KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK. (Skripsi) Oleh : Pratika Viogenta

Transkripsi

1 KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK (Skripsi) Oleh : Pratika Viogenta JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2010

2 ABSTRAK KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK Oleh PRATIKA VIOGENTA Antimikroba merupakan senyawa yang dikeluarkan oleh mikroorganisrne dan dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lain. Lactobacillus merupakan salah satu genus bakteri yang mampu menghasilkan senyawa antibakteri seperti asam organik, hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), karbon dioksida (CO 2 ), diacetyl dan bakteriosin. Terdapat empat jenis isolat Lactobacillus dari tempoyak yaitu L1, L2, L3 dan L4. Keempat isolat Lactobacillus tersebut mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Namun, karakteristik antibakteri yang dihasilkan oleh ketiga isolat belum diketahui. Tujuan dari penelitian ini adalah mendeteksi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 dengan cara mengukur total asam dan berat molekul bakteriosin isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4. Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Biomolekuler FMIPA Unila. Penentuan karakterisasi jenis antibakteri dilakukan dua tahapan yaitu penentuan asam organik dan protein sebagai senyawa antibakteri. Asam organik ditetapkan dengan mengukur ph media kultur dan total asam melalui titrasi menggunakan 0,1 N NaOH. Karakterisasi protein antibakteri dilakukan secara observasi. Karakterisasi protein antibakteri ditentukan dengan menetralkan supernatant kemudian diuji dengan metode difusi sumuran terhadap bakteri uji yaitu Esherchia.coli, Salmonella paratyphii,

3 Bacillus substilis dan Staphilococcus aureus. Terbentuknya zona jernih menunjukkan zat antibakteri berupa protein, dilanjutkan dengan menetukan berat molekul protein yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan teknik Sodium Dodecyl Sulfat Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE). Hasil penelitian menunjukkan bahwa antibakteri yang dihasilkan dari isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 berupa senyawa asam organik. Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 menghasilkan asam organik maksimum berturut-turut yaitu sebesar 37,15 untuk Lactobacillus L1, 36,13 untuk Lactobacillus L2, 29,94 untuk Lactobacillus L3, dan 7,89 untuk Lactobacillus L4. Selama fermentasi berlangsung, total asam organik yang diproduksi oleh keempat isolat Lactobacillus meningkat hingga hari ke 5 waktu produksi. Dari hasil SDS-Page diperoleh pada isolat L1, L2 dan L3 tidak terdapat pita protein yang terbentuk, sedangkan isolat Lactobacillus L4 menghasilkan protein dengan berat molekul 15 kda, 24 kda, 53 kda dan 169 kda akan tetapi bukan sebagai antibakteri Key Word : Lactobacillus, Asam organik, Bakteriosin,Total Asam, SDS-PAGE

4 KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK Oleh Pratika Viogenta Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA SAINS Pada Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2010

5 Judul Skripsi Nama Mahasiswa : KARAKTERISTIK ANTI BAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK : Pratika Viogenta Nomor Pokok Mahasiswa : Jurusan Fakultas : Biologi : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam MENYETUJUI 1. Komisi Pembimbing Dr. Sumardi, M.Si Dra. Christina.N Ekowati, M.Si NIP NIP Ketua Jurusan Biologi Dra. Nuning Nurcahyani, M. Sc NIP

6 MENGESAHKAN 1. Tim Penguji Ketua : Dr. Sumardi, M. Si... Sekretaris : Dra. Christina N. Ekowati, M. Si... Penguji Bukan Pembimbing : Kusuma Handayani, M. Si Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Dr. Sutyarso, M. Biomed. NIP Tanggal Lulus Ujian Skripsi : 18 November 2010

7 DAFTAR RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kota Bandar Lampung pada tanggal 24 Maret 1989, dari pasangan Sanyoto dan Inah Lestari, S.Pd, sebagai anak kedua dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Al-Azahar Perumnas Way Halim pada tahun 1994, pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 2000 di Sekolah Dasar Al- Azahar Perumnas Way Halim, Sekolah Lanjutan Tingkat Pertama diselesaikan di SLTP Negeri 19 Bandar Lampung pada tahun 2003, dan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 2 Bandar Lampung pada tahun Penulis tercatat sebagai mahasiswa di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur SPMB ( Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru) pada tahun Selama menjadi mahasiswa, penulis berkesempatan mengikuti berbagai kegiatan keorganisasian di UKM. Rohani Islam tahun sebagai anggota Biro Akademik, di HIMBIO sebagai anggota Bidang Hubungan Masayarakat pada tahun dan sebagai seketaris Bidang Keilmuan pada tahun , dan di BEM FMIPA sebagai seketaris Dinas Lingkungan Hidup pada tahun Penulis juga pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah Fisiologi Tumbuhan, Genetika, Mikrobiologi Pangan dan Industri, Mikrobiologi Umum, Mikrobiologi Lingkungan, Fisiologi Mikrobiologi jurusan biologi FMIPA, Mikrobiologi STIKES UMITRA, Mikrobiologi Umum guru-guru SMP tahun 2010, dan

8 Pengenalan SAINS kepada guru-guru SD tahun Pada tahun 2009 penulis melaksanakan kerja praktek di Loka Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit Bersumber Binatang (Litbang P2B2) Banjarnegara, Jawa Tengah.

9 Jika niat sudah tertuju karena Allah, tidak akan ada halangan yang bisa menghentikan seseorang melakukan sesuatu. Niat karena Allah ialah motivator yang utama dan seharusnya menjadi satu-satunya motivator kita. Allah SWT memerintahkan kita untuk mau berpikir tentang penciptaan-nya yang begitu menakjubkan, rumit, dan kompleks. Namun semua itu telah Allah SWT tundukan untuk kita. Ini sebagai tanda bahwa manusia memiliki kemampuan (dari Allah) untuk menundukan apa yang ada di langit dan di bumi. Allah SWT, tidak akan pernah menjanjikan hari-hari kita berlalu tanpa sakit, berhias tawa tanpa kesedihan, senang tanpa kesulitan, tapi Allah SWT menjajikan kekuatan kepada kita untuk dapat melewatinya

10 Dengan Menyebut Nama Allah yang Maha Pengasih Dan Maha Penyayang Dengan segala Cinta dan Kasih sayang kupersembahkan karya sederhana ini teruntuk orangorang yang akan selalu berharga dalam hidupku : Ibu dan Bapak tercinta dan dicintai Allah SWT Masku : Septian D.C Almamater yang ku banggakan

