PERSIAPAN MEDIA DAN LARUTAN PENGENCER\ Tujuan: 1. Mengetahui media kultur dan larutan pengencer yang digunakan dalam pekerjaan-pekerjaan mikrobiologi serta dapat membuatnya secara aseptik. 2. Untuk mensucihamakan dan membasmi mikroba-mikroba yang terdapat di media umum. A. Prinsip/Teori Singkat Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan lingkungan hidupnya. Media kultur berdasarkan konsistensinya dibedakan atas tiga macam, yaitu: a) Media cair (liquid medium) adalah medium berbentuk cair yang dapat digunakan untuk tujuan menumbuhkan atau membiakan mikroba, penelaah fermentasi, uji-uji lain Contohnya : Nutrient Broth (NB), Lactose Broth (LB) dan kaldu sapi. b) Media semi padat (semi solid medium), biasanya digunakan untuk uji mortalitas (pergerakan) mikroorganisme dan kemampuan fermentasi, Contohnya : Agar dengan konsentrasi rendah 0,5%. c) Media padat (solid medium) adalah medium yang berbentuk padat yang dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba dipermukaan sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung dan diisolasi. Contohnya: Nutrient Agar (NA), Plate Count Agar (PCA), Potato Dextrose Agar (PDA), gelatin, silika gel dan beberapa limbah pertanian berbentuk padat. Media berdasarkan fungsinya, yaitu: a) Media diperkaya (enriched medium) adalah medium yang ditambah zatzat tertentu (serum, darah, ekstrak tumbuhan dan lain-lain), digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof. b) Media selektif (selective medium) adalah media yang ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu, misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu, dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi bakteri gram negatif. Contohnya : Endo Agar, EMB(Eosin Metilena Biru) Agar SSA (Salmonella Shygella Agar) VRB (Violet Red Bile Agar) c) Media diferensial (deferential medium) adalah media yang ditambahkan zat kimia tertentu yang menyebabkan mikroba membentuk pertumbuham atau mengadakan perubahan tertentu hingga dapat membedakan tipenya. Contohnya : TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
d) Media penguji (assay medium) adalah media dengan susunan tertentu digunakan untuk pengujian-pengujian vitamin, asam amino, antibiotik dan lain-lain. e) Media untuk perhitungan jumlah adalah media spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba Contohnya : Plate Count agar (PCA). Syarat-syarat yang perlu diperhatikan dalam pembuatan Larutan pengencer/ larutan fisiologis adalah larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh pada analisis mikrobiologi. Pengenceran dilakukan untuk memperoleh contoh dengan jumlah mikroba terbaik untuk dapat dihitung yaitu antara 30 sampai 300 sel mikroba per ml. Pengenceran biasanya dilakukan 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. B. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain : 1. Tabung reaksi bertutup dan tanpa tutup 2. Sumbat tabung (kapas) 3. Rak tabung 4. Cawan petri 5. Pembakar Spirtus 6. Erlenmeyer 100ml 7. Hot Plate 8. Spatula 9. Inkubator 10. Autoklaf 11. Tabung Durham Bahan-bahan yang digunakan antara lain : 1. Media Nutrient Agar (NA) 2. Plate Count Agar (PCA) 3. Potato Dextrose Agar (PDA) 4. Nutrient Broth (NB) 5. NaCl C. Prosedur singkat Pembuatan Media PDA 1. Ditimbang 4.9 gram PDA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 2. Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan. Pembuatan Media PCA 1. Ditimbang 2.35 gram PCA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer
2. Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan. Pembuatan Media NA 1. Ditimbang 2.3 gram NA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 2. Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan. Pembuatan Media NB 1. Ditimbang 0.8 gram PDA dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 2. Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan Pembuatan Larutan Fisiologis 1. Ditimbang 0.8 gram NaCl dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 2. Dilarutkan dengan 100ml air, lalu dihomogenkan Penuangan Media Setelah media disterilisasi, media dituangkan sesuai prosedur berikut : o o Agar cawan 1. Disiapkan media PCA 2. Pembakar spirtus 3. Didekatkan api media PCA/ PDA dituangkan kedalam cawan petri sampai merata. 4. Cawan petri diputar membentuk angka 8, didiamkan sampai padat. Untuk media PCA prosedur sama dengan prosedur di atas. Agar tegak 1. Disiapkan media NA 2. Pembakar spirtus 3. Didekatkan api media NA dituangkan kedalam tabung reaksi se sampai merata. 4. Didiamkan sampai padat. Untuk media PDA prosedur sama dengan prosedur di atas.
