KOMPARASI RESPON FISIOLOGI TANAMAN KEDELAI YANG MENDAPAT CEKAMAN KEKERINGAN DAN PERLAKUAN HERBISIDA PARAQUAT VIOLITA

Transkripsi

1 KOMPARASI RESPON FISIOLOGI TANAMAN KEDELAI YANG MENDAPAT CEKAMAN KEKERINGAN DAN PERLAKUAN HERBISIDA PARAQUAT VIOLITA SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 27 i

2 ABSTRAK VIOLITA. Komparasi respon fisiologi tanaman kedelai yang mendapat cekaman kekeringan dan perlakuan herbisida paraquat. Dibimbing oleh HAMIM dan SOEKISMAN TJITROSEMITO. Telah dilakukan penelitian tentang respon fisiologi tanaman kedelai yang mendapat cekaman kekeringan dan herbisida paraquat pada 3 kedelai budidaya (Glycine max L.), kedelai liar (G. Tomentella) dan jagung. Media tanam berupa campuran tanah dan pasir (1:1, v/v) pada pot seberat 8 kg di rumah kaca. Perlakuan kekeringan diberikan dengan membiarkan tanaman tanpa air selama 12 hari untuk kedelai budidaya dan jagung, dan 22 hari untuk G. Tomentella, sementara perlakuan paraquat diberikan dengan penyemprotan pada daun tanaman dosis 9 g ai/ha. Pengamatan dilakukan pada Kadar Air Media (KAM), Kadar Air Relatif (KAR), tinggi tajuk, panjang akar, bobot tajuk, bobot akar, laju fotosintesis (Pn), laju transpirasi (E), malondialdehid (MDA), aktivitas enzim antioksidan, asam askorbat (ASA) dan kandungan prolin daun. Perlakuan cekaman kekeringan mengakibatkan penurunan KAM dan KAR tanaman. Walaupun tidak mempengaruhi tinggi tajuk dan panjang akar, pada umumnya cekaman kekeringan akan mengakibatkan penurunan bobot kering tanaman dan produksi biji. Selain itu perlakuan kekeringan mengakibatkan penurunan Pn dan E, dan peningkatan kandungan MDA pada semua tanaman. Namun kandungan MDA jagung tidak menunjukkan peningkatan berarti dengan semakin lamanya kekeringan. Aktivitas enzim antioksidan umumnya meningkat sampai 1 hari setelah perlakuan (HSP) kekeringan, dan kemudian menurun ketika KAR daun mengalami penurunan dibawah 5% (12 HSP kekeringan). Kandungan ASA daun terjadi peningkatan sampai hari ke-1 (Tidar) dan hari ke- 12 (Panderman dan jagung), namun tidak terjadi peningkatan ASA pada G. Tomentella dan Burangrang. Adapun kandungan prolin kedelai meningkat tajam ketika tanaman mengalami stres berat (12 HSP kekeringan). Namun pada jagung tidak terjadi peningkatan yang berarti sampai hari terakir perlakuan kekeringan. Pada perlakuan herbisida paraquat, tanaman juga mengalami penurunan KAR, E, dan Pn, dan peningkatan kandungan MDA serta aktivitas enzim antioksidan. Berbeda halnya dengan cekaman kekeringan, perlakuan PQ tidak menyebabkan peningkatan kandungan ASA daun yang berarti pada semua tanaman. Begitu juga dengan kandungan prolin, perlakuan PQ tidak mengakibatkan kenaikan kandungan prolin daun. Hal ini mengindikasikan bahwa prolin mungkin merupakan senyawa yang spesifik terhadap stres kekeringan dan bukan senyawa yang spesifik untuk stres oksidatif. ii

3 ABSTRACT VIOLITA. Comparison of physiological response of soybean to drought and paraquat application. Under the direction of HAMIM and SOEKISMAN TJITROSEMITO. Physiological responses of plant to drought and paraquat herbicide (PQ) application were observed on 3 cultivated soybeans (Glycine max L.), wild soybean (G. tomentella) and maize. Plants were grown in 8 kg pot containing soil and sand (1:1, v/v) in the greenhouse. Drought stress was provided by withholding water for 12 days for cultivated soybean and maize, and 22 days for G. tomentella, while PQ was applied by once spray using 9 g ai/ha. Observation was carried out by measuring media water content (MWC), plant growth, dry weight, relative water content (RWC), photosynthesis (Pn), transpiration (E), malondyaldehid (MDA) antioxidant enzymes activity, ascorbic acid (ASA) and prolin content. Drought stress caused decrease of MWC and RWC, but generally did not influence plant growth. Meanwhile drought stress caused decrease of plant dry weight and seed production. Reduction of RWC due to drought caused decrease of Pn, E, and increase of MDA content of all the plants. However, MDA content of maize did not significantly increase due to drought. Antioxidant enzyme activities generally increased in response to drought until 1 days of the treatment, and then decreased when leaf RWC dropped below 5% (12 days after drought stressed). ASA as an antioksidant, generally increase until 1 days after drought treatment (Tidar) and 12 days after drought treatment (Panderman and maize), but it was not significantly different to Burangrang and G. tomentella. In soybean prolin content increased dramatically when the drought was getting severe. On the other hand, it was not increased significantly on maize. In accordance to drought stressed, PQ treatment also caused decrease of leaf RWC, E, and Pn, while it coused increase of MDA content and antioxidant enzyme activities. There was no effect of PQ on ASA content for all the plant. Paraquat did not also affect prolin content which is indication that prolin might be a specific substance to drought stressed, not to oxidative stress. iii

4 Hak cipta milik IPB tahun 27 Hak cipta dilindungi undag-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB. iv

5 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang berjudul Komparasi Respon Fisiologi Tanaman Kedelai yang Mendapat Cekaman Kekeringan dan Perlakuan Herbisida Paraquat, adalah hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis. Bogor, Agustus 27 Violita G v

6 KOMPARASI RESPON FISIOLOGI TANAMAN KEDELAI YANG MENDAPAT CEKAMAN KEKERINGAN DAN PERLAKUAN HERBISIDA PARAQUAT VIOLITA Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Departemen Biologi SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 27 vi

7 Judul Tesis : Komparasi Respon Fisiologi Tanaman Kedelai yang Mendapat Cekaman Kekeringan dan Perlakuan Herbisida Paraquat Nama : Violita NRP : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Hamim, M.Si. Ketua Dr. Soekisman Tjitrosemito, M.Sc. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB Dr. Ir. Dedy Duryadi, DEA. Prof. Dr. Ir.Khairil Anwar Notodiputro, MS Tanggal ujian: 23 Agustus 27 Tanggal lulus: vii

8 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas limpahan belas kasih, kemudahan dan petunjuk-nya semata, penulis dapat menyelesaikan Tesis ini. Tesis ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Biologi Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr. Ir. Hamim, M.Si dan Bapak Dr. Soekisman Tjitrosemito, M.Sc selaku dosen pembimbing atas bimbingan dan arahan yang diberikan. Penghargaan penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Dedy Duryadi, DEA selaku ketua Program Studi Biologi, Sekolah Pasca Sarjana (SPS) IPB, Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, MS selaku penguji dari Departemen Agronomi dan Hortikultura. Terima kasih kepada Departemen Geofisika dan Meteorologi IPB atas bantuannya dalam penggunaan alat fotosintesis. Terima kasih juga kepada kepala Laboratorium Mikrobiologi Lingkungan LIPI atas arahannya dalam analisis enzim, dan juga kepada Pusat penelitian Sumber daya Hayati dan Bioteknologi IPB. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Papa, Mama, Mak etek, Da Pong atas do a, kasih sayang dan pengertiannya. Selain itu penulis juga mengucapkan terima kasih pada Adisti, Jovany, Bu Dewi, Ina, Ninda, Ela, Rina, Rina 39, atas diskusi dan sarannya dan juga pada Hasep dan Yusi atas bantuannya serta kepada teman-teman di Program Studi Biologi SPS IPB. Penulis juga mengucapkan terima kasih pada Mba Een, Mba Agustina atas saran dan nasehatnya. Ucapan terima kasih pada semua pihak yang telah membantu sehingga dapat terselesaikannya tesis ini. Sebagai penutup, penulis mengharapkan semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 27 Violita viii

9 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Payakumbuh pada tanggal 4 Juli 1981 dari ayah Azwin, S.Sos dan ibu Hildarnis. Penulis merupakan puteri kedua dari tiga bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Biologi Universitas Andalas Padang, lulus pada tahun 23 dengan predikat dengan pujian. Pada tahun 25 penulis diterima sebagai mahasiswa Pasca Sarjana Program Studi Biologi IPB. ix

10 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... xi xiii PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan... 4 Hipotesis... 4 TINJAUAN PUSTAKA Peranan Air bagi Pertumbuhan Tanaman... 5 Cekaman Kekeringan pada Tanaman... 6 Efek Kekeringan terhadap Fotosintesis... 7 Cekaman Oksidatif... 9 Penyelamatan dari ROS Penghambatan Fotosintesis oleh Herbisida BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Rancangan Percobaan Pelaksanaan HASIL DAN PEMBAHASAN Kandungan Air Media (KAM) Kandungan Air Relatif (KAR) Pertumbuhan Tanaman Produksi Tanaman Morfologi Daun Tanaman yang Mendapat Perlakuan Hebisida Paraquat 33 Laju Transpirasi Laju Fotosintesis Peroksidasi Lipid Aktivitas Enzim Antioksidan Kandungan Asam Askorbat (ASA) Kandungan Prolin KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan... 6 Saran... 6 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN x

11 DAFTAR TABEL Teks Halaman 1. Rasio bobot akar/bobot tajuk pada tanaman kedelai dan jagung setelah 12 hari perlakuan kekeringan Lampiran Halaman 1. Bahan-bahan pengukuran fotosintesis, analisis enzim antioksidan, asam askorbat dan prolin ANOVA dari pertumbuhan tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari produksi tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari Kadar Air Media (KAM) pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari Kadar Air Relatif (KAR) tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari laju transpirasi tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari laju fotosintesis tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari peroksidasi lipid tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari aktivitas glutation reduktase tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari aktivitas supeoksida dismutase tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari aktivitas askorbat peroksidase tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari kandungan asam askorbat tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan ANOVA dari kandungan prolin tanaman pada perlakuan cekaman kekeringan... 9 xi

12 14. ANOVA dari laju transpirasi tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari laju fotosintesis tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari laju peroksidasi lipid tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari aktivitas glutation reduktase tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari aktivitas superoksida dismutase tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari aktivitas askorbat peroksidase tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari kandungan asam askorbat tanaman pada perlakuan herbisida paraquat ANOVA dari kandungan prolin tanaman pada perlakuan herbisida paraquat xii

13 DAFTAR GAMBAR Halaman 22. Mekanisme pembentukan ROS Produksi ROS pada transport elektron fotosintesis pada kondisi cahaya tinggi Metabolisme redok asam askorbat Siklus askorbat-glutation Skema penghambatan transport elektron fotosintesis oleh herbisida paraquat dan DCMU Struktur kimia paraquat Kandungan Air Media (%) pada sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Kandungan air relatif (%) kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Kandungan air relatif (%) daun dari, 4 jam, 1 hari sampai 5 HSP herbisida paraquat Tinggi tajuk (a) dan panjang akar (b) 12 HSP kekeringan Bobot kering tajuk (a) dan bobot kering akar (b) 12 HSP kekeringan Jumlah biji per tanaman pada perlakuan kontrol dan kekeringan Bobot kering biji per tanaman pada perlakuan kontrol dan kekeringan Daun jagung (kiri) dan kedelai (kanan) 1 HSP herbisida paraquat Laju transpirasi (E) kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Laju transpirasi (E) dari, 4 jam, 1 hari sampai 5 HSP herbisida paraquat Laju fotosintesis (Pn) kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Laju fotosintesis (Pn) pada, 4 jam, 1 hari sampai 5 HSP paraquat xiii

14 4. Kandungan MDA kedelai dan jagung, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Kandungan MDA kedelai dan jagung pada, 1, 3 dan 5 HSP herbisida paraquat Aktivitas GR kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Aktivitas GR kedelai dan jagung pada, 1, 3 dan 5 HSP herbisida paraquat Aktivitas SOD kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Aktivitas SOD kedelai dan jagung pada, 1, 3 dan 5 HSP herbisida paraquat Aktivitas APX kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Aktivitas APX kedelai dan jagung pada, 1, 3, dan 5 HSP herbisida paraquat Kandungan ASA daun kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Kandungan ASA daun kedelai dan jagung pada, 1, 3, dan 5 HSP herbisida paraquat Konsentrasi prolin kedelai dan jagung pada, sampai 12 HSP kekeringan dan recovery Konsentrasi prolin kedelai dan jagung, 1, 3, dan 5 HSP herbisida paraquat xiv

