PEWARNAAN HAPUSAN DARAH TEPI Oleh, Kelompok 2: I Dewa Ayu Megarani (P07134012003) Ni Wayan Nursilayani (P07134012013) I Gusti Agung Ayu Krisma D. D (P07134012023) I Putu Paramartha Wicaksana A. (P07134012033) Gusti Putu Agung Iswari S. (P07134012043) KEMENTRIAN KESEHATAN RI POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR JURUSAN ANALIS KESEHATAN 2013
PEWARNAAN HAPUSAN DARAH TEPI A. Tujuan Tujuan Umum menilai perbagai unsur sel darah tepi seperti RBC, WBC, PLT dan mencari adanya parasit seperti malaria, tripanosoma, microfilaria dll. Tujuan Khusus B. Metode C. Prinsip Setetes darah dipaparkan di atas sebuah glass objek, kemudian dilakukan pewarnaan, dan selanjutnya di evaluasi. ATAU Prinsip sediaan apus: dibuat apusan darah pada kaca objek.prinsip pewarnaan didasarkan pada sifat kimiawi dalam sel. Zat warna yang bersifat asam akan bereaksi dengan komponen sel yang bersifat alkalis, demikian pula sebaliknya. Pewarnaan sediaan apus menggunakan prinsip Romanosky yaitu menggunakan dua zat warna yang berbeda yang terdiri dari Azure B (trimethylthionin)yang bersifat basa dan eosin Y (tetrabromoflourescein) yang bersifat asam seperti yang dianjurkan oleh the International Council for Standardization in Hematology, dan pewarnaan yang dianjurkan adalah Wright-Giemsa dan May Grunwald-Giemsa (MGG). D. Dasar Teori Darah merupakan suatu suspensi sel dan fragmen sitoplasma yang dapat dianggap sebagai jaringan pengikat dalam arti luas, karena pada dasarnya terdiri atas unsur-unsur sel dan substansi interseluler yang berbentuk plasma. Fungsi utama dari darah adalah mengangkut oksigen yang diperlukan oleh sel-sel diseluruh tubuh. Darah juga menyuplai jaringan tubuh dengan nutrisi, mengangkut zat-zat sisametabolisme, dan mengandung berbagai bahan penyusun sistem imun yang bertujuanmempertahankan tubuh dari berbagai penyakit. Darah manusia berwarna merah, antara merah terang apabila kaya oksigen sampai merah tuaapabila kekurangan oksigen. Warna merah pada darah disebabkan oleh hemoglobin, protein pernapasan (respiratory protein), yang terdapat dalam eritrosit dan mengandung besi dalam bentuk heme, yang merupakan tempat terikatnya molekul-
molekul oksigen. Darah jugamengangkut bahan bahan sisa metabolisme, obat-obatan dan bahan kimia asing ke hati untuk diuraikan dan ke ginjal untuk dibuang sebagai air seni. Pada manusia umumnya memiliki volume darah sebanyak kurang lebih 5 liter dengan unsur-unsur pembentuknya yaitu sel-sel darah, platelet, dan plasma. Sel darah terdiri dari eritrosit danleukosit, platelet yang merupakan trombosit atau keping darah, sedangkan plasma darah padadasarnya adalah larutan air yang mengandung :Air (90%)Zat terlarut (10%) yang terdiri dari :- Protein plasma (albumin, globulin, fibrinogen) 7%- Senyawa Organik (As. Amino, glukosa, vitamin, lemak) 2.1%- Garam organik (sodium, pottasium, calcium) 0.9%. Sel darah pada umumnya dikenal ada tiga tipe yaitu: eritrosit, lekosit dan trombosit. Eritrosit manusia dalam keadaan normal berbentuk cakram bulat bikonkaf dengan diameter 7,2 µm tanpa inti, lebih dari separoh komposisi eritrosit terdiri dari air (60%) dan sisanya berbentuk substansi koloidal padat. Sel ni bersifat elastis dan lunak. Lekosit (sel darah putih) terdapat pada bagian pinggir sel darah, lekosit ini dibagi