BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen yang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 perlakuan dan pengulangan sebanyak 5 kali pada masing-masing perlakuan yang terdiri dari P0 P1 P2 P3 P4 : diberi aquades : diberi ekstrak kulit rambutan 500 mg/kg BB : diberi ekstrak kulit rambutan 1000 mg/kg BB : diberi ekstrak kulit rambutan 1500 mg/kg BB : diberi glibenklamid 0,65 mg/kg BB Pemberian dosis ekstrak kulit buah rambutan berdasarkan atas berat badan mencit. Perlakuan diberikan selama 15 hari. 3.2 Sampel penelitian Sampel yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 25 ekor. Teknik pengambilan sampel dalam penelitian ini adalah acak sederhana (simple random sampling). Hewan uji yang dipakai adalah mencit jantan galur swiss webster berumur 1-2 bulan dengan berat badan 20-25 g diambil secara acak sebanyak 25 ekor yang diperoleh dari peternakan tikus dan mencit Jakabaring Palembang. Rambutan yang digunakan dalam penelitian adalah lebak bulus yang telah matang dengan kulit buah berwarna merah. Rambutan yang digunakan diperoleh dari kebun buah rambutan KM 15 Jambi. 3.3 Alat dan bahan 23
2 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: kandang, masker, sarung tangan, kamera, tabung erlenmeyer, grinder, rotary evaporator, alat glukometer, alat suntik, sonde, tabung reaksi, mortar, gelas ukur, neraca analitik, lemari es, pisau, spatula, botol maserasi, gunting, corong pisah, corong kaca, gelas ukur, mortar, gelas kimia. Bahan yang digunakan berupa: mencit, kulit buah rambutan, pelet mencit, Na CMC 1%, strip Gluko Dr, aloksan, aquades, metanol, aluminium foil, mencit, kertas saring, tissue, aquades. 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pengumpulan Bahan Rambutan yang digunakan adalah rambutan lebak bulus yang dikumpulkan dari kebun rambutan Balai Benih Induk Holtikultura Jambi Desa Pondok Meja Kecamatan Jambi Luar Kota KM 15. Kulit buah yang digunakan berwarna merah dengan rambut merah kekuningan pada ujungnya. 3.4.2 Pembuatan simplisia Sebanyak 16 kg buah rambutan dipisahkan kulitnya dari daging buah lalu dicuci hingga bersih kemudian ditiriskan dan ditimbang. Selanjutnya dikeringkan sampai kering (ditandai bila diremas rapuh) lalu ditimbang sebagai berat simplisia. Simplisia yang telah kering diserbukkan dengan menggunakan glinder. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah plastik tertutup dan di simpan pada suhu kamar. 3.4.3 Pembuatan Ekstrak 30
3 Ekstraksi merupakan hasil dari mengekstraksi zat aktif simplisia hewan ataupun nabati yang pekat dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Semua pelarut diuapkan dan massa serbuk yang tersisa agar memenuhi baku yang ditetapkan diperlakukan sedemikian rupa (Depkes RI, 1979:9). Simplisia sebanyak 1 kg dimaserasi dengan pelarut metanol 1 x 24 jam. Setelah 1 hari perendaman diperoleh ampas dan filtrat. Ampas dan filtrat dipisahkan, kemudian ampas dimaserasi lagi selama 1 x 24 jam. Maserasi dilakukan sampai filtrat yang dihasilkan menjadi berubah warna. Seluruh filtrat yang dihasilkan digabungkan dan dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator, hingga di hasilkan ekstrak pekat (Tjandra, 2011:4). 3.4.4 Persiapan Hewan Coba Setelah pembuatan ekstrak perlu diadakan persiapan pada hewan uji sebelum penelitian dilakukan. Hal pertama yang disiapkan terlebih dahulu adalah kandang. Menurut Kusumawati (2004:26) kandang yang digunakan untuk hewan uji coba mencit ialah kandang yang berukuran minimal 100 cm 2 yang terbuat dari kawat berbentuk kotak, dalam penelitian ini digunakan kandang berukuran 1200 cm 2 yang terbuat dari plastik dan ditutup dengan kawat. Smith dan Mangkoewidjojo (1988:14) juga menambahkan bahwa kandang dilengkapi dengan serbuk gergaji sebagai alas tidur (bedding) yang selalu diganti 2 kali dalam satu minggu. Selain itu kandang juga dilengkapi dengan alat makan yang berbentuk kotak dibuat agak melekuk miring kedalam kadang agar mencit dan alat minum yang terbuat dari botol plastik yang