15 xv

16 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, MS. xvi

17 PENDAHULUAN Latar Belakang Kedelai (Glycine max (L.) Merr.) merupakan tanaman kacang-kacangan yang digunakan sebagai bahan baku makanan tradisional seperti tempe, tahu dan kecap yang menjadi sumber protein nabati utama bagi sebagian besar penduduk Indonesia. Namun produktifitas kedelai nasional relatif rendah, yaitu hanya 1,2 ton/ha jika dibandingkan dengan produktifitas Cina yang sebesar 1,7 ton/ha dan Amerika Serikat yang sebesar 2,5 ton/ha (Agroindonesia 21). Jumlah penduduk Indonesia yang sebesar 216 juta jiwa saat ini membutuhkan kedelai sekurangkurangnya 3, juta ton per tahun, sementara itu produktifitas kedelai di Indonesia semakin menurun. Sejak tahun 2, kondisi tersebut semakin parah, dimana impor kedelai semakin besar, yaitu sekitar 7% dari kebutuhan kedelai penduduk Indonesia (Hutapea dan Zum 24). Kendala utama dalam peningkatan produksi kedelai di lapangan salah satunya adalah kondisi cekaman kekeringan (Darman 2). Kondisi ini semakin sulit karena Indonesia memiliki lahan kering yang cukup luas dibandingkan dengan lahan yang berpengairan. Faktor kekeringan diketahui merupakan faktor lingkungan utama yang akan menghambat pertumbuhan tanaman dan menurunkan produksi. Purwanto (23) telah melakukan penelitian tentang aktivitas fotosintesis kedelai akibat cekaman kekeringan. Pada penelitian tersebut didapatkan bahwa (1) fotosintesis, transpirasi dan daya hantar stomata menurun dengan semakin lamanya perlakuan kekeringan dan (2) tanaman dalam kondisi cekaman kekeringan memiliki luas daun dan rasio berat daun yang lebih rendah dibanding dengan yang tidak mengalami cekaman. Jusuf et al. (1993) telah melakukan penelitian tentang aspek toleransi tanaman kedelai terhadap cekaman kekeringan dengan mengevaluasi 75 plasma nutfah. Berdasarkan penelitian tersebut diperoleh 2 genotipe toleran, yang dilanjutkan dengan identifikasi morfologi dan fisiologi oleh Hamim (1995) dan Sopandie et al. (1996). Melalui identifikasi tersebut diketahui bahwa tanaman kedelai pada kondisi cekaman kekeringan mengalami penurunan potensial osmotik dan peningkatan akumulasi prolin. Galur-galur tersebut merupakan 1

18 materi yang baik untuk mempelajari mekanisme adaptasi tanaman terhadap cekaman kekeringan. Hamim (24) menyatakan bahwa pada tahap awal, kekeringan menyebabkan berkurangnya pembukaan stomata untuk meminimalisir kehilangan air di bawah kondisi cahaya berlebihan. Peristiwa ini mengakibatkan terjadinya penurunan konsentrasi CO 2 intrasel, sehingga tanaman mengalami overreduksi pada transfer elektron fotosintesis (Berkowitz 1998). Overreduksi ini terjadi karena pembentukan NADPH pada reaksi terang tidak diimbangi oleh pemakaian NADPH pada reaksi gelap karena penurunan konsentrasi CO 2 intrasel. Hal ini mengakibatkan terbentuknya reactive oxygen species (ROS) yang diawali dengan pengikatan elektron pada transpor elektron fotosintesis oleh oksigen. Proses selanjutnya akan terbentuk berbagai bentuk senyawa ROS seperti; superoksida (O - 2 ), singlet oksigen ( O 2 ), radikal hidroksil (OH) dan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) (Mckersie and Leshem, 1994). Senyawa ROS ini akan dapat menimbulkan kerusakan pada tanaman (Aroca et al. 21). Jika hal ini dibiarkan, maka lama kelamaan tanaman akan mati (Apel and Hirt 24). Disisi lain ROS juga dapat diinduksi pada tanaman dengan adanya senyawa herbisida, yang salah satunya adalah herbisida paraquat. Herbisida paraquat ini akan dapat mengambil elektron pada transfer elektron fotosintesis pada pusat reaksi fotosistem I. Herbisida paraquat memiliki afinitas tinggi terhadap elektron, sehingga dengan mudah akan mengikat elektron fotosintesis. Pada keadaan ini paraquat menjadi tidak stabil dan segera melepaskan elektron tersebut. Elektron ini akan langsung diikat oleh oksigen sehingga terbentuk superoksida (salah satu bentuk ROS) (McKersie and Leshem 1994; Reade and Cobb 22). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Gossett et al. (1996) diperoleh bahwa pemberian paraquat dapat menghambat pertumbuhan tanaman kapas (Gossypium hirsutum L.). Taylor et al. (22) juga menyatakan bahwa perlakuan paraquat dan stres air pada biji kacang kapri (Pisum sativum L.) dapat menginduksi terbentuknya peroksidasi lipid yang akan menghambat kemampuan mitokondria dalam mengoksidasi glysin. Belum diketahui secara jelas apakah 2

19 kerusakan yang ditimbulkan oleh ROS akibat cekaman kekeringan sama dengan yang ditimbulkan oleh herbisida paraquat. Pada kenyataannya, tanaman memiliki mekanisme tertentu untuk mempertahankan diri dari kerusakan ketika terjadi akumulasi ROS diantaranya melalui mekanisme enzimatik (enzim antioksidan) dan non-enzimatik (senyawa antioksidan). Enzim dan senyawa antioksidan ini akan menghambat pembentukan ROS baik pada kondisi cekaman kekeringan (Apel and Hirt 24) maupun pada tanaman yang terkena herbisida paraquat (McKersie dan Leshem 1994). Walaupun demikian masih sedikit informasi yang diperoleh terkait dengan perubahan fisiologi tanaman yang terkena cekaman kekeringan dan herbisida paraquat. Keduanya sama-sama mempengaruhi metabolisme tanaman terutama pada transpor elektron fotosintesis dan dapat menginduksi stres oksidatif. Berdasarkan hal tersebut diperlukan informasi yang cukup tentang komparasi respon fisiologi tanaman kedelai yang mendapat cekaman kekeringan dan perlakuan herbisida paraquat. Hal ini juga diharapkan dapat memberikan informasi tambahan tentang usaha pemuliaan tanaman pada lahan kering di Indonesia. 3

20 Tujuan 1. Melihat respon fotosintesis dan transpirasi kedelai selama perlakuan cekaman kekeringan dan setelah mendapat perlakuan herbisida paraquat. 2. Membandingkan tingkat akumulasi malonialdehid sebagai indikator terbentuknya ROS pada tanaman yang mendapat cekaman kekeringan dan tanaman yang mendapat perlakuan paraquat. 3. Mengamati aktivitas enzim antioksidan dan akumulasi senyawa antioksidan pada tanaman yang mendapat cekaman kekeringan dan perlakuan paraquat. 4. Mengamati akumulasi prolin pada tanaman yang mendapat cekaman kekeringan dan perlakuan paraquat. Hipotesa 1. Terdapat perbedaan respon laju fotosintesis dan laju transpirasi pada perlakuan cekaman kekeringan dan pelakuan paraquat. 2. Perlakuan cekaman kekeringan dan perlakuan herbisida paraquat memberikan pengaruh yang sama dalam menginduksi senyawa ROS. 3. Perkembangan tingkat antioksidan dan aktivitas enzim akan mengalami peningkatan akibat cekaman kekeringan dan perlakuan paraquat. 4. Terdapat perbedaan akumulasi prolin pada tanaman yang mendapat cekaman kekeringan dan pemberian herbisida paraquat. 4

