5 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Pupuk Hayati (Biofertilizer) Pupuk hayati dapat diartikan sebagai inokulan berbahan aktif organisme hidup yang berfungsi untuk menambah hara tertentu atau memfasilitasi tersedianya hara tanah bagi tanaman. Pupuk hayati digunakan sebagai kolektif untuk semua kelompok fungsional mikroba tanah. Kelompok fungsional mikroba tanah terdiri dari bakteri, fungi, hingga alga yang berfungsi sebagai penyedia hara dalam tanah sehingga dapat tersedia bagi tanaman (Saraswati, 2012). Kualitas pupuk hayati dapat dipengaruhi oleh berbagai sebab. Menurut (Waluyo, 2007) ini dibagi dua faktor yakni faktor abiotik (alam dan kimia) dan faktor biotik (biologi). Selanjutnya menurut (Yuwono, 2006) kualitas pupuk hayati dipengaruhi oleh faktor lingkungan misalnya suhu, ph, dan kontaminan. Selain itu faktor eksternal juga sangat berpengaruh yakni: terhadap masa simpan, viabilitas, dan efektivitas induksinya terhadap tanaman. 2.2 Bradyrhizobium japonicum Bradyrhizobium japonicum adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang berukuran 0,5-0,9 x 1,2 x 3,0 µm, bersifat aerobik, serta tidak membentuk spora. Rhizobia penghasil basa ini membutuhkan waktu 3-5 hari untuk pertumbuhannya dalam medium cair dengan doubling time 6-7 jam. Genus ini termasuk anggota famili Rhizobiaceae, mampu mengikat nitrogen bebas dari udara melalui simbiosisnya dengan tanaman kedelai (Glycine max (L.) Merill). Selnya memiliki flagella pada bagian kutub atau subkutub (Jordan, 1984). Bradyrhizobium 5
6 japonicum sebagai mikroba kemoorganotrof, pada dasarnya dapat menggunakan berbagai karbohidrat, garam-garam mineral dan asam-asam organik (Allen and Allen, 1981). Kirchner, (1896) dan Jordan, (1982) menyatakan bahwa Bradyrhizobium japonicum memiliki kemampuan untuk menginfeksi akar tanaman kedelai dengan membentuk suatu organ yang disebut nodul infeksi tersebut diatur oleh serangkaian gen nodulasi yang akan menginduksi tanaman membentuk nodul. Selanjutnya, bakteri ini menginvasi tanaman lewat rambut akar dan berpenetrasi ke dalam jaringan. Simbiosis mutualisme terjadi di mana tanaman akan mendapat asupan nitrogen yang mampu ditambat oleh Bradyrhizobium japonicum. Sementara itu, tanaman menyediakan lingkungan yang kaya makanan berupa mineral, gula/karbohidrat untuk energi bagi kelangsungan hidup bakteri. Oleh karena itu Bradyrhizobium japonicum kini banyak dipakai sebagai pupuk hayati untuk mengurangi penggunaan pupuk sintetik. Menurut Kircner (1982), klasifikasi Bradyrhizobum japonicum adalah sebagai berikut : Kingdom : Bacteria Philum : Proteobacteria Klas : Alphaproteobacteria Ordo : Rhizobiales Famili : Bradyrizhobiaceae Genus : Bradyrhizobium Spesies : Bradyrhizobium japonicum
7 2.3 Peranan Bradyrhizobium japonicum Terhadap Tanaman Kedelai Bradyrhizobium japonicum merupakan kelompok bakteri berkemampuan sebagai penyedia hara bagi tanaman. Bila bersimbiosis dengan tanaman legum, kelompok bakteri ini menginfeksi akar tanaman dan membentuk bintil akar. Bintil akar berfungsi mengambil nitrogen di atmosfer dan menyalurkannya sebagai unsur hara yang diperlukan tanaman inang, pada bintil akar bagian yang paling berperan adalah pigmen merah leghemoglobin. Pigmen tersebut dijumpai dalam bintil akar antara bakteroid dan selubung membran yang mengelilinginya. Leghemoglobin berfungsi sebagai tempat absorbsi dan reduksi nitrogen, pembawa elektron khusus dalam fiksasi nitrogen, dan pembawa dari oksigen (Rao, 1994). Jumlah leghemoglobin di dalam bintil akar memiliki hubungan langsung dengan jumlah nitrogen yang difiksasi. Korelasinya positif, semakin banyak jumlah pigmen, semakin banyak nitrogen