HALAMAN PENGESAHAN Nama Mahasiswa : Melinda Oktafiani No. Pokok Mhs : 1114111034 Fakultas Judul Praktikum Tempat : Pertanian : Penghitungan Jumlah Bekteri : Laboratorium Budidaya Perairan Waktu Praktikum : Selasa, 23 Oktober 2012 Kelompok : 3 (Tiga) Bandar Lampung, 30 Oktober 2012 ---------------------------------------------- Catatan Nilai
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI AIR (BDI 206) PENGHITUNGAN JUMLAH BAKTERI Disusun Oleh : Melinda Oktafiani (NPM. 1114111034) Jurusan Budidaya Perairan/Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Lampung 2012 Abstrak Sebuah praktikum tentang penghitungan jumlah bakteri telah dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung pada tanggal 23 Oktober 2012. Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui berbagai cara menghitung jumlah sel dari biakan suatu bakteri. Cara yang digunakan adalah metode standar plate count dan analisa spektrofotometer (turbidimeter). Metode plate count standar terdiri dari pengenceran sampel dengan PBS (phosphate buffer saline) steril. Pada metode turbidimetri digunakan spektrofotometer dengan mentransmisikan menurun sejumlah cahaya ketika populasi sel meningkat. Cahaya yang ditransmisikan akan diubah menjadi energi listrik dan kemudian diindikasikan pada sebuah galvanometer. Pembacaan menggunakan metode spektrofotometer ini lebih cepat daripada standar plate count tetapi terbatas karena tingkat sensitifitasnya dibatasi untuk suspensi bakteri 10 7 sel atau lebih. Hasil dari praktikum ini tidak bisa dihitung karena jumlah bakteri yang tumbuh lebih banyak dibanding jumlah yang dapat dihitung. Jumlah koloni yang dapat dihitung berkisar 30-300 koloni, namun hasil menunjukkan bakteri yang tumbuh jauh lebih banyak dan terlalu dekat sehingga sulit untuk dibedakan sebagai coloni-forming unit (CFU). Hal ini dapat terjadi karena miscalculation dalam proses pengenceran. Kata kunci : spektrofotometer, CFU, PBS, standar plate count, suspense A. PENDAHULUAN Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2 macam cara perhitungan jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung. Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup sedangkan perhitungan jumlah miroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan
jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang digunakan. Untuk menentukan jumlah miroba yang hidup dapat dilakukan setelah larutan bahan atau biakan mikroba diencerkan dengan faktor pengenceran tertentu dan ditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu tergantung dari macam dan sifat-sifat mikroba. Banyak metode yang digunakan dalam menaksir secara kuantitatif dari suatu populasi bakteri. Namun, ada dua metode yang paling sering digunakan yaitu metode hitung koloni di cawan petri (standard/viable plate count method) dan analisa spektrofotometer (turbidimeter). Meskipun kedua metode tersebut kadang akan menghasilkan hasil perhitungan yang mirip, tetapi keduanya memiliki perbedaan prinsip. Untuk metode plate count merupakan metode penaksiran jumlah kepadatan bakteri secara tidak langsung dan informasi yang didapatkan hanya bakteri yang hidup (viable) saja, bakteri yang mati tidak ikut terhitung. Sedangkan prinsip analisa spektrofotometer didasarkan pada kekeruhan dan menghitung seluruh sel bakteri baik yang hidup maupun yang mati (Setyawan dan Harpeni, 2012). B. TINJAUAN PUSTAKA Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua cara penghitungan bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sedrhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan secara tidak langsung hanya mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya ada beberapa cara yaitu: 1. Perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC 2. Perhitungan melalui pegenceran 3. Perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode) 4. Calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Anonim, 2012). Metode standar/viable plate count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah
diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut (Anonim, 2012). Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi 30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan bersangkutan. Gambar : Pengerjaan Perhitungan Koloni dengan Total Plate Count (TPC) Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer) (Anonim, 2012). Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan cara menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Contohnya
suatu sampel pada suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam sppesies diencerkan dalam suatu taung tersendiri. Enceran ini kemudian diambil barang 1 ml untuk diencerkan lagi ke tabung yang berisi pelarut. Enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut (Dwidjoseputro, 1994). Jumlah terbaik yang digunakan untuk perhitungan mikroba antara 30-300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal (Purwoko, 2007). C. MATERI DAN METODE Praktikum ini dilakukan pada pukul 11.30 WIB di Laboratorium Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung pada tanggal 23 Oktober 2012. Alat dan bahan yang digunakan untuk praktikum ini adalah sampel bakteri yang telah dibiakkan pada media, Plate Count Agar (PCA) dalam tabung reaksi, petri dish, Phospate Buffer Saline (PBS), larutan standard Mc. Farland, spektrofotometer, mikro pipet, Bunsen, alcohol, kertas label, tabung reaksi, penangas air, kertas pembungkus dan kalkulator Casio. Praktikum ini melalui beberapa tahap yaitu Sandar Plate Count dan Metode Turbidimetri. Adapun prosedur kerja praktikum ini sebagai berikut: 1. Standar Plate Count Pada penghitungan menggunakan Standar Plate Count, langkah pertama ialah mengencerkan tabung PCA dalam air mendidih. Kemudian mendinginkan agar dalam penangas air (50 0 C) selama 5-10 menit. Lalu menuangkan air ke dalam petridish dan dibiarkan membeku (10-15 menit). Kemudian menandai petri dengan nama dan tingkat pengenceran. Selanjutnya, membuat seri pengenceran 10-1 - 10-3 dari sampel bakteri. Dengan menggunakan mikro pipet, mengambil 0,1 cairan dari masingmasing pengenceran ke dalam petridish yang sesuai. Gunakan spreader untuk meratakan suspense di atas permukaan lempengan agar. Kemudian membungkus petridish dengan kertas pembungkus dam memasukkan ke dalam incubator 35 0 C dalam posisi terbalik, menginkubasi selama 24-48 jam. Langkah selanjutnya adalah menghitung koloni pada petri yang mempunyai kisaran 30 300 koloni. Menghitung jumlah bakteri hidup dengan cara mengalikan faktor pengenceran yang digunakan denan 10 (karena volume suspense bakteri yang dimasukkan ke dalam petri hanya 0,1 ml). Hasil akhir pengalian
merupakan jumlah bakteri yang hidup dalam satuan colony-forming unit/ml (CFU/ml). 2. Metode Turbidimetri Pada pelaksanaan penghitungan jumlah bakteri menggunakan metode turbidimetri, langkah pertama adalah membuat larutan standar Mc. Farland. Kemudian menyalakan alat spektrofotometer (dengan mengikuti panduan penggunaan alat). Lalu mengukur absorbansi dari masingmasing larutan Mc. Farland pada panjang gelombang 550 600 nm. Selanjutnya membuat kurve regresi dimana Y = kepadatan bakteri (sel/ml) dan X = Absorbansi (menggunakan kalkulator Casio). Setelah itu mengukur suspense bakteri pada panjang gelombang 550 600 nm. Terakhir memasukkan hasil absorbansi suspense bakteri ke dalam rumus regresi, hasilnya adalah jumlah kepadatan semua sel bakteri dalam suspense dengan satuan sel/ml. D. HASIL DAN PEMBAHASAN Berikut hasil yang didapat dari praktikum penghitungan jumlah bakteri: No Nama Sampel Pengenceran Jumlah Bakteri (CFU/ml) 1 Air Laut 2 Air PDAM 3 Air Sumur 4 Air Kolam 5 Air Tambak Udang
6 Air kolam Lele 7 Akuarium Air Tawar Pada praktikum ini didapatkan hasil biakan yang terlalu banyak sehingga tidak dapat dihitung. Hal ini terjadi karena miscalculation dalam volume pengenceran Plate Count Agar (PCA). Dalam pengenceran hanya menggunakan seri pengenceran 10-1 10-3, seharusnya masih dapat dilakukan pengenceran sampai 10-6 sehingga diperoleh biakan yang tidak terlau rapat dan banyak. Seharusnya dalam satu petridish, jumlah koloni yang dapat dihitung berkisar 30-300 koloni. Jika kurang dari 30 koloni maka tidak dapat diterima untuk alasan statistik dan jika lebih dari 300 koloni pada cawan petri maka ada kemingkinan ada koloni yang tetrlau dekat satu dengan lainnya untuk dibedakan sebagai colony-forming unit (CFU). Karena terlalu banyak koloni yang tumbuh maka hasil tidak bisa dihitung. Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan cara menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Pengenceran bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan dari suatu bahan agar setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh jumlahnya dapat dihitung dengan mudah. Jumlah koloni yang muncul setelah masa inkubasi paling baik yaitu antara 30-300 koloni (Dwidjoseputro, 1993). Perbandingan dalam melakukan pengenceran yang dilakukan adalah 10-1, 10-2 dan 10-3. Larutan yang digunakan untuk melakukan pengenceran adalah Phosphate buffer saline (PBS). Pengenceran pada sampel dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 0,5 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media agar steril hangat dengan suhu antara 40 50 C, kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator bersuhu 37 C selama 1 2 hari dengan posisi terbalik (Megamii, 2009).
