BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan berupa penelitian deskriptif eksploratif dengan cara pengisolasian bakteri-bakteri yang ada pada pakaian bekas impor di Pasar Angso Duo Kota Jambi Provinsi Jambi. Penelitian dilakukan dengan beberapa tahapan, yakni : isolasi bakteri, pemurnian bakteri, pewarnaan gram, uji biokimia dan identifikasi bakteri. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : tabung reaksi, rak tabung reaksi, cawan petri, pipet tetes, autoklaf, erlenmeyer, jarum ose, inkubator, mikroskop binokuler, mikroskop stereo, objek glass, cover glass, tabung durham, kompor listrik, inkas, lemari pendingin, bunsen, kawat kasa dan kamera. Bahan yang digunakan adalah : sampel pakaian bekas impor, aquadest, tisu, kapas, kertas label, Nutrien Agar, Strach Agar, Nutrien Gelatin, SIM Agar, MR-VP Broth, Simmons Citrate Agar, Trypticase Soy Agar, Brom Timol Blue Lactose Broth, Brom Timol Blue Dekstrosa Broth, Brom timol Blue Sukrosa Broth, Alkohol 95%, larutan NaCl 0,85%, larutan crystal violet, larutan safranin, Iodium, reagen barrit A dan B, reagen erlich, hidrogen peroksida, methyl red, spiritus, korek api, dan aluminium foil. 34
35 3.3 Pelaksanaan Penelitian 3.3.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini disterilkan terlebih dahulu agar tidak terjadi kesalahan akibat adanya kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi alat dan bahan ini dilakukan menggunakan autoklaf dengan tekanan 15 lbs dan suhu 121 0 C selama 15 menit. 3.3.2 Pengambilan Sampel Pengambilan sampel pakaian bekas impor dilakukan di Pasar Angso Duo Kota Jambi Provinsi Jambi. Sampel diambil dengan menggunakan simple random sampling dengan diambil 10% dari pakaian bekas impor di Pasar Angso Duo Kota Jambi Provinsi Jambi. Pakaian bekas impor yang diambil adalah dari jenis pakaian yang dijual dengan waktu pemasukan barang yang sama. Sampel pakaian yang diambil mewakili dari semua jenis pakaian, mulai dari kaos, kemeja, celana panjang, dress, dan pakaian dalam. Kemudian pakaian tersebut dimasukkan ke dalam kantong plastik dan dibawa ke Laboratorium Pendidikan Biologi FKIP Universitas Jambi. Pakaian yag dibawa kemudian direndam aquadest steril selama 24 jam dengan menggunakan alat dan tempat yang steril. 3.3.3 Pembuatan Medium Medium adalah suatu tempat yang berisi berbagai macam nutrisi atau zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk menumbuhkan atau mengembangbiakkan mikroorganisme. Selain iru, medium juga dipergunakan dalam pengisolasian,
36 perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, serta penghitungan jumlah mikroorganisme (Waluyo, 2008 : 157). Pembiakan mikroba di laboratorium membutuhkan medium guna menunjang nutrisi mikroba untuk tumbuh. Medium yang digunakan harus berisi zat hara (air, sumber energi, sumber carbon, nitrogen, sulfur, phospat, oksigen, hidrogen, serta unsur lainnya) dan daya dukung lingkungan yang sesuai dengan kebutuhan mikroba. Zat hara digunakan mikroba untuk pertumbuhan, sintesis sel, keperluan energi baik dalam metabolisme dan pergerakan (Lay, 1994 : 31). Medium yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah medium sintetis, dengan cara pembuatannya sebagai berikut : 1. NA (Nutrient Agar) NA (Nutrient Agar) adalah salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Pembuatan medium NA dengan cara melarutkan 5 g NA sintetis ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 2. Starch Agar Media Starch Agar digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme amilolitik dimana terdiri dari 1% pati. Komposisi pembuatan medium ini adalah pepton 6 g, meal extract 3 g, starch 2 g, agar 15 g, dan aquades 250 ml. Medium
37 dipanaskan dan diaduk hingga homogen. Medium kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 3. Nutrien gelatin Nutrien gelatin digunakan untuk menentukan perhitungan mikroba dari air atau deteksi mikroorganisme yang dapat menurunkan dan mengencerkan gelatin. Komposisi pembuatan medium ini adalah pepton 5 gr, meal extract 3 gr, gelatin 30 g, dan aquades 200 ml. Medium ini dipanaskan sambil diaduk hingga larutan homogen. Kemudian medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 4. SIM Agar SIM Agar digunakan untuk membedakan mikroorganisme berdasarkan produksi hidrogen sulfida, produksi indol, dan motilitas. Pembuatan medium ini dengan cara melarutkan 7,5 g SIM Agar sintetis ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 5. MR-VP Broth MR-VP Broth digunakan untuk membedakan mikroorganisme dari tingkat produksi keasaman atau produksi asetil metil karbinol. Pembuatan medium ini dengan cara melarutkan 4,3 g MR-VP sintetis ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit.