4 disertai dengan pipa gelas atau logam agar mencit dapat minum melalui pipa tersebut. Kemudian hewan coba diaklimatisasi selama satu minggu dalam kandang dengan suhu kamar 20-24 0 C, dan diberi makan berupa pelet sebanyak 4-8 g/ hari serta minum sebanyak 5-8 ml/hari (Hedrich, 2012:522). 3.4.5 Pengukuran Kadar Gula Mencit Kadar glukosa darah diukur dengan alat glukometer menggunakan tes strip yang bekerja secara enzimatis, yaitu sampel darah akan masuk ke dalam test strip melalui aksi kapiler. Glukosa yang ada dalam darah akan bereaksi dengan glukosa oksidase dan kalium ferisianida yang ada dalam strip dan menghasilkan kalium ferosianida. Kalium ferosianida yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi glukosa yang ada dalam sampel darah. Oksidasi kalium ferosianida akan menghasilkan muatan listrik yang akan diubah oleh glukometer untuk ditampilkan sebagai konsentrasi glukosa pada layar. Alat yang digunakan untuk mengukur kadar glukosa darah adalah Gluco Dr. Alat ini secara otomatis akan hidup ketika test strip dimasukkan dan akan mati setelah beberapa menit test strip dicabut. Gluco Dr check strip dimasukkan ke alat Gluco Dr sehingga glukometer ini akan hidup secara otomatis, kemudian dicocokkan kode nomor yang muncul pada layar dengan yang ada pada vial Gluco Dr test strip. Test strip yang dimasukkan pada glukometer pada bagian layar akan tertera angka yang sesuai dengan kode vial Gluco Dr test strip, kemudian pada layar monitor glukometer muncul tanda siap untuk diteteskan darah. Caranya dengan menyentuh 1 tetes darah yang keluar ke tes strip dan ditarik 30
5 sendirinya melalui aksi kapiler. Ketika wadah terisi penuh oleh darah, alat mulai mengukur kadar glukosa darah. Hasil pengukuran diperoleh selama 15 detik. Sebelum dilakukan pengukuran kadar gula darah, mencit dipuasakan (tidak diberi makan tetapi tetap diberi minum) selama 18 jam yang diukur menggunakan glukometer Gluko Dr. Masing-masing mencit diukur dengan diambil darah mencit melalui ekor setelah didesinfektan dengan etanol 70% ditusuk menggunakan jarum frank. Tetesan darah pertama dibuang, tetesan berikutnya diserapkan pada test strip yang terselip pada alat. Sejumlah darah tertentu akan terserap sesuai dengan kapasitas serap test strip, setelah itu pendarahan ekor mencit dihentikan, dalam waktu 15 detik pada layar tertera kadar glukosa darah dalam satuan mg/dl. Pengukuran gula darah dilakukan sebelum induksi aloksan, setelah induksi aloksan, serta selama pengujian berlangsung dimana pengujian berlangsung 15 hari dan pengambilan darah dilakukan 3 hari sekali. 3.4.6 Perlakuan Induksi Aloksan Setelah didapatkan kadar gula darah normal, hewan uji diinduksi aloksan 1% dengan dosis 150 mg/kg BB (Sujono dan Munawaroh, 2009:123) yang dilarutkan dengan NaCl 0,95 % diinjeksikan secara intraperitoneal. Aloksan monohidrat yang telah dilarutkan harus segera diinjeksikan sebelum terjadi perubahan warna dari merah muda menjadi bening. Maksimal pada mencit standar yang diinjeksikan secara intraperitonial yaitu 0,5 ml (perhitungan induksi aloksan dapat dilihat pada lampiran 4). Pada hari ketiga, kadar glukosa darah puasa diukur kembali apabila sudah mengalami kenaikan >200 mg/dl dinyatakan telah mengalami diabetes dan segera