yang diikat. Bradyrhizobium japonicum bersosiasi dengan tanaman legum biasanya memfiksasi 100-300 kg N/ha dalam satu musim tanam. Nitrogen sebanyak itu tidak habis dimanfaatkan tanaman dalam satu periode tanam, sehingga dapat digunakan untuk masa tanam berkutnya. Bradyrhizobium japonicum mampu hidup pada tanah dengan ph 5 dan efektivitasnya mengikat nitrogen dari udara sangat tinggi pada tanaman kedelai (Rao, 1994). Untuk kacang kedelai, Bradyrhizobium japonicum diketahui dapat memberikan sumbangan N 2 terbesar dalam bentuk asam amino. Rahmawati (2005) menyatakan bahwa Bradyrhizobium japonicum yang berasosiasi dengan
8 legum mampu mencukupi 80 % kebutuhan nitrogen tanaman legum dan meningkatkan produksi antara 10 % - 25 %. Secara umum inokulasi dilakukan ke dalam tanah agar bakteri dapat berasosiasi dengan tanaman kedelai mengikat N 2 bebas diudara. Seringkali tanahtanah bekas inokulasi ataupun tidak bekas inokulasi dijadikan sumber inokulan, hal ini karena adanya anggapan bahwa didalam setiap tanah yang ditanami kedelai akan hidup bakteri Bradyrhizobium japonicum yang dapat dijadikan sumber inokulan (Freire et al., 1984). Keberhasilan penambatan N 2 udara oleh Bradyrhizobium japonicum tergantung pada interaksi antara faktor berikut : 1. Keserasian strain Bradyrhizobium japonicum dengan tanaman inang. 2. Kemampuan berkompetisi dengan Bradyrhizobium japonicum indigen. 3. Kemampuan tanaman inang untuk menyediakan nutrisi bagi Bradyrhizobium japonicum yang bersimbiosis dengannya. 2.4 Fiksasi Nitrogen Biologis Fiksasi nitrogen biologis merupakan proses simbiosis yang rumit antara tanaman legum dengan bakteri Bradyrhizobium japonicum. Proses fiksasi nitrogen yang berlangsung dalam bntil akar dapat terlaksana apabila tersedia energi yang dihasilkan oleh fotosintetis. Sebaliknya bintil akar kemudian mengirim senyawa nitrogen keseluruh jaringan tanaman (Gandanegara, 1987). Legum dengan bintil akar dapat memanfaatkan baik gas nitrogen dari udara maupun nitrogen anorganik dari dalam tanah, dalam ion amonium dan nitrat (Taiz and Zeiger, 1998).
9 Didalam tanah, bakteri Bradyrhizobium japonicum bersifat organotrof, aerob, bentuk batang ploemorfi, gram negatif, tidak berspora dan berflagella (1-6). Bakteri ini mudah tumbuh dalam media biakan khususnya yang mengandung ragi atau kentang. Suhu optimum 25-30ᵒC dengan ph optimum 7,0. Bakteri Bradyrhizobium japonicum bila masuk ke dalam sistem perakaran legum menyebabkan pembentukan bintil akar. Dalam bintil akar bakteri berubah bentuk menjadi bakteroid (bentuk L,V,Y,T,X). Bakteri dalam bentuk bakteroid dapat menambat nitrogen dari udara dengan bantuan enzim nitrogenase yang dibentuk bakteri. Bradyrhizobium japonicum yang tumbuh dalam bintil akar legum mengambil langsung nitrogen dari udara. Penyediaan hara nitrogen oleh Bradyrhizobium japonicum dapat mencapai 60-75% dari jumlah yang dibutuhkan tumbuhan (Handayanto, 2007). Penambatan nitrogen secara biologis diperkirakan lebih dari 170 juta ton nitrogen ke biosfer per tahun, 80 % di antaranya merupakan hasil simbiosis antara bakteri Bradyrhizobium japonicum dengan tanaman leguminosa. Simbiosis yang terjadi mampu memenuhi 50 % atau bahkan seluruh kebutuhan nitrogen tanaman yang bersangkutan dengan cara menambat nitrogen bebas. Di samping itu, bakteri Bradyrhizobium japonicum mempunyai dampak yang positif baik langsung maupun tidak langsung terhadap sifat fisik dan kimia tanah, sehingga mampu meningkatkan kesuburan tanah. Namun demikian, dalam kehidupannya bakteri Bradyrhizobium japonicum tersebut sangat dipengaruhi oleh kondisi tanah, terutama ph tanah, kondisi fisik, kimia serta biologi tanah (Purwaningsih, 2008).