21 TINJAUAN PUSTAKA Peranan Air bagi Pertumbuhan Tanaman Air merupakan komponen utama tanaman, yaitu membentuk 8-9 % bobot segar jaringan yang sedang tumbuh aktif. Air sebagai komponen esensial tanaman memiliki peranan antara lain: (a) sebagai pelarut, di dalamnya terdapat gas, garam, dan zat terlarut lainnya, yang bergerak keluar masuk sel, (b) sebagai pereaksi dalam fotosintesis dan pada berbagai proses hidrolisis, (c) air esensial untuk menjaga turgiditas diantaranya dalam pembesaran sel, pembukaan stomata dan menyangga bentuk daun-daun muda atau struktur lainnya (Levitt 198). Pada keadaan normal tanaman membutuhkan keseimbangan potensial air antara tanah-akar-daun-atmosfer. Keseimbangan ini berarti gradien potensial air antara bagian-bagian tersebut yang memungkinkan tanaman untuk melakukan transpor air dan hara dari akar ke daun. Air akan mengalir dari potensial air tinggi ke potensial air rendah, sehingga potensial air di tanah haruslah lebih tinggi dibandingkan dengan potensial air di akar, daun dan atmosfer yang dipengaruhi oleh proses transpirasi (Taiz and Zeiger 22). Proses transpirasi di daun terutama terjadi pada siang hari. Transpirasi dipengaruhi oleh cahaya matahari. Ketika terjadi proses transpirasi pada tanaman, maka tekanan turgor akan mengalami penurunan. Penurunan ini menyebabkan potensial air di daun lebih rendah dari pada di akar, sehingga akan mempermudah aliran air di xylem dari akar sampai ke daun. Peningkatan aliran air ini dibutuhkan untuk pertumbuhan sel tanaman. Aliran air ke sel akan mengakibatkan perbesaran dan pemanjangan sel, sehingga sel dapat tumbuh (Kramer and Boyer 1995). Pada kondisi lingkungan tertentu tanaman dapat mengalami defisit air. Defisit air berarti terjadi penurunan gradien potensial air antara tanah-akar-daunatmosfer, sehingga laju transpor air dan hara menurun (Taiz and Zeiger 22). Penurunan ini akan mengakibatkan gangguan pada pertumbuhan tanaman, terutama pada jaringan yang sedang tumbuh (Kramer and Boyer 1995). Hal ini biasanya terjadi pada tanah yang kekurangan air, sehingga gradien potensial air di tanah dan akar menurun. Itulah sebabnya tanaman yang tumbuh pada tanah yang kering mengalami hambatan pertumbuhan. 5

22 Cekaman Kekeringan pada Tanaman Cekaman kekeringan akan mengakibatkan rendahnya laju penyerapan air oleh akar tanaman. Ketidakseimbangan antara penyerapan air oleh akar dan kehilangan air akibat transpirasi membuat tanaman menjadi layu. Cekaman kekeringan atau drought stress dapat terjadi karena beberapa hal yaitu: (1) tingginya kecepatan evaporasi yang melebihi persediaan air dari tanah ke akar yang akan mengakibatkan penurunan potensial air, (2) adanya senyawa yang bersifat osmotik, seperti pada tanah garam, yang dapat menurunkan pengambilan air sehingga terjadi penurunan potensial osmosis dan tidak cukupnya pengambilan air oleh tanaman yang diserap dari tanah (Borges 23). Tanaman yang berada pada kondisi cekaman kekeringan akan memberikan respon tertentu baik secara morfologis, anatomis maupun fisiologis. Pada keadaan cekaman kekeringan tersebut terdapat dua mekanisme utama yang mungkin terjadi pada tanaman, yaitu: (a) tanaman berusaha menghindari cekaman, baik dengan cara melakukan perubahan struktur morfologi dan anatomi, maupun dengan meningkatkan efisiensi penggunaaan air dengan cara mengatur laju transpirasi, dan (b) meningkatkan toleransi terhadap cekaman kekeringan melalui perubahan kimia sel, baik dalam bentuk peningkatan akumulasi senyawa terlarut yang berperan sebagai pengatur tekanan osmotik sel (osmotic adjustment), dengan mengakumulasi senyawa kimia seperti; prolin dan gula (Meyer dan Boyer 1981). Cekaman kekeringan dapat menghambat pertumbuhan tanaman. Penghambatan pertumbuhan ini salah satunya dapat dilihat pada perluasan daun. Penurunan luas daun merupakan respon pertama tanaman terhadap kekeringan. Keterbatasan air akan menghambat pemanjangan sel yang secara perlahan akan menghambat pertumbuhan luas daun. Kecilnya luas daun mengakibatkan rendahnya transpirasi, sehingga menurunkan laju suplai air dari akar ke daun. Jika kondisi ini dibiarkan terus menerus, lama kelamaan akan terjadi absisi daun (Taiz and Zeiger 22). Luas daun pada tanaman sangatlah penting karena proses fotosintesis terjadi di kloroplas daun, dan fotosintesis merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi proses pertumbuhan tanaman. 6

23 Efek Kekeringan terhadap Fotosintesis Penurunan potensial air tanaman pada kondisi kekeringan menyebabkan terjadinya penurunan laju fotosintesis. Hal ini terjadi karena adanya hambatan yang ditimbulkan oleh penutupan stomata (stomatal limitation) maupun hambatan akibat penurunan proses biokimia dalam tumbuhan (non-stomatal limitation) (Kalefetoglu dan Ekmekci 25). Hambatan stomata Pada kondisi cekaman kekeringan ringan (moderat) tanaman akan segera mengurangi pembukaan stomata. Penurunan pembukaan stomata ini dilakukan untuk meminimalisir kehilangan air yang berlebihan. Dengan terjadinya penurunan pembukaan stomata, maka konsentrasi CO 2 daun akan menurun sehingga dengan sendirinya proses fotosintesis juga akan menurun (Flexas and Medrano 22). Comstock (22) menambahkan bahwa pengaturan konduktan stomata berkaitan dengan signal hidrolik (hydraulic signaling) dan signal kimia (chemichal signaling). Ketika tumbuhan mengalami kondisi cekaman kekeringan, terjadi perubahan potensial air pada tanaman. Pada keadaan ini terjadi penurunan gradien potensial air antara akar dan tanah, sehingga laju penyerapan air oleh akar menurun. Penurunan laju penyerapan air ini dan ditambah dengan peningkatan transpirasi akibat radiasi matahari membuat tanaman mengalami kekurangan air (Levitt 198). Gradien potensial air akan menimbulkan hydraulic signaling terhadap konduktansi stomata sebagai respon tanaman terhadap cekaman kekeringan sehingga stomata menutup (Comstock 22). Chemical signalling berkaitan dengan terjadinya peningkatan konsentrasi asam absisat (ABA) pada akar tumbuhan. Ketika cekaman kekeringan terdapat bukti bahwa terjadi peningkatan sintesis ABA pada akar tanaman sebagai respon terhadap keadaan defisit air tanah. Peningkatan ABA ini terkait dengan status air akar tanaman. Proses selanjutnya ABA akan ditranspor melalui xylem terus ke daun. Selain di akar, tanaman juga mensintesis ABA di daun, sehingga terjadi peningkatan ABA di daun (Srivastava 22). Pada kondisi ini protein channel K out di sel penjaga daun akan diaktifkan oleh keberadaan ABA dan protein chanel K in 7