11 SANWACANA Puji syukur penulis panjatkan kehadiran Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat, taufik serta hidayah-nya sehingga penulis dapat menyelelesaikan skripsi yang berjudul KARAKTERISTIK ANTIBAKTERI ISOLAT Lactobacillus DARI TEMPOYAK dengan tepat waktu. Penelitian ini merupakan rangkaian dari penelitian ISOLASI DAN KARAKTERISASI Lactobacillus DARI TEMPOYAK YANG BERPOTENSI SEBAGAI PENGAWET HAYATI BAHAN PANGAN yang didanai oleh Dirjen Dikti Kementrian Pendidikan Nasional melalui Hibah Penguasaan Teknologi (Strategis Unila). Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada suri taudalan terbaik umat manusia Nabi Muhamammad SAW. Penyelesaian ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak baik berupa bantuan pemikiran ataupun bantuan moril sehingga pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih dengan setulus hati kepada. 1. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., selaku pembimbing satu atas ide, saran-saran, motivasi, kesabarannya, waktunya serta bimbingannya kepada penulis dalam penyelesaian hasil penelitian ini. 2. Ibu Dra. Christina. N. Ekowati, M.Si., selaku pembimbing kedua atas kesabarannya dalam membimbing, mengkoreksi, kasih sayangnya, dan selalu memotivasi penulis.

12 3. Ibu Kusuma Handayani, M. Si selaku penguji yang telah memberikan saransaran, kritik serta koreksinya kepada penulis. 4. Bapak dan Ibu tercinta yang senantiasa memanjatkan doa, memberikan dukungan moril dan materil pada penulis. Semoga Allah SWT, senantiasa memberikan kemuliaan di dunia dan akhirat. 5. Ibu Dra. Rumyati, M.Si., selaku dosen pembimbing akademik atas bimbingannya selama penulis menjadi mahasiswa di Jurusan Biologi FMIPA Unila. 6. Bapak Dr. Sutyarso, M.Biomed., selaku Dekan FMIPA Unila. 7. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA yang telah memberikan kemudahan pada penulis. 8. Seluruh dosen dan staf karyawan FMIPA khususnya jurusan Biologi 9. Kakakku yang telah memberikan perhatian serta kasih sayang yang mengalir tiada hentinya selama ini. 10. Teman seperjuanganku Kak Robi yang selalu membantu meski sudah lulus terlebih dahulu. 11. Penghuni lab mikrobiologi (mbak wiwin, mbak nur, kak asep, deby, ros, ria, mahendra) terima kasih atas bantuannya, perhatiannya, nasehatnya dan canda tawa sehingga penulis tidak merasa jenuh. 12. Teman-temanku Dora, Nensi, Gina, Rima dan semua teman-teman angkatan 2006 yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas kebersamaan, bantuannya dan semua kenangan yang telah kita lalui bersama. 13. Adik-adikku penerus generasi mikrobiologi Ratna, Zahra, Dwi, Diah dan Wiwik jangan mudah menyerah dan selalu semangat.

13 14. Pak Sungadi, Pak Tris, Pak Imron, Bu Endang dan seluruh saudaraku biologi angkatan ( 05-09) serta semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu terima kasih atas bantuan selama ini dan persahabatannya. Semoga Allah SWT membalas segala bantuan yang telah diberikan kepada penulis dan semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat bagi yang membacanya Bandar Lampung, November 2010 Pratika Viogenta

14 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... i DAFTAR GAMBAR... ii I. PENDAHULUAN... 1 A. Latar Belakang... 1 B. Tujuan Penelitian... 3 C. Kerangka Pemikiran... 3 D. Hipotesis... 4 E. Manfaat Penelitian... 5 II. TINJAUAN PUSTAKA... 6 A. Lactobacillus... 6 B. Antibakteri... 7 C. Asam Organik... 8 D. Hidrogen Peroksida E. Karbon Dioksida F. Bakteriosin Karakteristik Bakteriosin Penggolongan Bakteriosin Mekanisme Kerja Bakteriosin Imunitas Bakteri Penghasil Bakteriosin III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian B. Alat dan Bahan C. Metode Penelitian D. Prosedur Kerja Peremajaan Bakteri Produksi Senyawa Antibakteri Karakterisasi Antibakteri Berupa Asam Organik Uji Daya Antibakteri... 25

15 5. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE) dan Identifikasi Aktivitas Pita Protein Diagram Alir IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Asam Organik B. Karakterisasi Antibakteri Senyawa Protein V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

16 DAFTAR TABEL Tabel Halaman 1. Klasifikasi Bakteriosin Penggolongan Bakteriosin Berdasarkan Kandungan Sistein Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan Analisis Ragam Total Asam yang Dihasilkan Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 Dan L4 Terhadap Waktu Produksi (Hari) Zona Hambat dari Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum dan Sesudah Dinetralkan Terhadap Bakteri Uji Hasil Pengukuran ph Media Kultur Isolat Lactobacillus Hasil Pengukuran Total Asam Media Kultur Isolat Lactobacillus Penetuan Kurva Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap Mobilitas Relatif (rf) Penetuan Berat Molekul Protein Terhadap Mobilitas Relatif (Rf) Pada Isolat Lactobacillus L4

17 DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 10. Model Pembentukan Pori pada Membran, Barrel-Stave dan Carpet Model Model Mekanisme Kerja Protein Imunitas Bentuk Sumur Dilihat dari Bagian Bawah Cawan Petri Pola Perubahan ph Media Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang Diamati Tiap Hari Sampai Hari Ke Total Asam Organik Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 yang Diamati Tiap Hari Sampai Hari Ke Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L Uji Polinomial Orthogonal Isolat Lactobacillus L SDS-PAGE Isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L Gel SDS-PAGE Ektrak Antibakteri L4 yang Diuji Terhadap St.Aureus Isolat Lactobacillus L Isolat Lactobacillus L Isolat Lactobacillus L Isolat Lactobacillus L

18 25. Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Staphylococcus aureus Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Bacillus substilis Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Escherchia coli Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sebelum Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii Uji Sumur Ekstrak Antibakteri Isolat Lactobacillus L1, L2, L3 dan L4 Sesudah Dinetralkan Pada Bakteri Uji Salmonella paratyphii Grafik Logaritma Berat Molekul Protein Standart Terhadap Mobilitas Relatif... 52

19 I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Lactobacillus merupakan salah satu mikroorganisme yang aman jika ditambahkan dalam bahan pangan karena sifatnya tidak tosik dan tidak menghasilkan toksik. Bahkan, Lactobacillus bermanfaat bagi kesehatan dan meningkatkan keamanan bahan pangan melalui penghambatan secara alami terhadap pertumbuhan mikroorganisme berbahaya yang menyebabkan pembusukan pada makanan maupun menyebabkan penyakit. Lactobacillus berfungsi sebagai pengawet makanan karena mampu memproduksi senyawa antibakteri seperti asam organik, hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), karbon dioksida (CO 2 ), diacetyl dan bakteriosin (Kusmiati dan Malik, 2002). Lactobacillus ditemukan pada produk-produk makanan fermantasi seperti thongcai, lemma, tempoyak, ikan fermentasi, tauco, rebung asin dan sawi asin (Wulandari, 2005). Tempoyak merupakan salah satu jenis makanan tradisional yang melibatkan bakteri Lactobacillus dalam prosesnya. Tempoyak berasal dari daging buah durian yang diolah dengan cara fermentasi secara spontan dengan menambahkan garam 6-16 % dalam wadah tertutup. Tempoyak dikenal di Indonesia, terutama di Sumatera dan Kalimatan serta Malaysia (Yuliana dan Garcia, 2010). Isolat yang ditemukan

