Lampiran1. Bagan Alir Penelitian

Transkripsi

1 Lampiran1. Bagan Alir Penelitian Pengambilan sampel spons dari perairan Pulau Ngge Sibolga Isolasi dan pemurnian bakteri simbion spons Uji antibakteri isolat terhadap bakteri patogen secara in-vitro Ekstraksi metabolit sekunder isolat bakteri potensial secara bertingkat (n- heksana, etil asetat dan metanol) Skrining aktifitas ekstrak n- heksana, etil asetat dan metanol. Skrining komponen senyawa ekstrak potensial Pemisahan golongan senyawa metabolit sekunder ekstrak isolat potensial dengan KLT Uji aktifitas antibakteri fraksi ekstrak isolat potensial

2 Lampiran 2a. Isolasi dan Pemurnian Bakteri Simbion Sampel dihaluskan Sampel yang telah halus diambil 1 gr Dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml air laut steril Dilakukan pengenceran bertingkat Diambil 1 ml Diinokulasi pada media nutrien agar Inkubasi selama 2x24 jam Diinokulasi kembali pada media nutrien agar Diperoleh koloni tunggal

3 Lampiran 2b. Isolat Tunggal Bakteri Simbion

4 A1 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9

5 Lampiran 3a. Bagan Alir Uji aktifitas Antibakteri Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap bakteri patogen secara in-vitro Terhadap ekstrak n- heksana, etil asetat dan metanol. Terhadap fraksi ekstrak n- heksana, etil asetat dan metanol. Isolat bakteri disubkultur pada media NA Hasil subkultur diambil dengan ose dan dilarutkan dalam air laut steril 10 μl suspensi bakteri simbion diteteskan pada cakram oxoid Inokulasi 200 µl suspensi bakteri uji ke dalam media nutrien agar Cakram oxoid yang telah ditetesi 10 µl dari masing-masing ekstrak n-heksana, Etil asetat dan Metanol diletakkan pada media NA yang telah diinokulasi suspensi bakteri uji Inokulasi 200 µl suspensi bakteri uji ke dalam media nutrien agar Cakram oxoid yang telah ditetesi 10 µl dari masing-masing fraksi ekstrak n-heksana, Etil asetat dan Metanol diletakkan pada media NA yang telah diinokulasi suspensi bakteri uji Cakram oxoid diletakkan pada media NA yang diinokulasi dengan bakteri uji Inkubasi selama 24 jam Inkubasi selama 24 jam Inkubasi jam Pengukuran zona hambat (mm) Pengukuran zona hambat (mm) Pengukuran zona hambat (mm)

6 Lampiran 3b. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap Bakteri Uji 1. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap S.aureus H1 H4 H6 H2 H3 H6 A3 A7 A9 A6 A1 A2 A8 2. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap E. coli H1 H5 H6 H3 H2 H7 A1 A6 A7 A2

7 3. Pengujian Isolat Bakteri Terhadap P. Aeruginosa A3 A8 A9 H1 A3 A2 A1 H3 H2 A4 A7 A8 A9

8 Lampiran 3c. Pengujian Ekstrak N-Heksana, Etil Asetat dan Metanol dari Isolat HH2, A9 dan A10 Terhadap Bakteri Uji S.aureus, E.coli dan P. aeruginosa 1. Ekstrak Isolat H2 Terhadap S.aureus 2. Ekstrak Isolat H2 Terhadap E. coli MH2 MH2 EH2 HH2 EH2 HH2 MH2 MA1 EH2 HH2 EA1 HA1 Ekstrak Isolat H2 Terhadap P. aeruginosa Ekstrak Isolat A1 terhadap S.aureus MA1 MA1 EA1 HA1 EA1 HA1 Ekstrak Isolat A1 terhadap E. coli Ekstrak isolat A1 terhadap P. Aeruginosa

9 Ekstrak Isolat A2 Terhadap S.aureus Ekstrak Isolat A2 Terhadap E. coli MA2 MA2 EA2 HA2 EA2 HA2 Ekstrak Isolat A2 Terhadap P. Aeruginosa MA2 EA2 HA2

10 Lampiran 4a. Bagan Alir Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Bakteri Potensial Kultur isolat bakteri yang telah difermantasi Dipotong kecil- kecil Maserasi selama 3 x 24 jam dengan n-heksana Penyaringan Filtrat I Residu Evaporasi Maserasi selama 3 x 24 jam dengan etil asetat asetat Ekstrak n- Heksana Penyaringan Filtrat Residu Evaporasi Maserasi selama 24 jam dengan metanol Ekstrak etil asetat Penyaringan Filtrat I Residu Evaporasi Ekstrak metanol

