III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Bahan Penelitian 3.1.1 Ternak Percobaan Ternak penelitian yang digunakan adalah ayam lokal yang diperoleh dari Jimmy Farm Cianjur. Pemeliharaan dimulai dari 0 sampai 12 minggu sebanyak 100 ekor. Ayam berumur 0 sampai 2 minggu diberi ransum yang sama, kemudian dari umur 2 sampai 12 minggu baru diberikan ransum perlakuan. Ayam ditempatkan secara acak ke dalam 20 unit kandang dengan masing-masing kandang berisi 5 ekor yang dihitung berdasarkan koefisien variasi sebesar 14,73% 3.1.2 Kandang Kandang yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang sistem litter yang terbuat dari bahan bambu dan kawat berukuran 75 cm x 75 cm x 75 cm. setiap kandang dilengkapi dengan tempat pakan (round feeder) dan tempat minum (round waterer). 3.1.3 Ransum Penelitian ini menggunakan 5 perlakuan ransum dengan tingkat energi dan protein yang berbeda. Ransum yang digunakan adalah ransum hasil formulasi yang diberikan dalam bentuk mash, bahan pakan diperoleh dari Missouri Bandung. Bahan pakan penyusun ransum antara lain: jagung, dedak halus, bungkil kedelai, CaCO3, topmix, tepung ikan, tepung tulang, minyak kelapa. Adapun analisis kandungan zat makanan dan energi metabolis bahan pakan, susunan ransum penelitian dan
kandungan nutrien dan energi metabolis ransum penelitian disajikan pada Tabel 1, Tabel 2 dan Tabel 3. Tabel 1. Kandungan Zat Bahan Pakan dan Energi Metabolis Bahan Pakan Penelitian Bahan Pakan PK Ca P Lysin Metionin EM -------------------------%-------------------------- (kkal/kg) Tepung ikan 65,00 4,00 2,60 6,50 1,63 2830 Bungkil kedelai 48,00 0,32 0,29 2,90 0,65 2240 Jagung kuning 8,60 0,02 0,10 0,20 0,18 3370 Dedak halus 12,00 0,12 0,21 0,71 0,27 1630 CaCO3 0,00 40,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Tepung tulang 0,00 23,30 18,00 0,00 0,00 0,00 Minyak kelapa 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8600 Topmix 0,70 0,00 0,00 0,40 0,30 0,00 Sumber: Milton L. Scott (1976) Tabel 2. Susunan Ransum Penelitian Bahan Pakan R1 R2 R3 R4 R5...%... Tepung ikan 8,00 10,50 11,50 7,50 10,50 Bungkil kedelai 4,75 7,00 11,50 6,50 8,00 Jagung kuning 58,00 55,25 52,75 64,00 61,00 Dedak halus 27,50 25,50 22,50 19,00 17,50 CaCO 3 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Tepung tulang 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 Minyak kelapa 0,00 0,00 0,00 1,25 1,25 Topmix 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Jumlah 100 100 100 100 100 Keterangan : Hasil perhitungan menggunakan aplikasi winfeed Tabel 3. Kandungan Nutrien dan Energi Ransum tiap Perlakuan Zat Makanan R-1 R-2 R-3 R-4 R-5 Keperluan* Protein Kasar (%) 15,08 17,04 19,03 15,05 17,02 15-17** Lemak Kasar (%) 6,66 6,54 6,19 7,01 6,99 7,0** Serat Kasar (%) 4,89 4,75 4,62 4,09 3,97 3,0-6,0* Kalsium (%) 1,05 1,25 1,34 1,01 1,24 0,9-1,1* Posphor (%) 0,58 0,67 0,72 0,55 0,67 0,45**
Lysin (%) 0,97 1,18 1,35 0,94 1,16 0,8-1,0* Methionin (%) 0,35 0,40 0,44 0,35 0,40 0,38-0,42* Energi Metabolis 2755 2754 2752 2951 2948 2750* (kkal/kg) *) Widodo (2010) **) Sinurat (2000) 3.1.4 Alat dan Bahan yang Digunakan A. Alat 1. Vaccuteiner ber-edta 5 ml untuk menyimpan darah agar tidak cepat membeku. 2. Needle untuk mengambil darah sebanyak 5 ml. 3. Spectrophotometer untuk mengukur hasil absorban yang diperoleh dari campuran larutan dan darah. 4. Gelas ukur untuk menempatkan aquadest dan larutan yang akan dimasukan kedalam tabung. 5. Pipet tetes untuk mengambil larutan dari gelas ukur dan memasukkannya kedalam tabung 6. ph meter untuk mengecek ph larutan yang dibuat. 7. Alat Sentrifugasi untuk memisahkan larutan dan darah. 8. Kertas label untuk menandai ransum perlakuan. 9. Timbangan analitik kapasitas 5 kg untuk menimbang bobot badan ayam dan ransum. 10. Wingtag 100 buah untuk menandai ternak percobaan. B. Bahan : 1. Darah