20 di dalam tempoyak antara lain Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. mali, L. fermentum L.casei, dan L. corynebacterium. Jenis bakteri asam laktat lain yang juga ditemukan pada tempoyak yaitu Leuconostoc mesenteroides, Pediacoccus acidilactici dan Weisella mesenteroides ( Yuliana dan Garcia, 2009). Ekowati (2000) melaporkan bahwa dua jenis isolat Lactobacillus yang diperoleh dari tempoyak mampu menghambat pertumbuhan Escherchia coli dan Streptococcus haemoliticus. Konsentrasi filtrat kedua isolat Lactobacillus tersebut mulai dari 40 % (v/v) efektif menurunkan jumlah sel bakteri E. coli dan S. haemoliticus. Berdasarkan hasil analisis asam organik, isolat Lactobacillus memproduksi asam laktat 0,4257 % (v/v), asam asetat 0,0717 % (v/v), asam propionat 0,0502 % (v/v), dan asam butirat 0,01 % (v/v). Ekowati (2009) memperoleh tiga jenis isolat Lactobacillus dari tempoyak yaitu L1, L2 dan L3. Ketiga isolat Lactobacillus tersebut mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Daya hambat zat antibakteri dari ketiga isolat terhadap pertumbuhan Escherichia coli relatif sama, yang terlihat dari diameter zona hambat berkisar 1,65 cm-2,2 cm. Hal ini menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut menghasilkan suatu senyawa antibakteri tertentu. Menurut Ogunbawo et all (2003), Lactobacillus plantarum ST194BZ menghasilkan senyawa antibakteri dalam bentuk asam organik dan protein. Jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh ketiga isolat belum diketahui. Berdasarkan permasalahan tersebut maka perlu

21 dilakukan penelitian mengenai karakteristik antibakteri yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus dari tempoyak. B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat Lactobacillus dari tempoyak. C. Kerangka Pemikiran Lactobacillus dapat diisolasi dari makanan yang telah mengalami fermentasi seperti tempoyak. Pada proses terbentuknya tempoyak, penambahan garam dapur sebesar 3-7 % pada daging buah durian akan menyebabkan Lactobacillus tumbuh dengan baik. Hasil metabolit Lactobacillus pada tempoyak terbentuk asam-asam organik dari karbohidrat yang berasal dari daging buah durian. Beberapa asam organik dapat bersifat toksik terhadap mikroorganisme patogen ataupun mikroorganisme pembusuk pada makanan. Isolat Lactobacillus yang diperoleh dari tempoyak berpotensi menghasilkan senyawa antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli. Daya hambat zat antibakteri dari ketiga isolat terhadap pertumbuhan Escherichia coli relatif sama, yang terlihat dari diameter zona hambat berkisar 1,65 cm 2,2 cm. Lactobacillus yang berasal dari tempoyak mampu memproduksi jenis asamasam organik, yaitu asam laktat 0,4257 % (v/v), asam asetat 0,0717 % (v/v), asam propionat 0,0502 % (v/v), dan asam butirat 0,01 % (v/v). Senyawasenyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan dari bakteri patogen dan

22 bakteri pembusuk makanan sehingga dapat digunakan sebagai zat antibakteri. Pada umumnya tidak hanya asam organik yang dihasilkan Lactobacillus mampu menghambat mikroorganisme lain tetapi terdapat senyawa lain yang ikut berperan di dalam penghambatan pertumbuhan bakteri pembusuk dan patogen seperti H 2 O 2, diasetil, CO 2, dan bakteriosin. Dalam metabolisme Lactobacillus, ada kemungkinan Lactobacillus yang berasal dari tempoyak mengubah asam-asam organik menjadi asam amino. Asam asam amino tersebut dapat digunakan oleh Lactobacillus untuk menyusun bakteriosin atau protein penghambat. Bakteriosin merupakan substansi protein yang dikode oleh plasmid, umumnya mempunyai berat molekul kecil serta memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri lain (bakterisidal), terutama yang memiliki kekerabatan erat secara filogenik. Bakteriosin dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus antara fase logaritmik dan awal fase stasioner. Faktor lingkungan sangat mempengaruhi pertumbuhan bakteri Lactobacillus maupun hasil metabolitnya. Penambahan substrat seperti ekstrak yeast (3%), NaCl ( %), glukosa (1.0%) dan Tween 80 (0.5%) menghasilkan bakteriosin dalam jumlah optimal. Substrat-substrat tersebut digunakan Lactobacillus sebagai prekursor senyawa antibakteri. Aktivitas maksimal bakteriosin dicapai pada awal ph 5.5 dan diinkubasi antara 48 jam hingga 60 jam pada suhu o C. D. Hipotesis Hipotesis yang diajukan yaitu isolat Lactobacillus dari tempoyak dapat menghasilkan antibakteri berupa senyawa asam organik dan protein.

23 E. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus dari tempoyak dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain. Selanjutnya informasi ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai biopreservatif terhadap bahan pangan.

24 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Lactobacillus Lactobacillus merupakan bakteri gram positif, tidak berspora, berbentuk batang atau coccosbacilli. Pada umumnya mengandung guanin-citosin di dalam DNA kurang dari 50 mol%. Lactobacillus dapat melakukan fermentasi, bersifat aero-toleran atau anaerobik, aciduric atau acidophilic dan memerlukan asupan nutrisi yang kompleks seperti karbohidrat, asam amino, peptida, ester asam lemak, garam, derivat asam nukleat dan vitamin. Lactobacillus tidak mensintesis porphyrinoids begitu juga dengan aktivitas yang terkait dengan porphyrinoids. Namun, terdapat beberapa strain dari Lactobacillus dapat menggunakan porphorinoid dari lingkungan dan memperlihatkan aktivitas katalase, reduksi nitrit bahkan sitrokrom. Strain Lb. mali mampu membentuk pseudocatalase (Wood dan Holzapfel, 1995). Lactobacillus mampu merombak senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan hasil akhirnya yaitu asam laktat (Rostini, 2007). Glukosa sebagai sumber karbon dimetabolisme membentuk 85 % asam laktat oleh Lactobacillus yang bersifat homofermentatif atau menghasilkan asam laktat, CO2, etanol oleh Lactobacillus yang bersifat heterofermentatif (Nur, 2005).