10 Ada beberapa mekanisme masuknya Bradyrhizobium japonicum pada akar legum, mekasnisme tersebut adalah : 1. masuk ke dalam akar legum salah satunya melalui rambut akar sel korteks akar tanaman legum hal ini dikarenakan sel korteks mempunyai lubang yang berukuran besar dan mempunyai banyak makanan untuk Bradyrhizobium japonicum berupa pati. 2. Bradyrhizobium japonicum melempar sinyal berupa flavonoid, jika Bradyrhizobium japonicum cocok dengan jenis tanaman yang akan diinfeksi sesuai jenis tanaman simbiosisnya tanaman akan mengeluarkan sinyalnya berupa pusvol vinos peropad (PVP). 3. Infeksi benang masuk dan berpenetrasi ke dalam akar dari sel ke sel. Sel ini terbagi membentuk jaringan nodula dimana bakteria ini terbagi dan menggandakan diri. Batas pemisah berkembang, lokasi pusat dimana bakteria berada, jaringannya dinamakan zona bakteria yang ditandai dengan nodula dari bakteria yang menyerangnya, jaringan bebas dinamakan korteks nodula. Ukuran dan bentuknya bergantung pada spesies dan tanaman legumnya. 4. Bradyrhizobium japonicum berkembang didalam sel korteks akar tanaman dan mengakibatkan pembesaran sel korteks, pembesaran sel korteks tersebut dinamakan nodul (bintil akar)(handayanto, 2007). Bintil akar adalah hasil simbiosis tanaman dari jenis leguminosa dengan Bradyrhizobium japonicum yang mampu melakukan penambatan N 2. Bintil akar terbentuk melalui serangkaian proses yang diawali kolonisasi bakteri
11 Bradyrhizobium japonicum pada rambut akar tanaman polong. Kolonisasi bakteri Bradyrhizobium japonicum ini diduga bisa terjadi karena adanya suatu protein tanaman yang disebut "lektin" yang rnungkin berinteraksi dengan Bradyrhizobium japonicum spesifik sehingga memungkinkan tanaman untuk mengenal dan menerima tipe Bradyrhizobium japonicum yang cocok. Bradyrhizobium japonicum masuk tumbuhan inang melalui rambut akar yang kemudian berubah bentuk karena substansi seperti hormon yang dihasilkan oleh bakteri. Kemudian bakteri bermigrasi kedalam struktur seperti benang, memperbanyak diri yang pada akhirnya bakteri tersebut tersebar di sepanjang rambut akar sampai ke jaringan akar. Kolonisasi sel-sel akar dalam jaringan tanaman inang terjadi apabila bakteri dibebaskan dari benang infeksi dan hal ini melibatkan enzim pektinase dari Bradyrhizobium japonicum dan selulase dari sel tanaman. Dalam perkembangannya bakteri secara terus menerus mengalami modifikasi baik struktur maupun fungsi dan menjadi bakteroid yang kaya enzim nitrogenase, suatu enzim yang mampu mengikat/menambat nitrogen. Satu atau beberapa bakteroid dilindungi oleh struktur bermembran yang mungkin merupakan tempat terbentuknya pigmen merah, leghaemoglobin. Pigmen ini menentukan ciri warna bintil akar yang aktif menambat nitrogen (Kirchner, 1896 and Jordan, 1982). 2.5 Inokulasi Inokulasi dengan Bradyrhizobium japonicum merupakan upaya yang bertujuan untuk menyediakan strain Bradyrhizobium japonicum yang paling serasi pada penanaman sesuai jenis leguminosa. Kehadiran strain Bradyrhizobium japonicum yang serasi merupakan syarat utama untuk menjamin terbentuknya