2. Desinfektan (Alkohol 70%) 3. Aquadest 4. HCl 1 N 5. NaCl 9 gram 6. NaH 2 PO 4.H 2 O 0,215 gram 7. Na 2 HPO 4 1,365 gram 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Prosedur Penelitian 1. Tahap Persiapan Tahap persiapan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan selama penelitian berlangsung. Kandang dibersihkan, fumigasi dan sanitasi kandang terlebih dahulu dengan cara pengapuran dinding dan lantai serta penyemprotan dengan menggunakan desinfektan agar bakteri maupun virus penyebab penyakit yang ada pada pemelihaan sebelumnya mati. 2. Tahap Adaptasi Ayam yang berumur 0 minggu hingga 2 minggu diberi wingtag dan pakan komersil. Setelah berumur 2 minggu, ayam ditimbang bobot badannya dan dipisahkan sesuai dengan data perhitungan koofisien variasinya yang bertujuan untuk menyamaratakan bobot dan konsumsi ransum setiap ekor. 3. Tahap Penelitian a. Ayam yang diberi tahap perlakuan adalah ayam yang berumur 3 minggu yang sebelumnya telah diadaptasikan. Tempat minum dicuci setiap hari
menggunakan antiseptik agar tidak kotor serta tidak menimbulkan jamur dan bakteri. b. Penimbangan dilakukan setiap 1 minggu sekali untuk mengetahui pertambahan bobot badan dan jumlah ransum yang dikonsumsi. 4. Tahap Pengumpulan Data Pengambilan Sampel Darah a. Sebanyak 20 ekor ayam lokal Jimmy Farm berumur 12 minggu dipersiapkan. b. Mengambil darah sebanyak 3 ml pada bagian vena pektoralis eksterna yang terdapat dibawah sayap dan dibersihkan menggunakan alkohol 70%. c. Darah tersebut harus segera dimasukkan ke dalam vaccuteiner yang mengandung antikoagulan EDTA untuk mencegah proses pembekuan darah. d. Vaccuteiner dimasukan ke dalam cooling box pada saat akan dibawa ke laboratorium. Penentuan Nilai Kerapuhan Sel Darah Merah Prosedur penentuan nilai kerapuhan sel darah merah menggunakan metode Johnson Oyewalle (1992). a. Membuat larutan buffer saline NaCl 10% dengan cara menimbang NaCl, NaH 2 PO 4 dan Na 2 HPO 4 ditimbang menggunakan neraca analitik dan dimasukkan kedalam beaker glass. Larutkan dengan aquadest hingga 100 ml. b. Membuat larutan pokok NaCl 1% dengan cara melarutkan 5 ml buffer saline 10% dengan aquadest hingga 50 ml. Sesuaikan dengan ph 7.4 dengan cara menambahkan larutan HCl 1% hingga ph sudah mendekati.
c. Menyediakan tabung sebanyak 14 buah lalu dibuat pengenceran bertingkat larutan NaCl dengan konsentrasi 0.90%, 0.85%, 0.80%, 0.75%, 0.70%, 0.65%, 0.60%, 0.55%, 0.50%, 0.45%, 0.40%, 0.30%, 0.20%, 0.10% serta membuat blanko dari larutan berkonsentrasi 0.90% dan 0.85%. d. Memasukkan darah kedalam tabung yang berisi larutan yang telah dibuat sebanyak 50 µl. Tutup dan homogenkan. e. Campuran darah dan larutan yang sudah di homogenkan kemudian di diamkan selama 30 menit. f. Setelah itu tabung di sentrifugasi selama 5 menit dengan menggunakan alat sentrifuge berkecepatan 3000 rpm. g. Mengukur absorbans dari supernatant pada panjang gelombang 540 nm dengan menggunakan spectrophotometer. h. Mencatat angka yang tercantum pada layar spectrophotometer dan dibuatkan kurvanya. Menghitung Total Protein Darah Prosedur perhitungan total protein darah menggunakan Biolabo Reagents. a. Menyediakan tabung sebanyak 22 buah yang terdiri dari 20 sampel, 1 blanko dan 1 standar. b. Memaasukkan 60 µl plasma darah serta tambahkan 3 ml reagen kedalam tabung sampel dan beri label. c. Menghangatkan sampel dengan menggunakan penangas bersuhu 37 C selama 10 menit.