25 Apabila jumlah oksigen atau senyawa oksidan lain meningkat, sejumlah asam asetat akan terbentuk dari asam laktat atau etanol melalui reaksi asetat kinase. Demikian variasi metabolisme Lactobacillus membentuk metabolit. Berbagai hasil metabolit seperti sitrat, malat, tartar, quinolat, nitrat, dan nitrit dapat juga di metabolisme kembali dan digunakan sebagai sumber energi atau penerima elektron terakhir (Wood dan Holzapfel, 1995).. B. Antibakteri Antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme hidup yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain terutama bakteri, bahkan dapat membunuhnya (Irianto, 2007). Suatu antibakteri yang ideal memiliki toksisitas selektif, berarti obat antibakteri tersebut hanya berbahaya bagi bakteri, tetapi relatif tidak membahayakan bagi hospes. Berdasarkan sifat toksisitas selektif. Ada bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) dan ada yang bersifat membunuh bakteri (bakterisida). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu: 1) Merusak dinding sel yaitu dengan menghambat pembentukan dan mengubahnya setelah selesai terbentuk. 2) Mengganggu permeabilitas sel yaitu dengan merusak membran sel. Fungsi membran sel adalah mempertahankan bahan-bahan dalam sel serta mengatur aliran keluar masuknya bahan lain. Adanya kerusakan pada membran ini mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya.

26 3) Merubah molekul protein dan asam nukleat yaitu dengan mendenaturasikan protein dan asam nukleat sehingga kerusakan sel tidak dapat diperbaiki lagi karena hidup suatu sel tergantung pada molekul protein dan asam nukleat dalam keadaan alamiah. 4) Menghambat kerja enzim dengan mengganggu reaksi biokimiawi. Penghambatan ini dengan mengakibatkan terganggunya metabolisme sel. 5) Menghambat sintesis asam nukleat dan protein. Gangguan pada pembentukan atau fungsi-fungsi DNA, RNA dan protein dapat mengakibatkan kerusakan total pada sel, karena zat-zat tersebut memegang peranan penting dalam proses kehidupan normal sel (Mulyanti, 2009). Bakteri Lactobacillus berpotensi menghasilkan antibakteri yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme berbahaya yang menyebabkan pembusukan pada makanan maupun menyebabkan penyakit melalui produk metabolik seperti asam organik, hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), karbon dioksida (CO 2 ), diacetyl dan bakteriosin (Ogunbanwo et all, 2003). C. Asam Organik Ketika proses fermentasi glukosa, Lactobacillus mampu memproduksi asam laktat secara homofermentasi atau sebanding dengan jumlah asam laktat, asam asetat, etanol dan karbondioksida secara heterofermentatif. Apabila proses tersebut diamati selama seminggu, asam organik yang dihasilkan Lactobacillus memiliki suatu aktivitas antimikroba yang lebih besar pada ph

27 rendah dibandingakan dengan ph netral. Mengenai kedua asam yang terbentuk, asam asetat memiliki aktivitas penghambat yang paling kuat dan mempunyai suatu cakupan lebih luas dalam hal aktivitas menghambat pertumbuhan khamir, kapang dan bakteri sedangkan asam propionat memiliki efek antimikroba yang kuat khususnya untuk khamir dan kapang (Salminen et all, 2004). Aktivitas antimikroba asam asetat dan asam propionat lebih kuat dibandingkan dengan aktivitas antimikroba dari asam laktat. Hal ini dapat dijelaskan dari tingginya nilai pka asam asetat ( pka = 4,87) dan asam propionat (pka = 4, 75) dibandingkan dengan nilai pka asam laktat (pka = 3,08). Sebagai contoh, pada ph 4, hanya 11 % dari asam laktat yang tidak terdisosiasi sedangkan 85 % asam asetat dan 92 % asam propionat tidak terdisosiasi. Namun, ketika terbentuk campuran asam-asam organik, terjadi kerja sama dalam meningkatkan aktivitas menghambat. Sebagian besar asam laktat menyebabkan ph menurun disaat asam asetat dan asam propionat yang tidak terdisosiasi menjadi agen antimikroba. Gabungan dari asam laktat dan asam asetat mampu mengurangi laju pertumbuhan Salmonella enetric ser var Typhimurium lebih baik daripada aktivitas masing-masing dari asam laktat atau asam asetat sendiri (Salminen et all, 2004). Asam laktat selain menurunkan ph juga dapat menggangu permeabilitas membran, dengan demikian dapat meningkatkan aktivitas dari substansi antimikroba lainnya. Mekanisme antimikroba asam laktat berdasarkan teori "chemiosmotic" dan ph homeostasis. Ketika asam laktat yang diproduksi

28 disekresikan ke lingkungan, beberapa molekul terdisosiasi menjadi H + dan anion, sementara yang lain tidak terdisosiasi. Salah satu faktor yang berperanan terhadap terdisosiasi atau tidaknya suatu molekul adalah ph lingkungan dan pk (tetapan keseimbangan). Hal ini menyebabkan peningkatan proton transmembran yang pada akhirnya menyebabkan gradient proton. Perbedaan ini menyebabkan proton lebih cepat masuk ke dalam sel sehingga meningkatkan kebutuhan energi untuk mempertahankan ph alkali dalam sel. (Lunggani, 2007). Banyak orang mengasumsikan bahwa molekul asam lemah yang tidak terdisosiasi menjadi racun, walaupun asam yang terdisosiasi telah banyak yang mengamati juga mampu menghambat pertumbuhan mikroba. Hal ini dapat dijelaskan bahwa asam organik yang tidak terdisosiasi (netral) dapat berdifusi melewati membran sel karena asam organik yang tidak terdisosiasi larut dalam lipid. Setelah memasuki sel, asam akan terdisosiasi pada ph sitoplasma yang biasanya mendekati netral (Salminen et all, 2004). Banyak peneliti menyatakan bahwa pelepasan proton ke dalam sitoplasma berperan penting di dalam proses pengasaman dan menghilangnya perbedaan ph yang berlebih pada membran sehingga menyebabkan pertumbuhan mikroba terhambat. Namun, beberapa peneliti lainnya menyatakan bahwa hipotesis ini harus ditinjau kembali karena melihat bahwa proton tidak dapat ditranslokasi. Menurut mereka, akumulasi anion yang menjadi faktor utama menyebabkan pertumbuhan mikroba terhambat jika dilihat dari jumlah anion berkurang pada sintesis makromolekul dan anion mempengaruhi sistem