o o Agar miring 1. Disiapkan media NA 2. Pembakar spirtus 3. Didekatkan api media NA dituangkan kedalam tabung reaksi se sampai merata. 4. Dimiringkan, didiamkan sampai padat. Untuk media PDA prosedur sama dengan prosedur di atas. Medium cair berisi tabung durham 1. Disiapkan media NB 2. Pembakar spirtus 3. Didekatkan api media NB dituangkan kedalam tabung reaksi sampai merata. 4. Dimasukan tabung Durham yang sudah disterilkan dengan bantuan pinset. Kemudian media diinkubasi selama 24 jam dalam incubator. D. Data Pengamatan/ Gambar PDA
PCA NA NB E. Pembahasan.Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh dan sesuai dengan lingkungan hidupnya. Berdasarkan hasil yang dilakukan diperoleh hasil bahwa sebagian besar media telah terkontaminasi oleh mikroorganisme. Padahal semua media belum dibiakan mikroorganisme dan semua alat serta bahan (media) sudah disterilkan. Berdasarkan pengamatan diperoleh hasil sebagai berikut: a. PDA
Agar tegak Media berubah warna menjadi lebih keruh, dan pada bagian atasnya terdapat mikroorganisme yang berwarna putih. Agar cawan - Pada cawan pertama, terdapat mikroorganisme yang terletak pada bagian pinggir dan tengah media yang berbentuk bulat kecil-kecil yang membentuk koloni tertentu yang ukurannya hampir sama satu dengan yang lainnya. - Pada cawan kedua, sebanyak ±80% media terkontaminasi mikroorganisme yang saling menyatu. - Pada cawan ketiga, sebanyak ±90% media terkontaminasi mikroorganisme yang saling menyatu. Agar miring - Media tidak terkontaminasi mikroorganisme. b. PCA Pada semua cawan terkontaminasi oleh mikroorganisme yang berwarna putih, berbentuk bulat,serabut dan berkoloni. c. NA Semua media berubah warna menjadi lebih keruh dan terkontamisasi oleh mikroorganisme yang berbentuk bulat. d. NB Semua media yang dimasukan kedalam tabung reaksi terkontaminasi oleh mikroorganisme, karena terdapat gelembung udara pada setiap tabung durham. Faktor yang dapat menyebabkan terdapatnya mikroorganisme pada media adalah udara, temperatur dan kelembaban yang ada di lingkungan sekitar praktikum. Untuk mencegah terkontaminasinya media oleh mikroorganisme, maka sebaiknya hal-hal yang perlu diperhatikan: 1. Mencuci tangan dan rambut sebelum praktikum. 2. Menggunakan jas lab dan sarung tangan yang steril. 3. Sebelum dan sesudah praktikum meja kerja dan tangan disemprotkan alkohol 70%. 4. Menggunakan alat dan bahan yang sudah disterilkan. 5. Tidak banyak bercanda dan ngobrol saat praktikum berlangsung. 6. Menggunakan masker. 7. Bekerja didekat zona steril (pembakar spirtus). Pada percobaan agar miring mikroba terlihat lebih jelas dibandingkan dengan percobaan agar tegak, hal ini disebabkan karena fungsi agar miring adalah untuk mengamati jumlah mikroba, dalam jumlah yang banyak dan jelas. Sedangkan fungsi agar tegak adalah untuk mengamati jumlah mikroba, dalam jumlah yang sedikit dan hanya terlihat penampang atas atau luarnya saja. F. KESIMPULAN
.Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh dan sesuai dengan lingkungan hidupnya. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh hasil bahwa dari 15 pengamatan (cawan dan tabung yang berisi media yang sudah disterilkan) yang terkontaminasi oleh mikroorganisme sebanyak 93.33%, sedangkan yang tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme sebanyak 6.67% (hanya 1 buah agar miring dengan PDA didalamnya). Untuk mencegah terkontaminasinya media oleh mikroorganisme, maka sebaiknya hal-hal yang perlu diperhatikan: 1. Mencuci tangan dan rambut sebelum praktikum. 2. Menggunakan jas lab dan sarung tangan yang steril. 3. Sebelum dan sesudah praktikum meja kerja dan tangan disemprotkan alkohol 70%. 4. Menggunakan alat dan bahan yang sudah disterilkan. 5. Tidak banyak bercanda dan ngobrol saat praktikum berlangsung. 6. Menggunakan masker. 7. Bekerja didekat zona steril (pembakar spirtus). DAFTAR PUSTAKA Ardiansyah. 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Bogor : Universitas Djuanda. Dwidjoseputro.1964.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Malang : Djambatan Mulyana, dkk. 1992. Penuntun Praktikum Dasar-Dasar Mikrobiologi. Bogor : Universitas Djuanda. Yanny Priantieni, E. 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Bogor : SMAKBO. MEDIA DALAM ANALISIS MIKROBIOLOGIS II Macam-Macam Media Pertumbuhan 1. Medium berdasarkan sifat fisik Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.. Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen,
misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). 2. Medium berdasarkan komposisi Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract. 3. Medium berdasarkan tujuan Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar. Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll. Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadangkadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron
Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni..