BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan melalui dua tahap. Tahap pertama adalah proses pencekokan ekstrak daun kepel dan akuades terhadap mencit (Mus musculus) serta pengumpulan feses dari mencit. Kedua tahap tersebut dilaksanakan di laboratorium bagian Farmakologi dan Toksikologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi FKH IPB. Tahap kedua adalah proses analisis kadar amonia, trimetilamin, dan fenol yang dilaksanakan di laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia FMIPA IPB. Penelitian dilaksanakan mulai bulan April hingga Oktober Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanol 30% daun kepel (Stelechocarpus burahol), akuades, dan hewan coba berupa mencit (Mus musculus) sebanyak sembilan ekor untuk masing-masing kelompok. Ekstrak etanol daun kepel yang digunakan berasal dari Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB. Bahan yang digunakan dalam penentuan kadar gas amonia dalam feses mencit adalah larutan asam perklorat 6%, NaOH 20%, H 3 BO 4 3%, dan Na 2 B 4 O N serta beberapa indikator seperti fenolftalein, tashiro, dan metil merah. Bahan yang digunakan dalam penentuan kadar gas trimetilamin dalam feses mencit adalah larutan TCA 7%, K 2 CO 3, H 3 BO 3 2%, formalin pekat, HCl 0.02 N, dan indikator Conway. Bahan yang digunakan dalam penentuan kadar fenol dalam feses mencit adalah larutan etanol, reagen Folin-Ciocalteau, dan larutan natrium bikarbonat. Alat yang digunakan dalam penentuan kadar gas amonia dan trimetilamin pada feses mencit adalah blender, buret, mikroburet, corong gelas, erlenmeyer, gelas piala,inkubator, kertas saring kasar, labu takar, pipet volumetrik dengan volume 0.5 ml, 1ml, dan 2 ml, seperangkat alat destilasi uap, dan timbangan analitik dengan ketelitian Alat yang digunakan dalam penentuan kadar fenol pada feses mencit adalah kertas saring Whatman # 42, rotavapor, dan

2 spektrofotometer. Alat lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah sonde lambung, spoit, kandang metabolik, dan timbangan. 3.3 Metode Penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahap yaitu tahap pencekokan mencit dengan ekstrak daun kepel yang dilarutkan dalam akuades dan pengumpulan feses mencit serta tahap penentuan kadar amonia, trimetilamin, dan fenol pada feses mencit. Dalam penelitian ini hewan coba terbagi kedalam dua kelompok. Masing-masing kelompok terdiri atas sembilan ekor mencit. Sembilan ekor mencit tersebut ditempatkan pada tiga kandang metabolik sehingga masingmasing kandang metabolik berisi tiga ekor mencit. Hewan pada kelompok pertama dicekok dengan akuades sebanyak 1 ml/ekor setiap hari. Hewan pada kelompok kedua dicekok ekstrak kental daun kepel sebanyak 0,05 gram/ekor setiap hari. Dosis pemberian ekstrak daun kepel ini didasarkan pada tabel konversi Laurence & Bacharah (1964). Sebelum diberi perlakuan, kedua kelompok hewan diaklimatisasi terlebih dahulu selama tujuh hari. Pada hari pertama aklimatisasi seluruh mencit dalam kelompok tersebut diberi obat anticacing untuk mencegah infeksi cacing pada saat perlakuan. Dalam tahap aklimatisasi hewan dicekok dengan akuades sebanyak 1 ml/ekor setiap hari. Hal ini dilakukan dengan tujuan agar hewan terbiasa dengan proses pencekokan. Selama tahap aklimatisasi hewan diberi pakan berupa pelet dan air minum secara ad libitum Pembuatan dan Pencekokan Larutan Ekstrak Daun Kepel Proses pembuatan larutan ekstrak daun kepel diawali dengan penimbangan ekstrak daun kepel. Dosis ekstrak daun kepel yang diberikan ke mencit dihitung berdasarkan tabel konversi Laurence & Bacharah (1964). Dosis pemberian ekstrak daun kepel berdasarkan atas jumlah buah yang dapat menimbulkan efek deodoran pada manusia karena sampai saat ini belum ada publikasi atau data empiris yang menyebutkan jumlah daun yang dikonsumsi manusia untuk mendapatkan efek deodoran.

3 Berdasarkan info empiris, rata-rata manusia memakan buah kepel sebanyak dua buah untuk mendapatkan efek deodoran. Bobot rata-rata dari dua buah kepel adalah sebesar 100 gram. Setelah dikonversi dengan menggunakan tabel Laurence & Bacharah (1964) maka didapatkan dosis pemberian ekstrak daun kepel untuk mencit sebesar 2,6 mg/gram bobot mencit. Mencit yang digunakan dalam penelitian ini memiliki berat rata-rata 20 gram, sehingga ekstrak daun kepel yang diberikan untuk tiap ekor mencit sebanyak 0,05 gram. Tahap pengumpulan feses mencit dilakukan sebelum pencekokan hingga sehari setelah pencekokan terakhir. Pencekokan mencit dengan akuades dan larutan ekstrak daun kepel dilakukan selama tujuh hari. Feses dari masing-masing kandang metabolik dikumpulkan didalam botol film lalu dimasukkan kedalam lemari pendingin untuk menjaga kadar amonia, trimetilamin, dan fenol yang terkandung dalam feses. Tahap pengukuran kadar amonia, trimetilamin, dan fenol dalam feses mencit dilakukan pada hari ke 0 (sebelum pencekokan), hari ke 4 (setelah pencekokan hari ke 3), dan hari ke 8 (setelah pencekokan hari ke 7) Penentuan Kadar Amonia dan Trimetilamin dalam Feses Metode penentuan kadar gas amonia dan trimetilamin dilakukan sesuai dengan Standar Nasional Indonesia (SNI) : Metode ini umumnya terdiri atas tahap ekstraksi, destilasi, dan titrasi (BSN 2009). Pada proses penentuan kadar gas amonia feses diekstrak menggunakan asam perklorat 6%. Ekstrak yang didapat dimasukkan ke dalam tabung destilasi dan diteteskan indikator fenolftalein. Tabung destilasi dipasang pada peralatan destilasi uap dan kedalamnya ditambahkan larutan NaOH 20%. Destilasi uap dilakukan selama kurang lebih 10 menit. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer yang berisi larutan H 3 BO 4 3% dan indikator Tashiro yang berwarna ungu. Hasil destilasi yang bercampur dengan larutan dalam erlenmeyer akan menghasilkan larutan yang berwarna hijau. Tahap berikutnya adalah destilasi larutan blanko dengan cara mengganti ekstrak sampel dengan PCA 6%. Setelah itu destilat dari sampel dan blanko dititrasi menggunakan HCl 0.02 N sampai larutan berwarna ungu. Kadar gas amonia dihitung dengan menggunakan rumus:

4 Total nitrogen volatil = ((Vc-Vb) x N x 14,007 x 2 x 100) /W Keterangan : Vc = volume HCl contoh Vb = volume HCl pada titrasi blanko N = normalitas larutan HCl W = bobot contoh 14,007 = massa relatif atom nitrogen 2 = faktor pengenceran Pada proses penentuan kadar gas trimetilamin feses diekstrak menggunakan larutan TCA 7%. Filtrat yang terbentuk dimasukkan pada salah satu sisi outer chamber dari cawan conway yang bagian tutupnya sudah diolesi vaselin. Setelah itu larutan K 2 CO 3 dimasukkan pada sisi lain dari outer chamber cawan conway. Pada bagian inner chamber dimasukkan larutan H 3 BO 3. Pada bagian outer chamber yang terisi K 2 CO 3 ditambahkan formalin pekat, sedangkan pada bagian inner chamber yang terisi H 3 BO 3 ditambahkan indikator conway. Setelah itu cawan conway ditutup rapat dan digoyang secara perlahan hingga larutan yang ada pada kedua sisi outer chamber bercampur. Setelah itu dilakukan uji blanko dengan cara mengganti larutan filtrat dengan larutan TCA 7%. Cawan conway yang berisi larutan filtrat dan blanko diinkubasi pada suhu 35 C selama dua jam atau pada suhu ruang selama satu malam. Setelah itu hasil inkubasi dititrasi menggunakan larutan HCl 0.02 N sampai larutan berwarna merah muda. Kadar gas trimetilamin dihitung dengan menggunakan rumus : TMA (mg-n/100g) = ((Vc-Vb) x N x 14,007 x fp x 100/W) Keterangan: Vc = volume HCl contoh Vb = volume HCl pada titrasi blanko N = normalitas larutan HCl W = bobot contoh 14,000 = massa relatif atom nitrogen fp = faktor pengenceran Penentuan Kadar Fenol dalam Feses Tahap ini diawali dengan proses ekstraksi. Feses dihomogenisasi dengan etanol menggunakan mesin penggoyang (shaker) selama tiga jam. Setelah itu campuran tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 70 C selama satu jam dan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman # 42. Residu yang

5 tersisa dicuci menggunakan larutan etanol panas (70 C) kemudian kedua filtrat dicampur. Filtrat disaring kembali secara manual dengan kertas saring Whatman # 42 lalu diuapkan dengan rotavapor pada suhu 40 C. Ekstrak yang didapat dianalisis kandungan total fenolnya. Analisis total fenol dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Ekstrak etanol feses yang mengandung 5-10 mg bahan kering dilarutkan dalam 2 ml etanol 95% dalam seri tabung reaksi. Ke dalam setiap tabung ditambahkan 5 ml akuades dan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteau 50% (v/v). Setelah lima menit ditambahkan 1 ml larutan natrium bikarbonat kedalam setiap tabung. Campuran tersebut dihomogenisasi dan diinkubasi dalam keadaan gelap selama satu jam. Setelah itu campuran dihomogenisasi kembali dan absorbansi larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar fenol dibuat dengan menggunakan standar asam galat ppm sebagai pengganti sampel dengan perlakuan yang sama Analisis Data Hasil pengukuran parameter dinyatakan dalam rataan dan simpangan baku. Data yang diperoleh dianalisis secara statistika dengan menggunakan metode uji T-student