29 transport pada membran sel. Seperti bakteri lainnya, bakteri asam laktat memberikan efek penetralan dari akumulasi anion dengan cara mengurangi ph sitoplasma mikroba patogen dan mikroba pembusuk (Salminen et all, 2004). D. Hidrogen Peroksida Dalam kondisi adanya oksigen, bakteri asam laktat menghasilkan hydrogen peroksida melalui oksidasi molekul yang mengandung flavoprotein, oksidasi NADH, dan superoxide dismutase. Bakteri asam laktat tidak menghasilkan katalase yang berfungsi mungurai hydrogen peroksida. Pada sistem lainnya bahwa penguraian hydrogen peroksida tidak seaktif dibandingkan dengan produksi hydrogen peroksida itu sendiri sehingga terjadi akumulasi hydrogen peroksida. Hydrogen peroksida tidak akan terakumulasi sebab hydrogen proksida diuraikan oleh peroksidase, flavoprotein, dan pseudcatalase. Pengaruh bakterisidal dari hydrogen peroksida dihubungkan dengan efek oksidasi yang kuat di dalam sel bakteri seperti kelompok sulfidril dari protein sel dan lipid membran dapat dioksidasi. Untuk menghasilkan hidrogen peroksida dibutuhkan oksigen sehingga menyebabkan lingkungan menjadi anerobik. Hal ini tidak baik untuk organisme yang bersifat aerobik (Salminen et all, 2004). Di dalam kondisi normal, pengaruh antimikroba dari hidrogen proksida kemungkinan ditingkatkan karena adanya lactoperoksidase dan thiocyanate (SCN - ). SCN - +H 2 O 2 lactoperoxidase OSCN - + H 2 O

30 OSCN - menyebabkan kerusakan struktural dan perubahan pada membran sel bakteri. Namun yang menjadi faktor utama hidrogen peroksida menjadi senyawa antimikroba yaitu menghambat proses glikolisis. Hidrogen peroksida menghambat pengangkutan glukosa, aktivitas heksokinase, dan aktivitas glyceraldehyde-3-phosphat dehidrogenase dengan cara mengoksidasi sulfhydryl yang terdapat didalam enzim tersebut (Salminen et all, 2004). E. Karbon Dioksida Karbon dioksida dihasilkan selama proses fermentasi glukosa dan respirasi berlangsung. Karbon dioksida memiliki pengaruh antimikroba ganda. Karbon dioksida dapat menyebabkan lingkungan menjadi anaerob dan karbon dioksida itu sendiri bersifat antimikroba. Mekanisme penghambatan dari karbon dioksida belum banyak diketahui tetapi karbon dioksida mampu menghambat aktivitas enzim dehidrogenase dan terjadinya akumulasi karbon dioksida di dalam lipid bilayer menyebabkan tidak berfungsinya permeabilitas membran. Pada konsentrasi karbon dioksida dalam keadaan rendah dapat merangsang pertumbuhan beberapa organisme sedangkan pada konsentrasi yang lebih tinggi dapat menghambat pertumbuhan (Salminen et all, 2004).

31 F. Bakteriosin Karakteristik Bakteriosin Bakteriosin merupakan antimikrobia yang berupa protein dan disintesis secara ribosomal (Suparjo, 2008). Bakteriosin memiliki pengaruh bakterisidal dan bakteriostatik terhadap bakteri yang mempunyai hubungan dekat dengan bakteri penghasilnya (Kusmiati dan Malik, 2002). Bakteri target memiliki sifat pengikatan spesifik (specific binding site) (Usmiati,2009). Bakteriosin biasanya tahan terhadap panas, dan aktivitasnya masih tetap ada dalam lingkungan asam misalnya pada suhu 100 C atau 121 C selama 15 menit (Ogunbawo et all, 2003), demikian pula suhu yang sangat rendah dalam penyimpanan tidak mempengaruhi aktivitas bakteriosin. Umumnya, bakteriosin memiliki sifat mudah didegradasi enzim proteolitik seperti protease (Usmiati,2009). Bakteriosin dihasilkan baik oleh bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif. Bakteriosin gram positif mengandung 30 sampai 60 asam amino dengan aktifitas yang bervariasi dari spektrum sempit sampai luas delam melawan bakteri gram positif lainnya (Suparjo,2009). Bakteriosin disintesis selama fase eksponensial pertumbuhan sel mengikuti pola sintesis protein. Sistem ini diatur oleh plasmid DNA. Pada umumnya, bakteriosin non lantibiotik disintesis melalui jalur

32 ribosomal, sedangkan kelompok lantibiotik disintesis secara ribosomal sebagai prepeptida kemudian mengalami modifikasi. Sekresi prepeptida dilakukan pada fase eksponensial dan diproduksi secara maksimal pada fase stasioner. Prinsip regulasi sintesis bakteriosin diatur oleh adanya gen pengkode produksi dan pengkode immunitas. Aktivitas produksi bakteriosin oleh bakteri asam laktat dipengaruhi oleh faktor ph, suhu, sumber karbon, serta fase pertumbuhan. Jenis sumber karbon maupun sumber nitrogen yang digunakan dalam medium produksi mempengaruhi laju pertumbuhan sel bakteri asam laktat, selanjutnya berpengaruh terhadap metabolisme produksi bakteriosin. Selain itu, tingkat salinitas medium produksi seperti kandungan garam dari media turut mempengaruhi metabolisme produksi bakteriosin. Secara umum kondisi optimum produksi bakteriosin selain dipengaruhi oleh fase pertumbuhan, ph media, suhu inkubasi, jenis sumber karbon dan sumber nitrogen juga konsentrasi NaCl (Kim, 1990) Penggolongan Bakteriosin Bakteriosin berdasarkan sifat kimia, struktur dan fungsinya dibagi menjadi 4 kelas yaitu a. Kelas I : Lantibiotik, peptida molekul kecil dengan berat molekul kurang 5 kda mengandung lanthionine (Lan), β-metyl lanthionine (MeLan), dehydroalanine dan dehydrobutyrine serta mengandung 19 sampai 50 asam amino. Kelas ini dibagi lagi menjadi menjadi 2 tipe berdasarkan struktur kimia dan aktifitas antimikroba, yaitu tipe