38 6. Simmons Citrate Agar Simmons Citrate Agar digunakan untuk membedakan gram negatif basil enterik berdasarkan pemanfaatan sitrat. Pembuatan medium ini dilakukan dengan melarutkan 5,6 g Simon Citrate Agar sintetis ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 7. Trypticase Soy Agar Trypticase Soy Agar digunakan sebagai media pemeliharaan berbagai organisme, dan pengujian kontaminan bakteri dalam kosmetik. Medium dibuat dengan cara melarutkan 12 g Trypticase Soy Agar sintetis ke dalam 250 ml akuades kemudian ini dipanaskan sambil diaduk hingga larutan homogen. Medium kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 8. Bromtimol Blue Laktosa Broth Bromtimol Blue Laktosa Broth merupakan media selektif yang digunakan umtuk mengisolasi bakteri gram negatif dari urin dan feses. Pembuatan medium ini dengan cara melarutkan pepton 3,7 g, laktosa 2,5 g ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen. dan ditambahkan 2,5 ml phenol/brom timol lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 9. Bromtimol Blue Dekstrosa Broth Komposisi dalam pembuatan medium ini adalah dengan cara melarutkan pepton 3,7 g, dektrosa 2,5 g ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan
39 diaduk hingga homogen. dan ditambahkan 2,5 ml phenol/brom timol lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 10. Bromtimol Blue Sukrosa Broth Pembuatan medium ini dengan cara melarutkan pepton 3,7 g, sukrosa 2,5 g ke dalam 250 ml akuades kemudian dipanaskan dan diaduk hingga homogen. dan ditambahkan 2,5 ml phenol/brom timol lalu medium disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 15 lbs selama 15 menit. 3.3.4 Isolasi dan Pemurnian Sampel pakaian bekas impor direndam dengan metode menggunakan air aquades steril. Diambil air rendaman baju import bekas tersebut sebanyak 1 ml sebagai sampel dari baju import bekas. Kemudian, air sampel sebanyak 1 ml dicampurkan dengan larutan NaCl 0,85 % 9 ml sehingga diperoleh sampel dengan perbandingan 1:10 (Fardiaz, 1992 : 28). Sesudah mendapatkan suspensi dari sampel, kemudian suspensi tersebut diencerkan dengan metode pengenceran yang berguna untuk mengurangi kepadatan bakteri yang terdapat dalam suspensi. Suspensi ini diencerkan dalam satu seri tabung. Kemudian, diambil 1 ml dari pengenceran dan selanjutnya diencerkan kembali sekurang-kurangnya hingga 7 kali pengenceran (10-7 ). (Waluyo, 2008 : 180-181). Kemudian, hasil dari pengenceran yang ke 7 diambil 1 ml dan disebarkan pada medium NA.