11 Lampiran 4b. Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Bakteri Potensial 1. Kultur bakteri H2 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol 2. Kultur bakteri A1 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol 3. Kultur bakteri A2 yang dimaserasi pada pelarut ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol 4. Ekstrak metabolit sekunder isolat H2, A1 dan A2 bakteri potensial

12 Lampiran 5a. Bagan Alir Uji Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak n- Heksana, Etil asetat dan Metanol Isolat Potensial Ekstrak - Ditambahkan 5 ml aquades dan kloroform lalu dikocok dan biarkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan (Lapisan air untuk uji flavonoid, fenolik dan saponin sedangkan lapisan kloroform untuk uji terpenoid dan steroid) Lapisan air Lapisan kloroform Uji flavonoid Uji terpenoid Uji fenolik Uji steroid Uji saponin Uji alkaloid

13 Bagan Alir Uji Flavonoid Lapisan air - Ditambahkan 1-2 butir logam magnesium dan beberapa tetes asam klorida pekat Terbentuk warna jingga, merah muda sampai merah 1. Bagan Alir Uji Fenolik Lapisan air - Ditambahkan 1-2 larutan FeCl 3 1% Terbentuk warna biru/ungu 2. Bagan Alir Uji Saponin Lapisan air - Dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu dikocok Terbentuk busa yang bertahan 5 menit

14 3. Bagan Alir Uji Terpenoid dan Steroid Lapisan kloroform - Dilakukan penyaringan terhadap lapisan kloroform melalui pipet yang ujungnya diberi kapas - Dipipet sebanyak 2-3 tetes dan biarkan mengering pada plat tetes - Ditambahkan pereaksi Lieberman-Burchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat) - Terbentuk warna merah (terpenoid) - Terbentuk warna hijau-biru (steroid) 4. Bagan Alir Uji Alkaloid Ekstrak - Ditambahkan 10 ml larutan kloroform beramoniak 0,05 M - Diaduk kemudian disaring dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. - Ke dalam tabung reaksi tersebut ditambahkan 1 ml asam sulfat 2 N, dikocok selama 2 menit dan dibiarkan hingga terbentuk dua lapisan dan terjadi pemisahan. - Lapisan asam (bagian atas) diambil dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi Mayer atau pereaksi Dragendorff - Terbentuknya endapan putih (pereaksi meyer) - Terbentuk warna merah (pereaksi Dragendorff)

15 Lampiran 5b. Hasil Uji Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak n-heksana, Etil asetat dan Metanol Isolat Potensial EA1F3 EA2F3 Gambar: Uji alkaloid Ekstrak isolat EA1 dan EH2 MA2F3 MA2F2 MA1F33 EA2F3 Gambar: Uji Alkaloid Fraksi MA2F3, MA2F2, MA1F3 dan EH2F3 MA2 MA2F3 MA2F2 Gambar: Uji saponin ekstrak isolat Uji saponin MA2F2 dan MA2F3

16 Lampiran 6. Bagan Alir Proses Identifikasi Golongan Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak Isolat Potensial dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif 1. Pembuatan Kromatografi Lapis Tipis Bahan - Disiapkan plat kaca ukuran 20x20 cm - Diletakkan plat kaca tersebut diatas alat pencetak plat KLT sekaligus alat pengukur ketebalan plat (ukuran 1mm) - Disiapkan bubur silica, lalu tuangkan pada plat kaca sampai merata sambil terus diaduk - Setelah bubur silica rata, dibiarkan pada suhu ruang selama ±12 jam - Diaktivasi plat dengan cara memanaskan pada suhu 100 o C dalam oven selama ± 30 menit. KLT Preparatif 2. Pemisahan Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif KLT Preparatif - Chamber dijenuhkan dengan pelarut pengembang (EtOAc:MeOH, 3:2 v/v) yang dilapisi dengan kertas saring - Di masukkan pelarut pengembang kedalam chamber sampai kertas saring basah oleh pelarut. - Larutan ekstrak metabolit sekunder isolat bakteri ditotolkan pada garis bawah batas bawah plat - Plat dibiarkan kering selama ± 15 menit - Dimasukkan plat kedalam chamber yang sudah jenuh dan dielusi sampai pelarut mencapai bagian atas plat - Noda yang terbentuk diamati dibawah sinar UV, lalu digambar pola pemisahan dengan menggunakan pensil - Dikerok pola noda yang telah digambar lalu dimasukkan ke dalam vial lalu dicuci dan dipisahkan dari silikanya. - Masing-masing senyawa yang dihasilkan diuapkan. Hasil