33 A dan tipe B. Tipe A memiliki bentuk ulir, bermuatan positif, aktifitasnya berhubungan dengan pembentukan pori pada membran sel. Tipe B memiliki bentuk globular bermuatan negatif atau netral, aktifitas mikrobanya terkait dengan penghambatan enzim spesifik. b. Kelas II : peptida yang stabil terhadap panas, berat molekul lebih kecil dari 10 kda, tidak memiliki asam amino lantionine dan tidak terjadi perubahan asam amino. Kelas ini dibagi menjadi tiga subkelas, yaitu bakterosin yang mempunyai efek antilisterial (IIa), bakteriosin dengan dua peptida (IIb), dan bakteriosin yang disekresikan melalui sec-dependent (IIc). Namun menurut van Belkum dan Stiles dalam Supajo (2009) membagi kelas bakteriosin ini menjadi enam subkelas antara lain IIa : cystibiotics dengan dua ikatan disulfida yang dihasilkan dari empat asam amino sistein. Contoh pediosin PA-1, pediosin AcH, Enterocin A dan Divercin V41. IIb : Cyntibiotics dengan satu ikatan disulfida dari dua residu sistein pada N-section peptida, contoh pada leucocin A. IIc : cyntibiotics dengan satu ikatan disulfida pada N- dan C-section peptida, contoh pada carnobacteriocin A dan enterocin B. IId : peptida yang mengandung satu (thiolbiotics) atau tanpa sisten, contoh pada lactococcin A dan B. IIe : bakteriosin yang memiliki dua peptida, contoh pada thermophilin 13, lactacin F, plantaracin S, plantaracin A, plantaracin EF, plantarain JK, lactococcin G dan lactococcin M. Iif : bakteriosin khas, contoh entrocin 4.

34 c. Kelas III : protein labil terhadap panas dengan molekul lebih besar dari 30 kda d. Kelas IV : suatu kelompok bacteriocin kompleks. Protein ini mengandung lipid atau karbohidrat (glikoprotein dan lipoprotein), Bakteriosin yang bersifat hidrofobik dan stabil terhadap panas. (Alpay et all, 2003 ; Suparjo, 2008). Tabel 1. Klasifikasi Bakteriosin Kelompok Karakteristik Contoh Bakteriosin Bakteri Penghasil I A Molekul kecil (2-5 kda), mengandung asam amino lanthionine dan β- methyllanthionine, bermuatan positif, berbentuk ulir Nisin Pep 5 Epidermin Lactoccin S Gallidermin Lacticin 481 Lactococcus lactis Stapylococcus epidermidis Stapylococcus epidermidis Lactobacillus sake Stapylococcus gallinarum Lactococcus lactis B Molekul kecil (< 2 kda), bermuatan negatif atau netral, berbentuk globular Marsacidin Actagardin Bacillus subtilis Actinoplasnes sp Cinnamycin Streptomyces cinnamoneus II a Peptida anti-listerial Pediosin PA-1/AcH Pediococcus acidilactici H / PAC1.0 Sakacin A Lactobacillus sake LB706 Sakacin P Lactobacillus sake LTH 674 Leucocin A- UAK187 Carnobacteriocin B2 Mesentrecin Y105 Leuconostoc gelidium UAL187 Carnobacterium piscicola LV17B Leuconostoc mesenteroides

35 Lactococcin MMFII Lactococcus lactis B Bakteriosin 2-peptida Lactococcin G Lactococcus lactis Lactococcin M Lactococcus lactis Lactacin F Lactobacillus johnsonii Plantacirin A Lactobacillus plantarum Plantacirin EF Lactobacillus plantarum Plantacirin JK Lactobacillus plantarum C Bakteriosin yang disekresikan melalui secdependent Acidin B Carnobacteriocin A Lactobacillus acidophilus Carnobacterium piscicola LV17A Divergicin A Arnobacterium divergens LV13 Enterocin P Enterococcus faecum Enterocin B Enterococcus faecum T136 Lactococcin A Lactococcus lactis LMG2130 Lactococcin B Lactococcus lactis WMA4 Acidocin B Lactobacillus acidophilus M46 Cerein 7 / 8 Bacillus cereus Bc7 III Molekul besar (> 30 kda) sensitif terhadap panas Helveticins J Helveticins V-1829 Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus IV Mengandung protein dan lipid Lactococcin 27 Lacstrecins (Suparjo,2008)

36 Bakteriosin berdasarkan kandungan sistein atau ikatan disulfida dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu 1. Cystibiotic; mengandung dua atau lebih asam amino sistein untuk ikatan disulfida 2. Thiobiotic ; mengandung satu sistein 3. Tanpa sistein Tabel 2. Penggolongan Bakteriosin Berdasarkan Kandungan Sistein Bakterosin Cystibiotics Berat Molekul (kda) Asam Amino Bakteri Penghasil Pediosin AcH/PA1 Leucocin A/UAL 187 Mesentericin Y 105 Sakacin A Sakacin P Lactacin F Carnobacteriocin A Carnobacteriocin BM1 Carnobacteriocin B2 Cerein 7/8 4,6 3,9 3,8 4,3 4,4 5,6 6,1 4,5 4,9 4, Pediococcus acidilactic H/PAC1.0 Leuconostoc gelidium UAL 187 Leuconostoc mesenteroides Y 105 Lactobacillus sake LB706 Lactobacillus sake LTH 674 Lactobacillus acidophilus Carnobacterium piscicola LV 17A Carnobacterium piscicola LV17B Carnobacterium piscicola LV17B Bacillus cereus Bc7 Thiolbiotics Lactococcin B 5,3 47 Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4 Non Sistein Lactococcin A Lactococcin M Lactococcin N Lactococcin Gα Lactococcin Gβ 5,8 4,3 4,4 4,3 4, Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4, Lac. lactis subsp cremoris LMG 2130 Lac. lactis subsp lactis bv diacetylactic WM4 Lac. lactis subsp cremoris 9 B4 Lac. lactis subsp cremoris 9 44 Lac. lactis subsp lactis LMG 2081 Lac. lactis subsp lactis LMG 2081 (Suparjo,2008)

37 2.6.3 Mekanisme Kerja Bakteriosin Usmiati (2009) menyebutkan bahwa target utama bakteriosin adalah membran sitoplasma sel bakteri karena reaksi awal bakteriosin adalah merusak permeabilitas membran dengan membentuk pori pada membrane sel dan menghilangkan gaya gerak proton (proton motive force (PMF)). Gaya gerak proton merupakan gradien elektrokimia membran sitoplasma yang mengatur sintesis dan penimbunan ATP. Kegagalan gaya gerak proton menyebabkan kematian sel melalui penghentian semua reaksi yang membutuhkan energi, biosintsesis protein atau asam nukleat (Suparjo, 2008). Pembentukan pori pada membran sel menyebabkan destabilitas membran sehingga dapat mengganggu kesetimbangan ADP/ATP intraseluler akibat kebocoran pospat anorganik, mengurangi daya gerak proton dan jumlah kation bivalensi ( Mg 2+ atau Ca 2+ ) yang menyebabkan penetralan muatan negatif fosfolipid dan memungkinkan perembesan ion ( K + dan Mg 2+ ), asam amino dan ATP (Suparjo, 2008). Aktivitas penghambatan bakteriosin membutuhkan reseptor spesifik permukaan sel. Lipid membran sitoplasma yang bermuatan negatif merupakan reseptor utama bakteriosin dalam proses pembentukan pori. Interaksi elektrostatik bakteriosin yang bermuatan positif yang bersifat hidrofobik dengan gugus fosfat bermuatan negatif pada membran sel target merupakan tahap awal pengikatan bakteriosin dengan membran target. Bagian hidrofobik bakteriosin masuk ke dalam membran