40 3.3.5 Identifikasi Bakteri Identifikasi mikroba merupakan salah satu tahapan lanjut dari hasil isolasi. Dalam mengidentifikasi dan determinasi biakan murni dapat ditentukan berdasarkan bentuk morfologi individu, morfologi koloni, sifat pewarnaan, sifat biokimia (fisiologis). Untuk mengidentifikasi mikroba, yang paling terkenal dan umum digunakan dipaparkan dalam Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Dalam buku tersebut dimuat semua sifat-sifat bakteri yang telah dikenal dan berhasil ditemukan (Waluyo, 2008 : 203-204). Proses identifikasi bakteri dilakukan melalui beberapa tahapan pengamatan morfologi dan uji biokimia. Adapun tahapan identifikasi bakteri yang akan dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Pengamatan Isolat Koloni Bakteri Pengamatan koloni bakteri ini dilakukan dengan mengamati koloni bakteri yang terbentuk dalam medium NA saat pengisolasian dan dihitung jumlah isolat bakteri yang tumbuh pada media NA. Indikator dalam pengamatan koloni bakteri ini yaitu mengamati bentuk, warna, tepi dan permukaan dari koloni bakteri. 2. Pewarnaan Gram Pengamatan bakteri dengan pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui bakteri tersebut termasuk dalam bakteri garam positif atau gram negatif. Pewarnaan ini dilakukan dengan cara koloni bakteri yang diperoleh dibuat dipreparat ulas kemudian difiksasi, lalu ditetesi denan larutan kristal violet, dibiarkan 1 menit. Setelah itu, kaca objek dimiringkan guna untuk membuang zat warna ungu berlebih,
41 lalu dibilas dengan aquades dengan cara dialirkan dari botol semprot. Selanjutnya, diberi larutan iodium dan dibiarkan selama 1 menit, lalu kaca objek dimiringkan untuk membuang larutan iodium yang berlebih dan bilas dengan aquades. Kemudian, dicuci dengan alkohol 95 % dengan cara ditetesi selama 10 detik sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi. Dicuci dengan aquades lalu beri pewarna safranin selama 1 menit, lalu kaca objek untuk membuang pewarna safranin berlebih, dan dibilas dengan aquades. Setelah itu, diamati dengan menggunakan mikroskop. 3. Uji Biokimia a. Hidrolisis starch (amilum) Bakteri yang telah diinokulasi pada mediun Starch Agar dengan cara gores (Streak inoculation) diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam. Lalu dituangkan iodium pada medium hingga mengenai media dan didiamkan selama 30 detik, lalu iodium ditumpahkan dan amati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk zona bening mengelilingi koloni bakteri maka menunjukkan reaksi positif, sedangkan apabila tidak terbentuk zona bening yang mengelilingi koloni bakteri maka menunjukkan reaksi negatif (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 133-134). b. Hidrolisis gelatin Bakteri yang telah diinokulasi pada medium nutrien gelatin dengan cara ditusuk (stab inoculation) diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam. Lalu dimasukkan ke dalam lemari pendingin pada suhu 4 0 C selama 30 menit, dan amati perubahan yang terjadi pada medium tersebut. Apabila medium tetap
42 dalam keadaan mencair, maka menunjukkan reaksi positif. Begitu pula sebaliknya, jika medium dalam keadaan membeku maka menunjukkan reaksi negatif (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 145). c. Fermentasi karbohidrat Dimasukkan tabung durham dimasukkanke dalam tabung reaksi secara tebalik yang masing-masing berisi phenol red lactose broth, phenol red dektrose broth, dan phenol red sucrose broth. Selanjutnya bakteri ditumbuhkan didalamnya dan diinkubasi selama 24 48 jam, lalu amati apa yang terjadi pada tabung durham dan warna medium. Apabila terdapat gelembung gas pada tabung durham dan warna menjadi keruh maka menunjukkan reaksi postif, sedangkan apabila tidak terbentuk gelembung gas pada tabung durham maka menunjukkan reaksi negatif (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 149). d. Produksi indol Bakteri yang diinokulasi pada medium SIM Agar dengan cara ditusuk lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam. Selanjutnya, diteteskan 10 tetes reagen Ehrlich ke dalam medium yang telah ditumbuhi bakteri, lalu digoyanggoyang secara perlahan dan amati perubahan yang terjadi pada medium. Jika terbentuk lapisan merah setelah ditambahkan reagen Ehrlich maka menunjukkan reaksi postif, sedangkan jika tidak terbentuk lapisan merah setelah ditambahkan reagen Ehrlich maka menunjukkan reaksi negatif (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 159-160).