12 bintil akar yang efektif. Hal ini akan tercapai jika faktor-faktor dalam tanah dan lingkungan turut mendukung. Inokulasi dengan Bradyrhizobium japonicum pada umumnya diperlukan untuk penanaman suatu jenis leguminosa (kedelai) ditanah yang baru untuk pertama kali ditanami tanaman tersebut, penanaman suatu jenis (varietas) leguminosa (kedelai) baru disuatu daerah sebagai inokulan digunakan strain-strain Bradyrhizobium japonicum yang paling serasi untuk jenis varietas tanaman tersebut, penanaman suatu jenis leguminosa pada tanah yang mengandung faktor-faktor yang menganggu perkembangan Bradyrhizobium japonicum dan bintil akar. Dalam hal ini, inolulasi merupakan upaya yang khusus yaitu berupa kombinasi yang terdiri dari pemberian inokulum Rhizobium dan penambahan bahan-bahan yang berpengaruh positif terhadap perkembangan Bradyrhizobium japonicum dalam rhizosfer (Yutono, 1985). Pemakaian Bradyrhizobium japonicum merupakan usaha untuk menambahkan bakteri Rhizobium ke dalam tanah yang sesuai untuk tanaman kedelai agar mampu menambah N 2 secara maksimal dari udara untuk memenuhi kebutuhan N tanaman dan selanjutnya dapat meningkatkan hasil biji kedelai. Keberhasilan pembentukan bintil akar serta kemampuan penembatan N 2 dari udara antara lain dipengaruhi oleh strain Bradyrhizobium japonicum, varietas yang digunakan keadaan fisik dan kimiawi tanah serta kondisi iklim (Freire et al,. 1977). Nasikah, (2007) menyatakan bahwa inokulasi Bradyrhizobium japonicum merupakan salah satu usaha untuk meningkatkan efektifitas nitrogen pada kacangkacangan. Tujuan dilakukanya inokulasi Bradyrhizobium japonicum pada biji
13 adalah karena tidak adanya spesies Bradyrhizobium japonicum, atau kalau terdapat sedikit jumlahnya sehingga tidak efektif. Inokulasi Bradyrhizobium japonicum pada kedelai juga bertujuan untuk menempatkan populasi Bradyrhizobium japonicum ke dalam tanah dalam jumlah cukup besar dan bertahan hidup sebagai sumber inokulum tanaman berikutnya. 2.6 Penyimpanan Mikroba Bradyrhizobium japonicum Penentuan teknik penyimpanan atau pengawetan mikroba memerlukan penelitian yang rumit, jangka waktu lama, dan pemantauan, serta dana yang besar. Hal ini berkaitan dengan tujuan utama preservasi, yaitu (1) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) dan (2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum (Surtiningsih et al., 2009). Namun demikian, saat ini berbagai teknik preservasi untuk berbagai mikroba telah tersedia dalam berbagai buku acuan, sehingga penggunanya tinggal mengadopsi teknologi tersebut sesuai dengan kebutuhannya. Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka panjang. Di antara teknik
14 tersebut ialah penyimpanan dalam minyak mineral, parafin cair, tanah steril, air steril, manik-manik porse (Surtiningsih et al., 2009). 2.7 Bahan Organik Bahan organik merupakan bahan dasar yang diambil dari alam dengan jumlah dan unsur hara yang bervariasi. Penggunaan bahan organik sebagai pupuk hayati dapat meningkatkan efisiensi pemakaian pupuk anorganik, karena pupuk hayati tersebut dapat meningkatkan air dan hara di dalam tanah, meningkatkan aktivitas mikroorganisme, mempertinggi kadar humus dan memperbaiki struktur tanah (Musnawar, 2005). Bahan organik berperan sebagai pengikat butiran primer menjadi butiran sekunder yang bertujuan membentuk agregat tanah yang baik. Hal ini berkaitan dalam penyimpanan air, aerasi tanah dan suhu tanah. Sehingga dapat mendukung kehidupan mikroba sebagai tempat berkembangbiak secara maksimal (Simanungkalit, 2006). Oleh sebab itu metode yang dikembangkan akhir-akhir ini untuk menyediakan kebutuhan hara bagi tanaman (khususnya legum) pada tanah adalah dengan menginokulasi benih dengan strain Bradyrhizobium japonicum yang tepat dan membentuk gentel atau pelapisan (bahan pembawa). Benih dilapisi dengan inokulum dari bahan pelapis atau bahan pembawa yang sudah ada jadi isolat Bradyrhizobium japonicum nya. Hal ini memacu pembentukan bintil akar, melindungi benih dan inokulum terhadap keasaman tanah. Sehingga mikroba tanah akan tetap hidup dan akan mempercepat pertumbuhan tanaman tersebut. Pengolesan biji yang diinokulasikan dengan bahan organik sebagai pelapis atau