38 membentuk pori. Konduktivitas dan stabilitas pori pada bakteriosin lantibiotik ditingkatkan melaui pengikatan molekul (molecule docking) sedangkan pada bakteriosi kelas II, reseptor membran target bekerja terhadap spesifikasi tertentu (Suparjo, 2008). Proses pembentukan pori pada membran fosfolipid oleh peptida membran aktif umumnya terjadi melalui dua mekanisme yaitu metode tong kayu (barrel-stave model) dan model baji atau karpet (wedge model or carpet model) (Gambar 1). Pada model tong, peptida menghadap hampir tegak lurus terhadap membran, kemudian masuk dan membuat saluran ion sepanjang membran diikuti dengan pengikatan monomer tambahan membentuk pori. Pada model karpet, peptida berikatan dengan permukaan membran, jika konsentrasi ambang batas monomer peptida tercapai, membran ditembus dan pori sementara terbentuk (Zhao,2003). Gambar 1. Model Pembentukan Pori pada Membran, Barrel-Stave dan Carpet Model (Zhao, 2003).

39 2.6.4 Imunitas Bakteri Penghasil Bakteriosin Salah satu perbedaan bakteriosin dengan antibiotik adalah adanya mekanisme perlindungan bakteri penghasil terhadap kerja bakteriosinnya. Perlindungan pada bekteriosin lantibiotic dapat dimediasi melalui protein imunitas, LanI dan lanfeg. Terdapat dua sistem yang bekerja secara sinergis untuk melindungi sel penghasil dari bakteriosinnya sendiri. LanI, yang sebagian besar berikatan pada sisi luar membran sitoplasma, memberikan imunitas dengan mencegah pembentukan pori oleh bakteriosin. LanFEG bekerja melalui pengangkutan molekul bakteriosin yang telah masuk ke dalam membran kembali ke medium sekeliling dan menjaga konsentrasi dalam membran di bawah tingkat kritis (Suparjo, 2008). Protein imunitas bakteriosin non-lantibiotics disandikan oleh suatu gen yang terdapat pada bagian hilir gen bakteriosin, kecuali gen imunitas bakteriosin kelas IIc. Sistem imunitas bakteriosin sejauh ini belum berhasil dijabarkan semuanya kecuali LciA, protein imunitas Lactococcin A (Gambar 2). LciA dapat mencegah aksi Lactococcin A dengan mengikat kemudian menetralisir bakteriosin atau dengan berinteraksi dan merintangi reseptor bakteriosin. Melalui interaksi Lactococcin A- reseptor dalam LciA menjangkau kedalam membran sitoplasma. Ujung C protein imunitas berada di luar sel sedangkan ujung N berada didalam sitoplasma. Dengan mengikat reseptor, LciA

40 mencegah lactococcin A masuk ke dalam membran tetapi ikatan lactococcin A pada reseptor tetap terjadi (Suparjo, 2008). Gambar 2. Model Mekanisme Kerja Protein Imunitas (Suparjo, 2008)

41 III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Molekuler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung. Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2010 hingga Juli B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain tabung reaksi, cawan petri dengan diameter 15 cm dan 30 cm, erlenmeyer ukuran 500 ml, 250 ml, 100 ml dan 50 ml, gelas ukur, ose, spatula, bunsen, vortex mixer, neraca analitik, kompor listrik, autoklaf, laminar air flow, inkubator dengan suhu 37 o C, inkubator shaker, piranti elektroforesis protein (Mini Protean Tetra Cell Biorad, USA), mikrotube, tip, mikropipet, ph meter, syringe, pipet tetes, sarung tangan dan peralatan lainnya. Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, dan Lactobacillus L3 yang diperoleh dari penelitian sebelumnya serta isolat Lactobacillus L4 yang diperoleh dari hasil isolasi terbaru dari tempoyak dengan ciri-ciri bentuk batang, gram positif, katalase negatif dan motil, biakan Escherchia coli, Staphylococcus aures, Bacillus substilis, dan

42 Salmonella paratyphii yang diperoleh dari koleksi biakan Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Unila, media deman Rogosa and Sharpe (MRS) Broth, media Nutrient Broth (NB), bacteriological agar, akuades, akubides, alumunium foil, kasa dan kapas. C. Metode Penelitian Penentuan karakterisasi jenis antibakteri dilakukan dua tahapan yaitu penentuan asam organik dan protein sebagai senyawa antibakteri. Untuk mengkarakterisasi senyawa asam organik yaitu dengan mengukur ph media kultur sampai hari kelima fermentasi. Terjadinya penurunan ph menunjukkan terbentuknya asam, maka akan dilanjutkan dengan menghitung total asam yang dihasilkan oleh isolat Lactobacillus melalui titrasi dengan 0,1 N NaOH. Perlakuan disusun dalam faktorial dengan rancangan acak kelompok lengkap (RAKL) dengan 2 kali pengulangan. Faktor pertama adalah jenis isolat bakteri Lactobacillus, yakni L1, L2, L3 dan L4. Faktor kedua adalah lama produksi senyawa antibakteri dari isolat Lactobacillus, yakni hari ke-1, ke-2, ke-3, ke-4 dan ke-5. Variabel yang diamati yaitu perubahan ph dan total asam yang dihasilkan oleh keempat isolat Lactobacillus. Data yang diperoleh diuji dengan analisis ragam. Adanya perbedaan nyata (p<0.01), maka dilanjutkan dengan uji Polynomial Ortogonal. Karakterisasi protein antibakteri dilakukan secara observasi. Karakterisasi protein antibakteri ditentukan dengan menetralkan supernatant kemudian diuji dengan metode difusi sumuran terhadap bakteri uji yaitu E.coli, Sa.

43 paratyphii, B. substilis dan St aureus. Jika terbentuk zona jernih diduga zat antibakteri dapat berupa protein, maka dilanjutkan dengan menetukan berat molekul protein yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan teknik Sodium Dodecyl Sulfat Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE).. D. Prosedur Kerja 1. Peremajaan Bakteri Isolat bakteri Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 dibiakkan dengan cara digores pada media MRS agar miring, sedangkan untuk bakteri uji dibiakkan dengan cara digores pada media NA miring. 2. Produksi Senyawa Antibakteri Media produksi antibakteri disiapkan dengan komposisi MRS cair ditambah 3 % glukosa (ph 6,2 ± 0,2). Masing-masing isolat Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 diinokulasikan ke dalam lima erlenmeyer yang berisi 20 ml media produksi. Setiap erlemeyer diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 o C sesuai dengan lama produksi yaitu 1 hari, 2 hari, 3 hari, 4 hari dan 5 hari. Setiap hari kultur dideteksi karakteristik senyawa antibakteri hingga hari ke-5 fermentasi.