24 akan dihambat oleh ABA, sehingga banyak ion K + yang keluar dari sel penjaga. Kondisi ini akan menurunkan potensial osmotik sel penjaga sehingga stomata menutup (Roberts dan Snowman 2). Proses pensignalan oleh ABA dari akar ke daun ini dikenal dengan istilah long-distance chemichal signaling (Comstock 22). Kehilangan ion ataupun larutan pada sel penjaga dapat disebabkan oleh penurunan kandungan air daun, dan ABA memegang peranan penting dalam proses ini. ABA disintesis secara lambat terus menerus di sel mesofil dan terakumulasi di kloroplas. Ketika mesofil terdehidrasi, maka ada dua hal yang akan terjadi yaitu: 1. Beberapa ABA yang disimpan di kloroplas akan dilepas ke apoplas (permukaan dinding sel) sel mesofil. Redistribusi ABA ini bergantung kepada gradien ph pada daun, keasaman properti molekul ABA dan permeabilitas membran sel. Redistribusi ABA memungkinkan aliran transpirasi untuk membawa beberapa ABA ke sel penjaga. 2. ABA disintesis dengan kecepatan tinggi di akar mengakibatkan lebih banyak ABA yang diakumulasi pada apoplas daun (Taiz and Zeiger 22). Menurut Lizana et al. (26), ABA telah diketahui menjadi faktor yang mengatur konduktansi stomata. Hasil penelitian pada dua varietas Phaseolus vulgaris (Arroz and Orfeo) diperoleh bahwa peningkatan konsentrasi ABA seiring dengan penurunan konduktan stomata dengan semakin lamanya kondisi kekeringan. Hambatan non-stomata Hambatan non-stomata berkaitan dengan proses metabolik yaitu pada proses transpor elektron fotosintesis. Jika kondisi kekeringan terus terjadi maka tanaman akan mengalami penurunan proses metabolik, karena berkurangnya difusi CO 2 ke kloroplas (Chaves and Oliveira 24) yang nantinya akan mengarah kepada penurunan kandungan ribulosa 1,5-biphosphat (RuBP) pada proses fotosintesis (Flexas and Medrano 22). Vu et al. (1987) menambahkan bahwa 8

25 peningkatan stres kekeringan pada kedelai akan menurunkan total aktivitas rubisko. Cekaman kekeringan akan menginduksi terjadinya fotoinhibisi, selanjutnya akan menurunkan kandungan protein D1 pada fotosistem II (PS II) (Pastenes et al. 24). PS II sebagai sistem penangkap cahaya (light harvesting system) memiliki dua fungsi esensial yaitu: (1) menangkap cahaya pada proses fotosintesis, (2) melepas energi tereksitasi apabila terjadi kelebihan energi. Berdasarkan hal tersebut, maka PS II akan merespon signal eksternal dari lingkungan. Hal ini berkaitan dengan peningkatan trans-membran tilakoid ΔpH. Peningkatan trans-membran tilakoid ΔpH ini berfungsi sebagai kontrol balik terhadap kelebihan transpor elektron fotosintesis. Proses ini dikenal dengan nonphotochemical quenching (NPQ) yang bergantung pada siklus xanthophyll dan protein PsbS pada fotosistem (Horton and Ruban 24), sebagai mekanisme pertahanan tanaman terhadap fotoinhibisi (Taiz and Zeiger 22). Cekaman Oksidatif Perubahan lingkungan yang tidak menguntungkan termasuk kekeringan pada tanaman, dapat menyebabkan terbentuknya senyawa oksidatif. Jika kondisi ini dibiarkan, tanaman akan mengalami stres oksidatif. Pembentukan senyawa oksidatif pada tanaman diawali dengan reduksi oksigen pada membran sel kloroplas membentuk superoksida (O - 2 ). Jika hal itu terjadi akan terbentuk reactive oxygen species (ROS) yang meliputi molekul-molekul seperti: superoksida (O - 2 ), singlet oxygen (. O 2 ), radikal hidroksil (OH) dan hydrogen peroksida (H 2 O 2 ) (Blokhina et al. 23). Radikal bebas merupakan molekul yang sangat reaktif sekali, karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dan merupakan molekul yang dapat mengakibatkan kerusakan pada membran (Mckersie and Leshem 1994). Contoh reaksi tersebut adalah: - 2 O Fd red 2 O Fd ox - Molekul O 2 yang reaktif akan berusaha melepaskan elektron bebasnya dan bereaksi dengan H + membentuk H 2 O 2 (1). Proses selanjutnya hidrogen peroksida dan superoksida bereaksi membentuk molekul yang sangat reaktif yaitu radikal hidroksil (2). Selain itu radikal hidroksil bisa dibentuk dengan keberadaan ion besi 9

26 melalui reaksi fenton (3). Keberadaan besi atau ion metal lainnya dapat meningkatkan kerusakan oksidatif (Mckersie and Leshem 1994). Berikut ini adalah skema pembentukan radikal bebas: - O 2 - O O 2 + H + H 2 O 2 + O 2 (1) + H 2 O 2 O 2 + OH. + OH - (2) Fe O 2 Fe 2+ + O 2 Fe 2+ + H 2 O 2 OH. + OH + Fe 3+ (3) Secara keseluruhan, reaksi pembentukan ROS dapat dilihat sebagai berikut: Gambar 1 Mekanisme pembentukan ROS (Apel and Hirt 24) Menurut Mckersie and Leshem (1994) ada beberapa peluang terjadinya pembentukan ROS pada proses fotosintesis 1. Pada PS I dapat terjadi reduksi oksigen melalui reaksi mehler. Reduksi oksigen ini terjadi pada transport elektron feredoksin, reduksi ini terjadi ketika NADP + terbatas yang salah satunya disebabkan oleh berkurangnya penggunaan NADPH untuk fiksasi CO 2 pada siklus kalvin. 2. Pada PS II terjadi oksidasi dengan mentransfer empat single elektron dari H 2 O membentuk triplet atau ground state oksigen. Selain itu alkohol tertentu juga bisa direduksi oleh PS II. 3. Fotoaktifasi dari kloroplas secara normal mentransfer energi ke pusat reaksi PS, namun pada kondisi yang tidak menguntungkan klorofil akan menangkap energi cahaya pada sistem transpor elektron, sehingga dapat mengeksitasi oksigen dari bentuk triplet ke bentuk singlet. 4. Fotorespirasi merupakan lintasan yang paling mudah untuk menghasilkan proses oksigenasi. Walaupun tidak terjadi pengaktifan oksigen di dalam 1

27 kloroplas, namun terjadi subsequent metabolisme glikolat di dalam peroksisom (Gambar 2). Gambar 2 Produksi ROS pada transpor elektron fotosintesis pada kondisi cahaya tinggi (Apel and Hirt 24) Peningkatan ROS dapat menimbulkan kerusakan pada komponenmembran sel. Komponen membran sel tersebut antara lain: lipid (peroksidasi dari asam lemak tidak jenuh pada membran), protein (denaturasi), karbohidrat, dan asam nukleat. Kerusakan membran ini dapat dilihat dari perubahan komposisi dan kandungan lipid, pengaktifan lipid peroksidase dan meningkatnya kebocoran membran (Blokhina et al. 23). Penyelamatan dari ROS Selama proses fotosintesis ROS dibentuk dan dirombak kembali untuk. Pembentukan ROS akan meningkat ketika kondisi lingkungan tidak menguntungkan terus terjadi, namun tanaman mempunyai suatu mekanisme penyelamatan terhadap kondisi tersebut. Mekanisme penyelamatan ini antara lain melalui mekanisme antioksidan baik yang bersifat enzimatik maupun nonenzimatik untuk menghindari kerusakan yang terjadi akibat stres oksidatif. Mekanisme non-enzimatik antioksidasi meliputi senyawa-senyawa antioksidan seperti: asam askorbat (ASA), glutation (GSH), termasuk juga tocopherol, flavonoid, alkaloid dan karotenoid (Apel and Hirt 24). 11

28 ASA atau vitamin C merupakan asam organik dengan kemampuan antioksidan. ASA dapat larut dalam air dan sangat mudah dioksidasi yaitu sebagai senyawa reduktan. ASA akan rusak ketika ditempatkan pada cahaya atau panas yang akan berubah dalam bentuk teroksidasi yaitu asam dehidroaskorbat (Wikipedia 26). Gambar 3 Metabolisme redok asam askorbat (Wikipedia 26). Askorbat memenuhi banyak fungsi penting pada biologi tanaman (Noctor and Foyer 1998). Askorbat juga digunakan sebagai ko-faktor untuk violaxanthin de-epoxidase pada siklus xanthophyll. Proses ini dilibatkan dalam perlindungan pelepasan penyerapan cahaya dalam bentuk panas dan bisa diukur sebagai NPQ dari klorofil fluorescence (Sonja et al. 21). ASA sebagai senyawa antioksidan dapat berinteraksi dengan membran plasma dan mendonorkan elektronnya ke radikal -tocopheroxyl dan aktivitas trans-membran plasma oksidoreduktase. Recycling -tocopheroxyl dapat membantu melindungi membran plasma dari peroksidasi (May 1999). Mekanisme penyelamatan secara enzimatik melibatkan enzim antioksidan antara lain yaitu: superoksida dismutase (SOD); askorbat peroksidase (APX); monodehidroaskorbat reduktase (MDHAR); dehidroaskorbat reduktase (DHAR); glutation reduktase (GR); katalase (CAT) dan glutation peroksidase (GPX), sebagai akibat dari peningkatan radikal bebas di kloroplas (Aroca 2; Becana et 12

29 al. 2; Borsani et al. 21; Jiang and Huang 21; Noctor and Foyer 1998; Sonja et al. 21). Enzim antioksidan seperti SOD, dibutuhkan untuk merubah superoksida menjadi bentuk radikal oksigen (O2) dan H 2 O 2. Hidrogen peroksida ini merupakan oksidan kuat yang dapat mengganggu proses fotosintesis di kloroplas. Keberadaan enzim CAT dapat merubah H 2 O 2 menjadi air dan oksigen Reduksi H 2 O 2 ini membutuhkan senyawa reduktan yaitu ASA. Enzim APX dengan 2 molekul ASA akan mereduksi H 2 O 2 menjadi air dan membentuk MDHA. MDHA memiliki elektron bebas sehingga harus segera direduksi menjadi ASA atau dehidroaskorbat (DHA). DHA reduktase selanjutnya akan mereduksi DHA menjadi ASA. Pada reaksi ini digunakan glutation (GSH) sebagai substrat dan membentuk glutation disulpida (GSSG). GSSG dapat kembali membentuk GSH oleh NADPH yang dikatalisis oleh GR (Noctor and Foyer 1998). Siklus askorbatglutathione dapat dilihat pada Gambar 4. Gambar 4 Siklus askorbat-glutation (Noctor and Foyer 1998) 13

30 Penghambatan Fotosintesis oleh Herbisida Selain kondisi kekeringan, laju transpor elektron fotosintesis juga dapat dihambat oleh beberapa herbisida diantaranya adalah herbisida paraquat dan diklorofenil dimetil urea (DCMU). Herbisida paraquat akan menghambat transpor elektron fotosintesis pada PS I (P7), sedangkan DCMU akan menghambat transpor elektron fotosintesis pada PS II (P68) (Taiz and Zeiger 22). Secara skematik mekanisme penghambatan oleh herbisida paraquat dan DCMU dapat dilihat sebagai berikut: Gambar 5 Skema penghambatan transpor elektron fotosintesis oleh herbisida paraquat dan DCMU (Taiz and Zeiger 22) Paraquat Herbisida paraquat termasuk kelompok herbisida Bipyridylium, yaitu memiliki dua cincin pyridyl. Kelompok herbisida ini dapat merusak jaringan tanaman dengan cepat, yang mengakibatkan tanaman kelihatan terbakar yang mengarah kepada kerusakan membran sel. Herbisida ini termasuk senyawa bermuatan positif, yang akan direduksi oleh fotosintesis untuk membentuk radikal bebas yang relatif tidak stabil. Radikal bebas ini mudah dioksidasi dengan adanya oksigen untuk membentuk kembali ion aslinya dan hidrogen peroksida, yang akan merusak jaringan tanaman. Pada tingkat selular akan menyebabkan pecahnya membran sel dan kloroplas (Chia et al. 1982). Paraquat diaplikasikan melalui daun dan tidak bisa lewat akar, karena struktur kimia paraquat yang bermuatan positif cenderung untuk berikatan dengan tanah yang bermuatan negatif (Mckersie and Leshem 1994). 14

31 Herbisida paraquat merupakan herbisida yang memiliki ikatan elektrolit yang kuat. Paraquat bekerja secara kontak non-selektif dengan cara merebut elektron pada rantai transpor elektron fotosintesis PS I. Pada keadaan ini paraquat menjadi tidak stabil sehingga berusaha untuk melepaskan elektron tersebut. Reaksi ini menghasilkan radikal bipyridyl yang akan bereaksi dengan oksigen membentuk superoksida, proses selanjutnya akan terbentuk hidrogen peroksida dan radikal hidroksil. ROS ini akan menginduksi terjadinya peroksidasi lipid, penurunan laju fotosintesis, dan kehilangan integritas membran (Chia et al. 1982). Gambar 6 Struktur kimia paraquat, 1,1 -dimethyl- 4,4 -bipyridilium ion (diklorid) Kerusakan membran ini terjadi karena reaksi antara radikal bebas yang sangat reaktif berikatan dengan asam lemak pada membran. Asam lemak merupakan bagian dari fosfolipid, komponen utama penyusun membran. Pada bagian ekor fosfolipid ini terdapat ikatan ganda yang akan cenderung diikat oleh molekul reaktif tersebut. Ikatan ini mengakibatkan asam lemak yang semula tidak jenuh, menjadi jenuh. Hal ini akan merubah struktur membran dan menurunkan permeabilitas membran, pada tahap selanjutnya dapat mengakibatkan kebocoran pada membran (Chia et al. 1982). Perlakuan dengan paraquat dapat menurunkan kandungan klorofil dan protein daun sehingga terjadi peningkatan penghambatan fotosintesis tanaman. Perlakuan paraquat tidak mempengaruhi aktivitas rubisko tapi dapat meningkatkan laju fotorespirasi (Popova et al. 23). Gejala kerusakan akibat perlakuan paraquat dapat menimbulkan nekrosis pada daun dan juga menimbulkan bintik-bintik pada jaringan daun. 15