d. Mengukur absorbans pada panjang gelombang 570 nm dengan menggunakan spectrophotometer. e. Mencatat angka yang tercantum pada layar spectrophotometer dan dibuatkan kurvanya 3.2.2 Peubah yang Diamati dan Pengukuran Peubah yang diamati pada penelitian ini adalah : a. Penentuan Nilai Kerapuhan Sel Darah Merah Kerapuhan sel darah merah menggunakan metode Johnson Oyewalle (1992) dimana dalam metode ini berdasarkan tekanan osmosis larutan, apabila darah berada dalam keadaan isotonis berarti darah dapat mempertahankan bentuknya sehingga tidak mengalami kerapuhan. Berbeda halnya bila keadaan larutan hipertonis dan hipotonis maka sel darah merah tidak bisa mempertahankan keutuhan selnya sehingga terjadilah kerapuhan. Pemberian imbangan energi protein dalam ransum ini diharapkan membran sel darah merah dapat mempertahankan keutuhan selnya dan tidak mudah rapuh dalam kondisi hipotonis atau hipertonis. % hemolisis = a. Menghitung Total Protein Darah Pengukuran total protein darah menggunakan Biolabo Reagents dengan prinsip uji biuret dimana uji ini berdasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks biru-ungu yang terjadi bila protein bereaksi terhadap tembaga dan lingkungan alkali diharapkan dengan pemberian protein dalam ransum dapat meningkatkan total protein dalam darah.
Protein total = 3.2.3 Rancangan Percobaan dan Analisis Statistik Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri atas 5 perlakuan yaitu: 1. R1 = Protein 15% dan energi metabolis (EM) 2750 kkal/kg 2. R2 = Protein 17% dan energi metabolis (EM) 2750 kkal/kg 3. R3 = Protein 19% dan energi metabolis (EM) 2750 kkal/kg 4. R4 = Protein 15% dan energi metabolis (EM) 2950 kkal/kg 5. R5 = Protein 17% dan energi metabolis (EM) 2950 kkal/kg Data yang diperoleh diuji dengan menggunakan analisis ragam. Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ij = µ + i + ij Keterangan : = Variabel respon hasil pengamatan yang mendapat perlakuan ke-i, ulangan ke-j = Nilai Tengah Populasi = Efek perlakuan ke-i i = Perlakuan ke-i (1,2,3,4,5) j = Ulangan ke-j (1,2,3,4) Kekeliruan, berupa efek acak yang berasal dari unit eksperimen ke-j karena dikenai perlakuan ke-i Asumsi : 1. Nilai ij menyebar normal satu sama lain 2. Nilai harapan dari ij = 0 2 2 3. Ragam dari ij = Jadi, ij NID (0, )
Tabel 4. Tabel Sidik Ragam Sumber DB JK KT Fhit F 0,05 Keragaman Perlakuan (t-1)= 4 JKP KTP 3.05557 Galat t(r-1)= 15 JKG KTG Total (tr-1)= 19 JKT Keterangan: T = Perlakuan JKP = Jumlah Kuadrat Perlakuan R = Ulangan JKG = Jumlah Kuadrat Galat DB = Derajat Bebas JKT = Jumlah Kuadrat Total JK = Jumlah Kuadrat KTP = Kuadrat Tengah Perlakuan KT = Kuadrat Tengah KTG = Kuadrat Tengah Galat Hipotesis : H 0 : P1 = P2 = P3 = P4 = P5 ; perlakuan tidak berpengaruh terhadap respon yang diamati H 1 : P1 P2 P3 P4 P5 ; paling sedikit ada sepasang perlakuan yang tidak sama µ j µ i Kaidah Keputusan : 1. Jika F hitung F tabel 0,05 artinya tidak berbeda nyata (non significant), terima H 0 dan tolak H 1 2. Jika F hitung F tabel0,05 artinya berbeda nyata (significant), tolak H 0 dan terima H 1 Bila ditolak, maka dilakukan pengujian perbedaan antara perlakuan dengan Uji Duncan, yang rumusnya sebagai berikut: S = LSR α = SSRα. S Keterangan: S = Standar Error LSRα = Least Significant Range KTG = Kuadrat Tengah Galat SSRα = Studentized Significant Range
r = Banyaknya Ulangan Apabila selisih antara perlakuan (d) dibandingkan dengan LSRα, kaidah keputusannya adalah sebagai berikut: 1. Bila d LSRα: (perlakuan tidak berbeda nyata) 2. Bila d > LSRα: (perlakuan berbeda nyata)