6 diberi perlakuan pemberian ekstrak kulit rambutan secara peroral (Mahendra, 2008:14). 3.4.7 Pemberian Perlakuan Penelitian ini memiliki 5 perlakuan pada masing masing perlakuan menggunakan suspensi Na CMC + aquades sebagai pelarutnya. Na CMC yang digunakan 1% yang dibuat dengan 1 g Na CMC dilarutkan dalam 100 ml aquades hangat. 3.4.7.1 Pemberian Obat Glibenklamid Tablet glibenklamid diambil dan gerus menggunakan lumpang dan diambil sebanyak 27 mg yang dilarutkan dalam 10 ml suspensi Na CMC (Perhitungan dosis dapat dilihat pada lampiran 5). 3.4.7.2 Pemberian Ekstrak pada Hewan uji Dosis perlakuan yang diberikan yaitu 500 mg/kg BB, 1000 mg/kg BB, 1500 mg/kg BB. Kemudian ekstrak yang telah ditimbang disuspensikan dengan larutan Na CMC 1% sebanyak 10 ml (perhitungan dosis dapat dilihat pada lampiran 6). Dosis yang dipakai pada penelitian dihitung berdasarkan konsumsi kulit rambutan sebagai obat tradisional oleh masyarakat di Indonesia, Sebanyak 12 g. Pada tabel konversi dosis berat badan manusia 70 kg ke mencit 20 gram adalah 0,0026. Ekstrak yang dihasilkan dari 1 kg serbuk kering kulit buah rambutan sebanyak 333,8 g atau 33,38%. Sehingga menurut studiawan (2005:63) dosis kulit buah rambutan yang dapat digunakan adalah Dosis =33,38% x (12 g x 0,0026) = 33,38/100 x 0,031 g =0,3338x0,031 g 30
7 =0,010 g atau 10 mg/ 20 g BB Jadi dosis yang digunakan dalam percobaan adalah 10 mg/ 20g BB, 20 mg/ 20 g BB, 30 mg/20 g BB. Dosis yang digunakan (mg/kg) sehingga, 10 mg/ 20 g BB = = = x 1 kg = 500 mg/ kg BB 20 mg/ 20 g BB = 1000 mg/kg BB 30 mg/ 20 g BB = 1500 mg /kg BB 3.5 Pengumpulan Data 3.5.1 Kadar Gula Darah Pengumpulan data yang dilakukan adalah data kadar gula darah mencit saat puasa dimana sebelum pengambilan darah mencit dipuasakan terlebih dahulu selama 18 jam. Data yang diperoleh ialah kadar gula darah sebelum diberi perlakuan pada semua mencit. Data berikutnya setelah mencit diberi aloksan dilakukan pengukuran gula darah masing masing mencit (hari ke 1). Setelah diberi aloksan dan mencit telah mencapai kadar diabetik, mencit diberi perlakuan dengan menggunakan ekstrak dan dibandingkan dengan obat sintetis. Pengukuran gula darah dilakukan setiap 3 hari. Selanjutnya dihitung persentase Penurunan Kadar Gula Darah (PKGD) menggunakan rumus berikut: % PKGD = x 100% Keterangan: a = KGD setelah diinduksi aloksan
8 b = KGD pada waktu pengamatan hari ke-t 3.5.2 Berat Badan Berat badan mencit dihitung tiap perlakuan pada gula darah normal atau sebelum induksi aloksan, setelah induksi aloksan, dan selama perlakuan. Perhitungan pertambahan berat badan mencit setelah perlakuan digunakan rumus PBB = BBK BBA Keterangan: PBB : Pertambahan Berat Badan BBA: Berat Badan Awal BBK: Berat Badan Akhir 3.6 Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dan apabila memiliki pengaruh akan dilanjutkan dengan uji berganda Duncan New Multiple Range Test (DNMRT) pada taraf α = 5% (Gaspersz, 1994:92). Model linear dari rancangan acak lengkap dapat ditulis sebagai berikut: Y ij = µ + Ʈ i + Ɛ ij dimana: i j Yij = 1, 2,..... t (perlakuan) = 1, 2,..... r (ulangan) = Pengamatan pada perlakuan ke i dan ulangan ke j µ = rataan umur 30
9 Ʈ i Ɛ ij = pengaruh perlakuan ke i = Pengaruh acak pada perlakuan ke i dan ulangan ke j 3.7 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan kurang lebih selama 4 bulan, dimulai dari bulan April 2016 sampai bulan Agustus 2016. Tempat penelitian dilaksanakan di laboratorium Penelitian Akhir Fakultas Sains dan Ilmu Teknologi Universitas Jambi dan Perumahan Valencia blok N no 15. v