43 e. Tes Katalase Bakteri yang digoreskan pada medium Trypticase Soy Agar, lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam. Selanjutnya diteteskan 4 tetes Hidrogen peroksida 3 % hingga merendami seluruh permukaan agar miring terseut, kemudian amati yang terjadi pada medium. Apabila terbentuk buih atau gelembung setelah ditetesi Hidrogen peroksida 3 % maka akan menunjukkan reaksi positif, sedangkan reaksi negatif dapat ditunjukkan dengan tidak terbentuknya buih atau gelembung (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 187). f. Tes Methyl Red Bakteri yang diisolasi pada medium MR-VP Broth diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam, lalu teteskan methyl red indikator sebanyak 5 tetes pada medium yang telah ditumbuhi bakteri lalu amati perubahan yang terjadi pada medium. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah setelah ditambahkan reagen methyl red indikator, sedangkan reaksi negatif ditandai dengan tidak terbentuknya warna merah (Cappuccino dan sherman, 1983 : 160-161). g. Tes Voges Proskauer Bakteri yang diisolasi pada medium MR-VP Broth diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam, lalu diteteskan 10 tetes reagen barrit A lalu dikocok secara perlahan. Sesaat kemudian langsung ditambakan lagi 10 tetes reagen barrit B dan dikocok lagi secara perlahan. Setalah 30 menit, amati perubahan yang terjadi pada medium. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya lapisan warna
44 merah, sedangkan reaksi negatif ditunjukkan dengan tidak terbentuknya lapisan warna merah pada medium (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 161-162). h. Tes Pemanfaatan Sitrat Bakteri yang digoreskan pada medium Simmon s citrate Agar diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam dan amati perubahan yang terjadi pada medium. Rekasi positif ditunjukkan dengan berubahnya warna medium menjadi biru, sedangkan reaksi negatif ditunjukkan dengan warna medium tetap berwarna hijau (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 162-163). i. Tes Hidrogen Sulfida Bakteri yang diinokulasi pada medium SIM Agar dengan cara ditusuk lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 48 jam dan amati perubahan yang terjadi pada medium. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna hitam disepanjang tusukan pada medium, sedangkan reaksi negatif ditandai dengan tidak terbentuknya warna hita tersebut (Cappuccino dan Sherman, 1983 : 169). Untuk melihat bahwa uji biokimia menunjukkan reaksi positif atau negatif dapat dilihat pada Tabel 3.1 Tabel 3.1 Ciri-ciri Reaksi Biokimia Positif atau Negatif Reaksi Biokimia Uji Biokimia Positif Negatif Tes katalase Terbentuk buih atau Tidak terbentuk buih atau gelembung pada medium gelembung Hidrolisis gelatin Medium mencair Medium membeku Hidrolisis starch (amilum) Terbentuk zona bening mengelilingi bakteri Tes Hidrogen sulfide (H 2S) Terbentuk warna hitam pada tusukan di medium Tidak terbentuk zona bening mengelilingi bakteri Tidak terbentuk warna hitam pada tusukan di medium
45 Fermentasi Karbohidrat Terdapat gelembung gas pada tabung durham dan berwarna keruh Tidak terdapat gelembung gas pada tabung durham Tes Indol Tebentuk lapisan merah Tidak terbentuk lapisan merah Tes methyl red Tebentuk lapisan merah Tidak terbentuk lapisan merah Tes Voges-Proskauer Tebentuk lapisan merah pada medium Tes pemanfaatan sitrat Warna medium berubah menjadi biru Tidak terbentuk lapisan merah pada medium Warna medium tetap hijau 3.4 Pengamatan Pengamatan penelitian ini dilakukan berdasarkan Tabel 3.2 berikut ini. Tabel 3.2 Faktor yang Diamati UJI Isolat Bakteri Karakteristik morfologi koloni bakteri Pewarnaan gram Hidrolisis amilum Hidrolisis gelatin Fermentasi karbohidrat Produksi indol Tes katalase Tes Methyl Red (MR) Tes Voges-Proskauer (VP) Tes pemanfaatan sitrat Tes hidrogen sulfida (H2S) Keterangan : morfologi koloni bakteri pewarnaan gram reaksi uji : dilihat dari bentuk, warna, tepi (pinggiran) dan permukaan. : dilihat dari positif negatifnya, apabila positif berwarna ungu dan negatif berwarna merah. : dilihat dari positif negatifnya yang terlihat sesuai dengan perubahan warna.
46 3.5 Analisis Data Data pada penelitian ini dianalisis secara deskriptif melalui pengamatan morfologi sel dan koloni, pewarnaan bakteri, dan identifikasi bakteri melalui uji biokimia. 3.6 Waktu dan Tempat Penelitiaan Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni-Nopember 2016, di Laboratorium Pendidikan Biologi FKIP Universitas Jambi.