodium.pada penelitian ini, ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra diharapkan memiliki aktivitas antiplasmodium, sehingga didapatkan kematian plasmodium melalui mekanisme penghambatan polimerase heme dan rendah efek samping bagi tubuh, ditandai dengan sitotoksisitasnya terhadap sel Vero yang rendah.berdasarkan hal ini, maka nilai IC 50 ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra yang rendah (<50 μg/ml) menunjukkan bahwa Dendrophthoe pentandra berpotensi untuk dikembangkan sebagai terapi antimalaria.dendrophthoe pentandra kemungkinan menimbulkan efek toksik dengan menghambat polimerase heme, dibuktikan dengan hasil IC 50 uji penghambatan polimerase heme yaitu 1,6μg/mL untuk ekstrak air dan 1969,8 μg/ml untuk ekstrak etanol. Ekstrak air memiliki IC 50 yang mendekati kontrol positif (klorokuin) menandakan aktivitas penghambatan polimerase heme yang baik.sementara ekstrak etanol memiliki IC 50 yang berbeda cukup besar dari ekstrak air dan kontrol positif kemungkinan menandakan zat aktif yang menghambat polimerase heme pada Dendrophthoe pentandra lebih larut air dibandingkan etanol. Selain itu, dapat juga disebabkan karena aktivitas antiplasmodium ekstrak etanol tidak terjadi melalui penghambatan polimerase heme, melainkan melalui jalur yang lain yaitumenghambat sintesis asam folat. Sementara itu didapatkan hasil uji sitotoksisitas terhadap sel Vero dengan IC 50 sebesar 1484,5μg/mL untuk ekstrak air dan 845,6 μg/ml untuk ekstrak etanol. Menurut Haryadi (2011), sebuah zat dikatakan memiliki sitotoksisitas yang tinggi terhadap sel Vero dan berbahaya untuk tubuh jika memiliki IC 50<100 μg/ml.berdasarkan kriteria tersebut disimpulkan bahwa kedua ekstrak Dendrophthoe pentandra memiliki efek sitotoksik yang rendah terhadap sel Vero sehingga aman bagi tubuh.hal ini menandakan bahwa ekstrak air dan etanol Dendrophthoe pentandra mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap P. falciparum FCR-3 yang terjadi melalui penghambatan polimerase heme dengan sitotoksisitas terhadap sel Vero yang rendah. Indeks selektivitas adalah kemampuan suatu senyawa membunuh plasmodium secara selektif dibandingkan dengan sel Vero. Dari hasil di atas didapatkan indeks selektivitas 32,69 untuk ekstrak air, 4,98 untuk ekstrak etanol, dan 13,65 untuk klorokuin. Dari hasil indeks selektivitas ini, dapat ditunjukkan bahwa ekstrak air lebih selektif membunuh plasmodium daripada sel Vero yang dianalogkan sebagai sel tubuh normal dibandingkan dengan klorokuin dan ekstrak etanol. 4. KESIMPULAN Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa Dendrophthoe pentandra memiliki aktivitas antiplasmodium yang baik terhadap P. falciparum FCR-3 dengan nilai IC 50 sebesar45,4μg/ml untuk ekstrak air dan 169,7μg/mL untuk ekstrak etanol. Aktivitas antiplasmodium terjadi melalui penghambatan polimerase heme dibuktikan dengan IC 50 sebesar 1,6μg/mL untuk ekstrak air dan 1969,8μg/mL untuk ekstrak etanol. Sementara itu efek sitotoksisitas Dendrophthoe pentandra terhadap sel Vero tergolong rendah dengan IC 50 sebesar 1484,5μg/mL untuk ekstrak air dan 845,6μg/mL untuk ekstrak etanol. Secara keseluruhan, ekstrak air lebih selektif membunuh plasmodium daripada sel Vero, dibandingkan klorokuin & ekstrak etanol, ditunjukkan dengan indeks selektivitas 32,69 untuk ekstrak air, 13,65 untuk klorokuin, & 4,98 untuk ekstrak etanol. Jenis senyawa dalam Dendrophthoe pentandra yang berperan aktif sebagai antimalaria belum diketahui secara

7 pasti.karena itu, perlu dilakukan isolasi senyawa aktif spesifik yang terkandung dalamdendrophthoe pentandra untuk mengetahui efek masing-masing senyawa tersebut. 5. REFERENSI Collins WE Plasmodium knowlesi: a malaria parasite of monkeys and humans. Ann Rev Entomol 57: D'Alessandro U, Buttiens H History andimportance of antimalarial drug resistance.trop Med Int Health 6 (11): Djoko AP Analisis DNA Terakilasi 1,2-Dimetilhidrasin Ekstrak TehHijau (Camellia sinensis). Laporan Penelitian Dasar Tahun1996/1997. Jakarta: Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan& Kebudayaan. Dondorp AM, Yeung S, White L, Nguon C, Day NP, Socheat D, von Seidlein, L Artemisinin resistence: current status and scenarios for containment. Nat rev Microbiol 8 (4): Dzulkarnain B Tanaman-tanaman Antimalaria.Jakarta: Puslitbang Farmasi, Balitbang Kesehatan,Depkes RI. European Commision2002.COST B9 Action onchemotherapy of Protozoal infections (Report).Brussel:European Cooperation in The Field of Scientific& Technical Research. Kayser O, Kiderlen AF,Croft SL NaturalProducts as Potential Antiparasitic Drugs. icsfromnature.pdf Lawrence M Enlisting a New Ally in The WarAgaints Malaria. In: Kumar, S. (ed). Discovery apublication of the Whitehead institute for biomedicalresearch.cambridge: Whitehead Institute. Mueller I, Zimmerman PA, Reeder JC Plasmodium malariae and Plasmodium ovale the "bashful" malaria parasites. Trends Parasitol 23 (6): Nadjm B, Behrens RH Malaria: an update for physicians. Infect Dis Clin N Am 26 (2): Najera JA.1996.Malaria Control Among refugees &displaced populations. WHO: World Health OrganlzatlonDivision of Control of Tropical Diseases Malaria Unit. PhairJP,Sommers HM Dasar Biologis dan Klinis PenyakitInfeksiPenerjemah: Wahab,S.Yogyakarta:Universitas Gadjah Mada Press. Pitoyo S Mistletoe Holticulture, Control and Utilisation. Trubus Agriwidia Riley EM The London School of Hygiene andtropical Medicine: a New Century of Malaria Research.Mem InstOswaldo Cruz 95: Syarif RA, Wahyuningsih MSH, Mustofa, Ngatidjan, Kurniawan H, Hilal SRA Aktivitas Antiplasmodium In Vitro Estrak Kembang Bulan (TithoniaDiversifolia (Hemsley) A.Gray) Terhadap Plasmodium falciparum. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada WindariFI,Rahajoe JS Mistletoes diversity in java island. WartaTumbuhan Obat Indonesia, 4: Yuliandini T Malaria, an Age Old Disease ProvesHard to Control. London:Associated Press.