32 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Percobaan dilaksanakan di rumah kaca kampus IPB Baranangsiang, kemudian dilanjutkan di Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Fisiologi Tumbuhan Biologi Fakultas MIPA IPB. Percobaan ini telah dilakukan mulai bulan Agustus 26 sampai Juli 27. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: tanah, pasir, pupuk NPK dan TSP, paraquat Gramoxon 276 g l -1, beberapa varietas benih kedelai, benih jagung, nitrogen cair, kantong kertas, mulsa plastik, aluminium foil, kertas saring, bahan-bahan untuk pengukuran laju fotosintesis, laju transpirasi, peroksidasi lipid, aktivitas enzim antioksidan, kandungan asam askorbat, dan untuk analisis prolin (Tabel lampiran 1). Alat-alat yang dibutuhkan untuk keperluan penanaman adalah: rumah kaca, polybag kapasitas 1 kg (25 cm x 25 cm), gayung, timbangan duduk kapasitas 25 kg, gunting, sprayer. Alat-alat laboratorium yang digunakan adalah: timbangan analitik, oven, cork borer, desikator, petridis, botol kecil, tabung reaksi, mortar, Miracloth, pipet 1 ml, pipet mikro, lampu 2 W (2 buah), lampu 15 W (1 buah), corong, gelas ukur (25 ml dan 5 ml), biuret 5 ml, sarung tangan tahan panas, ph meter, thermometer, tabung nitrogen cair, Photosynthetic Leaf Chamber Analyser tipe LCA-4, freezer -3 C, spektrofotometer, dan sentrifus. Rancangan Percobaan Percobaan dirancang dan dilaksanakan dengan metode rancangan faktorial dalam rancangan acak lengkap dengan 3 ulangan. Sedangkan faktor yang diamati ada dua yaitu : 1. Jenis tanaman : a. Tiga varietas kedelai budidaya yaitu: Tidar (V1), Burangrang (V2), dan Panderman (V3) dan satu kedelai liar yaitu: Glycine tomentella (V4) b. Jagung manis (Z) (tanaman C-4 sebagai pembanding) 16

33 2. Fakor perlakuan tanaman: a. disiram setiap hari (N1) b. tanpa disiram (N2) c. disiram setiap hari dan penyemprotan paraquat (N3) dosis 9 g ai ha -1 (Lampiran 1) Data diolah dengan menggunakan SPSS 13 dengan ANOVA dan uji t-student dengan perbandingan 2 faktor. Pelaksanaan Materi tanaman dan persiapan penanaman Pada percobaan ini digunakan empat varietas kedelai dan satu jagung yang diberi tiga perlakuan. Varietas kedelai budidaya diperoleh dari varietas pilihan pada Balai Penelitian Kacang-kacangan dan Umbi-umbian (Balitkabi) Malang dan varietas kedelai liar diperoleh dari Pusat Penelitian Bioteknologi IPB. Sebelum penanaman, dilakukan persiapan rumah kaca dan media tanam. Media tanam yang digunakan adalah campuran antara tanah dan pasir dengan perbandingan 1:1. Sebelum dicampur, pasir diayak terlebih dahulu, setelah dicampur, dilakukan pengukuran kadar air media pada kondisi kapasitas lapang untuk menentukan jumlah air yang harus ditambahkan pada media. Penanaman dan pemeliharaan Benih ditanam di dalam polybag yang telah disiapkan, sebanyak 2 biji per polybag untuk setiap perlakuan. Pada saat penanaman dilakukan pemupukan dasar dengan menggunakan NPK dan TSP masing-masing 1,67 dan 1,12 g per polybag. Pemupukan juga diberikan pada tanaman sebelum perlakuan yaitu,85 g NPK per polybag. Pemberian perlakuan kekeringan dan pemberian paraquat Setiap varietas tanaman mendapatkan tiga perlakuan, yaitu perlakuan disiram setiap (N1), tanpa disiram (N2), pemberian paraquat (N3). Pemberian perlakuan cekaman kekeringan dilakukan dengan membiarkan tanaman tanpa air selama 12 hari untuk kedelai budidaya dan jagung, dan 22 hari untuk kedelai liar. 17

34 Selama perlakuan, media ditutupi dengan mulsa plastik untuk mengurangi evaporasi. Pemberian paraquat pada tanaman dilakukan dengan cara disemprotkan pada daun tanaman. Sebelum disemprotkan, dilakukan formulasi paraquat dengan cara penambahan air dan surfaktan sehingga larutan menjadi homogen. Pengamatan Pengamatan tanaman dilakukan terhadap panjang akar, tinggi tanaman, bobot kering akar dan tajuk, jumlah dan bobot biji, Kadar Air Media (KAM), Kandungan Air Relatif (KAR), laju fotosintesis, laju transpirasi, peroksidasi lipid, aktivitas enzim antioksidan, kandungan asam askorbat, dan akumulasi prolin. Pengukuran laju fotosintesis, laju transpirasi, dan pengambilan bahan analisis untuk peroksidasi lipid, aktivitas enzim antioksidan, kandungan asam askorbat, dan akumulasi prolin dilakukan pada, 4, 8, 12 hari setelah perlakuan (HSP) kekeringan dan 2 hari setelah rewatering, sedangkan pengukuran panjang akar, tinggi tanaman, bobot kering akar dan tajuk, dilakukan pada saat tanaman berumur 12 HSP. Jumlah dan bobot biji diukur setelah tanaman berproduksi. Pengambilan sampel untuk perlakuan paraquat dilakukan pada hari ke, 1, 3, dan 5 setelah pemberian paraquat. Tinggi tanaman diukur mulai dari permukaan tanah sampai bagian pucuk (untuk tanaman kedelai) dan sampai daun terpanjang (untuk tanaman jagung). Panjang akar diukur mulai dari pangkal akar hingga ujung akar yang paling panjang, sedangkan bobot kering akar dan tajuk diukur secara terpisah dengan menggunakan oven 8 C selama 2 x 24 jam. KAR diukur dengan mengambil sampel daun menggunakan cork borer diameter 1 cm. Sampel daun yang diperoleh ditimbang untuk mendapatkan berat segar (BS), kemudian dilakukan hidrasi selama 24 jam dalam botol kecil untuk mendapatkan berat jenuh (BJ). Sampel selanjutnya di oven pada suhu 8 C selama 24 jam untuk memperoleh berat kering (BK) setelah sebelumnya didinginkan dalam desikator (Barr and Weatherley 1962). KAR didapat dengan rumus : KAR = BS - BK x 1% BJ - BK 18