Cara perhitungan kuantitas/densitas sel bakteri pada kultur cair yang paling umum adalah dengan menggunakan nilai kekeruhan suspensi sel yang didapatkan dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer. Sel bakteri dihitung dengan panjang gelombang 600 nm dan nilai absorbansi yang muncul kemudian dikonversi untuk mendapatkan nilai densitas sel bakteri dalam kultur. Gambar : Skema kerja Spektrofotometer Cara perhitungan menggunakan spektrofotometer dimulai dengan membuat larutan Mc. Farland kemudian memasukkan larutan ke dalam spektrofotometer. Dengan menggunakan spektrofotometer, sejumlah cahaya yang ditransmisikan menurun ketika populasi sel meningkat. Cahaya yang ditransmisikan akan diubah menjadi energy listrik, dan kemudian diindikasikan pada sebuah galvanometer. Pembacaan secara tidak langsung mencerminkan jumlah bakteri. Kemudian dihitung dengan persamaan MC. Farland: Y = 2,62 x 10 9 µ - 6,39 x 10 7 Dengan y = kepadatan (CFU/ml) dan µ = adsorbs (Å) CFU/ml = jumlah koloni x x Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFU s/volume atau berat. CFU s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit s yang artinya unit-unit atau satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal yang mempunyai cirri khas masing-masing. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada
jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, sarcin sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel. Pada praktikum penghitungan jumlah bakteri ini semua hasil pengenceran bakteri tidak bisa dihitung karena dalam proses pengenceran ternyata larutan masih terlalu pekat sehingga bakteri yang dihasilkan melebihi batas yang bisa dihitung. Dalam pengenceran menggunakan pengenceran sampel 10-1, 10-2, 10-3, seharusnya pengenceran yang dilakukan dapat mencapai 10-6, dengan begitu bakteri yang dihasilkan tidak terlalu banyak. Larutan berisi bakteri yang dibiakkan dengan kepadatan yang cukup tinggi akan menghasilkan biakan bakteri yang lebh banyak. Oleh karena itu, untuk mendapatkan hasil yang lebih optimal maka sebaiknya seri pengenceran lebih kecil. E. KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat ditarik keksimpulan sebagai berikut: Metode yang dapat digunakan untuk menghitung bakteri antara lain metode standard plate count dan metode spektrofotometer (turbidimetri). Metode standard plate count terdiri dari pengenceran sampel dengan PBS (phosphate buffer saline) steril hingga bakteri cukup untuk dihitun secara akurat. Metode turbidimeter menggunakan alat yaitu spektrofotometer yang didasarkan pada kekeruhan larutan. Terjadi kesalahan dalam proses pengenceran sehingga jumlah biakan yang dihasilkan terlalu banyak dan tidak dapat dihitung. Diperlukan ketelitian dan perhitungan yang akurat sebelum melakukan penegenceran dan saat akan melakukan perhitungan bakteri.
Adapun saran yang dapat disampaikan untuk praktikum kali ini adalah agar praktikan lebih teliti dalam melakukan pengenceran dan sebaiknya sebelum praktikum telah diadakan percobaan terlebih dahulu agar mendapatkan hasil yang lebih optimal. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2012. Tes Jurnal Praktikum Mikrobiologi. http://artikelteknikkimia.blogspot.com. Diakses tanggal 27 Oktober 2012. Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Megamii. 2009. Pemeriksaan Bakteri Secara Makroskopis. http://megamii.wordpress.com. Diakses tanggal 27 Oktober 2012. Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Jakarta: Bumi Aksara.