15 bahan pembawa dapat meningkatkan kelestarian Bradyrhizobium japonicum pada biji (Rao, 2007). Moss Merupakan bahan organik sering digunakan sebagai media tanam untuk penyemaian yang berasal dari sisa akar tumbuhan. Media ini mempunyai banyak rongga sehingga memungkinkan akar tanaman tumbuh dan berkembang dengan leluasa. Menurut sifatnya, media moss mampu mengikat air dengan baik serta memiliki sistem drainase dan aerasi yang lancar sehingga cocok digunakan sebagai bahan pembawa untuk tempat bakteri berkembang (Marsono, 2005). Pupuk Kandang Merupakan bahan organik yang berasal dari kotoran hewan. Kandungan unsur haranya yang lengkap seperti natrium (N), fosfor (P), dan kalium (K) membuat pupuk kandang cocok untuk dijadikan sebagai media pembawa dalam menumbuhkan bakteri. Unsur-unsur tersebut penting untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri selama penyimpanan. Selain itu, pupuk kandang memiliki kandungan mikroorganisme yang diyakini mampu merombak bahan organik yang sulit dicerna tanaman menjadi komponen yang lebih mudah untuk diserap oleh tanaman. Pupuk kandang yang akan digunakan sebagai media pembawa harus yang sudah matang dan steril. Hal itu ditandai dengan warna pupuk yang hitam pekat. Pemilihan pupuk kandang yang sudah matang bertujuan untuk mencegah munculnya bakteri atau cendawan yang dapat merusak (Marsono, 2005). 2.8 Suhu Pertumbuhan Mikroba Pertumbuhan adalah pertambahan secara teratur semua komponen dari dalam sel hidup. Pada organisme multiseluler pertumbuhan adalah peningkatan
16 jumlah sel pada organisme. Pada organisme uniseluler pertumbuhan adalah pertambahan jumlah sel, yang berarti juga pertambahan jumlah mikroorganisme. Ukuran sel tergantung dari kecepatan pertumbuhan. Semakin baik zat nutrisi didalam substratnya mengakibatkan pertumbuhan sel semakin cepat dan ukuran sel semakin besar. Bakteri adalah sel prokariotik yang tumbuh dengan cara pembelahan biner. Kecepatan pertumbuhan mikroorganisme dipengaruhi nutrisi dalam medium, suhu, pengaruh aktifitas air, ph, dan oksigen (Suprihatin, 2010). Menurut Hajoeningtijas (2012), semua proses pertumbuhan bergantung pada reaksi kimiawi dan arena laju reaksi-reaksi ini dipengaruhi oleh suhu maka pola pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh suhu. Suhu juga mempengaruhi laju pertumbuhan dan jumlah total pertumbuhan organisme. Keragaman suhu dapat juga mengubah proses-proses metabolik tertentu serta morfologi sel. Mikroba dapat tumbuh pada kisaran suhu tertentu. Suhu merupakan faktor penting dalam kehidupan mikroba. Suhu pertumbuhan mikroba yaitu suhu minimum, maksimum, dan optimum. Suhu optimum adalah suhu yang paling baik untuk kehidupan mikroba. Suhu maksimum adalah suhu tertinggi. Suhu minimum adalah suhu yang paling rendah yang masih dapat menumbuhkan mikroba tetapi pada tingkat kegiatan fisiologi yang paling rendah (Hidayat et al., 2006). Suhu minimum pertumbuhan Rhizobium sekitar 3 0 C, sedangkan suhu optimal bagi kehidupan Rhizobium berkisar antara 18-26 0 C, dan suhu maksimal untuk pertumbuhannya adalah 45 0 C (Mahsunah, 2008).