35 KAM diukur dengan mengambil sampel tanah di bagian atas, tengah dan bawah. Sampel tanah ditimbang untuk memperoleh berat basah (BB), kemudian dioven pada suhu 8 C untuk mendapatkan berat kering (BK). KAM diperoleh dengan rumus: KAM = BB - BK x 1 % BB Pengukuran laju fotosintesis dan laju transpirasi Laju fotosintesis diukur dengan menggunakan Photosynthetic Leaf Chamber Analyser tipe LCA-4. Pengukuran dilakukan berdasarkan pertukaran CO 2 dan H 2 O pada daun tanaman yang dihubungkan dengan Leaf Chamber. Laju fotosintesis dan laju transpirasi diukur langsung pada hari ke, 4, 8, 1, 12 HSP kekeringan untuk kedelai budidaya dan jagung, dan 22 HSP kekeringan untuk kedelai liar, dan 2 hari setelah rewatering. Analisis peroksidasi lipid Peroksidasi lipid dianalisis dengan metode yang dikembangkan oleh Ono et al. (1995) yang dimodifikasi yaitu berdasarkan pengujian thiobarbituric acid (TBA), dengan malondialdehid (MDA) sebagai hasil akhir dari peroksidasi lipid. Daun (,2 g) digerus dengan penambahan,5 ml trichloroasetic acid (TCA),1% pada es. Ekstrak daun yang diperoleh ditambahkan 3 ml H 3 PO 4 1% dan 1 ml TBA,6% dalam TCA 2%. Larutan yang diperoleh di oven pada suhu 1 C selama 3 menit. Setelah didinginkan, larutan ditambahkan 4 ml n-butanol dan disentrifus 42 rpm suhu 28 C selama 2 menit. Supernatan yang diperoleh diukur absorban pada panjang gelombang 532 nm dan 52 nm. Selisih kedua absorban merupakan nilai nonspesifik dan jumlah MDA diperoleh dari koefisien (ε=155 L mmol -1 cm - 1 ). Dengan rumus sebagai berikut: ((Selisih absorban antara 532 nm dan 52)/ 155 L mmol -1 cm -1 ) x 1 6 berat segar 19

36 Persiapan ekstrak enzim Daun diekstak dengan menggunakan metode Jiang and Huang (21),,2g sampel daun digerus dengan 4 ml larutan yang mengandung 5 mm buffer fosfat (PH 7,), 1 % polyvinypolypyrrolidona dan,2 mm asam askorbat. Hasil gerusan disentrifus pada 15 g selama 3 menit sehingga diperoleh supernatan. Supernatan disimpan di -3 C yang digunakan untuk analisis enzim Glutation reduktase (GR), superoksida dismutase (SOD), dan askorbat peroksidase (APX). Analisis glutation reduktase (GR) Aktivitas GR berdasarkan penurunan absorban pada 34 nm selama 1 menit (Cakmak et al. 1993). Campuran reaksi mengandung 1 mm EDTA,,5 mm GSSG,,15 mm NADPH, 1 mm buffer sodium phosphate (ph 7,8) dan,5 ml ekstrak enzim. Aktivitas enzim dinyatakan dalam per berat unit protein. Kandungan protein diukur dengan menggunakan bovine serum albumin sebagai standar berdasarkan metode Bradford (1976). Analisis superoksida dismutase (SOD) Aktivitas SOD diukur dengan spektrofotometer. Pengukuran dilakukan dengan menghambat pembentukan blue diformazan dengan keberadaan riboflavin/nitrobule tetrazolium (NBT) dan cahaya. Ekstrak daun (9 μl) dimasukkan kedalam tabung yang mengandung 1 ml sodium fosfat 5 mm (ph 7.8), EDTA,1 mm, riboflavin,3 mm. Setelah inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar, ditambahkan (NBT),3 mm. Larutan tersebut diberi cahaya lampu (55 W, 2 cm di bawah larutan) tiap 3 detik selama 1 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 56 nm. Larutan tanpa ekstrak daun digunakan sebagai kontrol. Aktivitas enzim dinyatakan dalam unit mg -1 protein; satu unit merupakan 5% penghambatan pembentukan blue diformazan (Beauchamp and Fridovish 1971 cit Pritchard et al. 2 ). Askorbat peroksidase (APX) Aktivitas Askorbat peroksidase (APX) diukur bedasarkan penurunan absorban pada 29 nm selama 1 menit (Nakano dan Asada 1981). Campuran 2

37 reaksi mengandung 5 mm bufer fosfat (ph 7,),,5 mm asam askorbat,,1 mm EDTA dan,1 mm hidrogen peroksida. Analisis askorbat (ASA) Kandungan ASA dianalisis berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Reiss (1993) yang dimodifikasi. Kandungan ASA diukur dengan menggunakan metode titrasi. Sampel daun (,5 g) digerus dengan asam metafosforik 5% untuk mencegah terjadinya oksidasi dari asam askorbat. Hasil gerusan disaring dengan menggunakan filter Wathman. Larutan yang diperoleh dititrasi dengan dichlorophenol-indophenol (DCIP),8 g l -1. Sebelum titrasi, larutan DCIP distandarisasi dengan larutan asam askorbat murni, yaitu 1 ml larutan asam askorbat (4, mg l -1 ) dan 9 ml asam metaphosphorik 5%. Titrasi dihentikan ketika terjadi perubahan warna larutan menjadi warna pink. Kandungan ASA diperoleh dengan rumus sebagai berikut: 1. Untuk standarisasi larutan ASA (4 mg ASA murni equivalen dengan 1ml dye. ASA (mg) = 4 mg ASA murni 1 ml dye dye yang dititrasi (ml) 2. Untuk mengetahui kandungan ASA daun tanaman (ASA 1 g -1 jaringan daun): mg ASA per aliquot x [total volume ekstrak (ml)/ volume aliquot (ml)] x (1/ berat sampel) Pengukuran akumulasi prolin Kandungan prolin bebas dianalisis berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Bates (1973), dengan menggunakan Beckman DB-G spectrophotometer. Sampel daun yang dipakai adalah daun yang berkembang sempurna. Untuk menentukan kadar prolin dalam sampel digunakan prolin murni sebagai standar. Asam-ninhydrin disiapkan sebagai pereaksi dengan menghangatkan 1,25 g ninhydrin dalam 3 ml asam asetat glacial dan 2 ml 6 mol asam fosfat dengan cara dipanaskan sampai larut. Kemudian didinginkan dan disimpan pada suhu 4 C. Pereaksi ini telah siap setelah 24 jam. Kira-kira,5 g 21

38 bahan tanaman (daun) diekstraksi dalam 1 ml asam sulfosalisilik 3% dan difiltrasi filter whatman. Sebanyak 2 ml filtrat direaksikan dengan 2 ml asam ninhydrin dan 2 ml asam asetat glasial pada tabung reaksi selama 1 jam pada suhu 1 C, kemudian proses reaksi diakhiri dalam ice-bath. Campuran ini selanjutnya diekstraksi dengan 4 ml toluene, dikocok dengan kuat menggunakan test tube strirrer selama 15-2 detik. Kemudian diukur absorbansinya pada 52nm dengan spektrofotometer. Untuk blanko digunakan toluene. Konsentrasi prolin ditentukan dari kurva standar dan dihitung berdasarkan berat segar yaitu: (μg prolin / ml x ml toluene) / μg / μmol (g sample) / 5 = μ mol prolin g -1 bobot basah bahan. 22