44 3. Karakterisasi Antibakteri Berupa Asam Organik Asam organik dapat dideteksi melalui penurunan ph media kultur dan dilanjutkan dengan mengukur total asam yang dihasilkan Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4. Media kultur diambil sebanyak 5 ml secara aseptis dan diukur ph media dengan menggunakan ph meter. Kemudian 5 ml kultur tersebut ditambahkan sebanyak 10 ml aquades netral dan dititrasi dengan 0,1 N NaOH hingga larutan menjadi netral. Total asam dapat dihitung dengan menggunakan persamaan berikut : Total Asam = Jumlah NaOH x Normalitas NaOH x BM asam laktat Jumlah Bahan Keterangan : Jumlah NaOH = volume NaOH yang dibutuhkan untuk menetralkan media. Normalitas NaOH = 0,1 N Jumlah Bahan = 5 ml BM asam laktat = Uji Daya Antibakteri Setelah Lactobacillus L1, Lactobacillus L2, Lactobacillus L3 dan Lactobacillus L4 diinkubasi selama lima hari pada media kultur, media tersebut diambil sebanyak 2 ml. Untuk memisahkan zat antibakteri

45 dengan sel penghasil maka kultur disentrifuge dengan kecepatan rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak antibakteri yang diduga mengandung asam organik dan protein penghambat. Untuk menghilangkan pengaruh aktivitas asam organik di dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji maka supernatan dinetralkan dengan menggunakan 1 N NaOH. Larutan tersebut digunakan untuk uji daya hambat terhadap bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan, yakni E.coli, Sa.paratyphii, B. substilis, dan St. aureus. Bakteri uji diinokulasi sebanyak 1 ose ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml aquades steril sampai diperoleh kekeruhan yang sama dengan Standar Mac Farlan ( 3 x 10 8 CFU/mL ). Kemudian sebanyak 1 ml bakteri uji dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan ditambahkan 25 ml media NA steril. Supaya bakteri menyebar rata pada media maka cawan petri diputar sesuai angka 8 sebelum media NA memadat. Setelah media memadat, di dalam media dibuat lubang membentuk sumur dengan diameter 1 cm. Sebelum larutan antibakteri dimasukkan ke sumur, bagian bawah cawan petri dibuat 3 garis yang saling bersilangan dan pusat sumur sebagai titik persilangan tiga garis tersebut ( gambar 3). Setelah itu, larutan antibakteri dimasukkan ke dalam sumur sebanyak 100 µl. Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kemudian diukur diameter zona bening yang dihasilkan sesuai dengan garis yang telah dibuat.

46 Gambar 3. Bentuk sumur dilihat dari bagian bawah cawan petri 5. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyakrilamide Gel Elektoforesis (SDS-PAGE) dan Identifikasi Aktivitas Pita Protein Masing-masing supernatan antibakteri yang akan diindentifikasi dicampur dengan 5 x buffer sampel (lampiran) di dalam mikrotube. Supaya tercampur dengan rata, campuran tersebut disentrifuge dengan kecepatan rpm selama 10 detik. Elektroforesis protein menggunakan gel pemisah ( 8 % polyakrilamide) dan gel penahan (4 % polyakrilamide) (tabel 3). Setelah gel dipasang pada perangkat elektroforesis, 500 ml 5 x buffer elektroforesis ph 8,3 dituangkan ke dalam chamber. Sebanyak 20 µl campuran sampel tersebut dimasukkan ke dalam gel penahan, dan untuk standar sebanyak 2 µl ke dalam sumur gel penahan. Tabel 3. Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan Komposisi 8 % Gel Pemisah (ml) 4 % Gel Penahan (ml) Akuades 4,80 1,54 1,5 M buffer tris-hcl ph 8,8 2,55 - +SDS 0,5 M buffer tris-hcl ph 6,8-0,65 30 % akrilamide 2,66 0,67

47 10 % APS 0,10 0,05 TEMED 0,01 0,01 Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 100 volt 50 ma selama 1-2 jam hingga migrasi bromo fenol biru berada dibagian bawah gel pemisah. Gel elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromo fenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Gel untuk mengetahui berat molekul protein diwarnai dengan pewarnaan perak nitrat (AgNO 3 ). Dalam pewarnaan perak nitrat, mula-mula gel direndam dalam larutan fiksasi selama 1 jam hingga semalam dengan diinkubasi bergoyang kecepatan rpm. Kemudian gel tetap dalam keadaan bergoyang di rendam 50 % etanol selama 20 menit. Setelah itu, gel tersebut direndam sebanyak dua kali di larutan 30 % etanol (masing-masing selama 20 menit). Selanjutnya gel direndam dalam larutan enhancer selama 1 menit. Kemudian gel tersebut dicuci tiga kali dalam akuabides masing-masing 20 detik. Setelah dicuci, gel direndam dalam larutan perak nitrat selama 30 menit. Untuk memunculkan pita protein, gel direndam dengan larutan natrium karbonat selama 3-5 menit sampai muncul pita protein. Untuk menghentikan munculnya pita protein tersebut, gel direndam dengan larutan fiksasi. Agar gel tidak menyusut ketika dalam penyimpanan, maka gel direndam pada akuades selama semalam. Setelah itu, pita protein yang muncul diukur jarak migrasinya. Berat molekul protein diukur dengan menggunakan standar berat molekul rendah, yaitu fosforilase b (otot kelinci) 94 kda, albumin (serum bovin) 67 kda, ovalbumin (putih telur) 45 kda, karbonat anhidrase (eritrosin bovin) 30

48 kda, tripsin inhibitor (kedelai) 20,1 kda, dan α-laktal-bumin (susu bovin) 14,4 kda. Gel untuk identifikasi pita protein penghambat kemudian direnaturasi untuk menghilangkan SDS sesuai dengan Osmanagaoglu et all (1998). Mula-mula gel direndam dalam larutan 20 % isopropanol selama 1 jam dan dilanjutkan pada larutan 10 % asam asetat. Kemudian gel direndam akuabides selama semalam dalam shaker dengan kecepatan rpm untuk menghilangkan pengaruh dari isopropanol dan asam asetat. Untuk mengetahui daya hambat masing-masing protein penghambat, gel diletakkan di atas media NA yang telah mengandung bakteri uji yang paling sensitif terhadap protein penghambat (disesuaikan dari hasil uji supernatan antibakteri yang dinetralkan). Media tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Di sekitar pita protein penghambat akan bebas dari bakteri uji.