menjadi dua yaitu granulosit dan agranulosit. Granulosit terbagi menjadi tiga yaitu Netrofil (terbanyak) berbentuk bulat dengan diameter 10-12 µm, Eosinofil yang strukturnya lebih besar daripada netrofil (10-15 µm) dan Basofil (paling sedikit) dengan ukuran hampir sama dengan netrofil tetapi basofil sangat sulit ditemukan. Agranulosit dibagi menjadi dua yaitu Limfosit yang mempunyai ukuran yang bevariasi, inti bulat sitoplasma mengelilingi inti seperti cincin dan berperan penting dalam imunitas tubuh, dan Monosit (sel lekosit terbesar), intinya berbentuk oval kadang terlipat-lipat dapat bergerak dengan membentuk pseudopodia. Tipe ketiga yaitu Trombosit (disebut juga keping darah), berbentuk sebagai kepingkeping sitoplasma lengkap dengan membran yang mengelilinginya, Trombosit terdapat khusus pada sel darah mammalia. Untuk melihat struktur sel-sel darah dengan mikroskop cahaya pada umumnya dibuat sediaan apus darah. Sediaan apus darah ini tidak hanya digunakan untuk mempelajari sel darah tapi juga digunakan untuk menghitung perbandingan jumlah masing-masing sel darah. Pembuatan preparat apus darah ini menggunakan suatu metode yang disebut metode oles (metode smear) yangmerupakan suatu sediaan dengan jalan mengoles atau membuat selaput (film) dan substansi yang berupa cairan atau bukan
cairan di atas gelas benda yang bersih dan bebas lemak untuk kemudian difiksasi, diwarnai dan ditutup dengan gelas penutup (Handari, 2003). Film darah (sediaan oles) dapat diwarnai dengan berbagai macam metode termasuk larutan-larutan yang sederhana antara lain: pewarnaan Giemsa, pewarnaan acid fast, pewarnaan garam, pewarnaan wright, dan lain-lain.pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal Tripanosoma, Plasmodia danlain-lain dari golongan protozoa. Beberapa langkah yang harus diperhatikan dalam pembuatan preparat dengan metode smear sebagai berikut: 1. Ketebalan film 2. Film difiksasi agar melekat erat pada gelas benda sehingga yakin bahwa sel-sel di dalamnya strkturnya tetap normal 3. Memberi warna (pewarnaan) 4. Menutup dengan gelas penutup Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaaan Romanowski. Metode pewarnaan ini banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal Tripanosoma, psedopodia dan lain-lain dari golongan protozoa. Hasil pewarnaan dengan giemsa pada darah manusia akan memperlihatkan eritrosit berwarna merah muda, nukleolus lekosit berwarna ungu keniru-biruan, sitoplasma lekosit berwarna sangat ungu muda, granula dari lekosit eosinofil berwarna ungu tua, granula dari lekosit netrofil dan lekosit basofil berwarna ungu. Morfologi Sediaan Apusan Darah Tepi Dibedakan atas : kepala dan ekor Bagian badan dibagi beberapa zona: Zona I : irregular, tidak teratur,berdesakan, 3% Zona II : tipis,tidak rata,berdesakan, 14% Zona III : tebal, bergerombol,rouleux, 45% Zona IV: sama zona II,tipis, 18%
Zona V : even zona, tidak berdasarkan, tidak bertumpukan,regular,rata,bentuk utuh,11% Zona VI: sangat tipis, lebih longgar dan jarang, 9% Cara melakukan perhitungan pada sediaan apusan: Pilih bagian yang akan dipakai (zona dimana eritrosit tersebar rata) Mulailah menghitung sel pada pinggir atas kebawah Mulailah menghitung dari bagian ekor Sumber Kesalahan 1. Kesalahan dalam persiapan penderita, pengambilan dan penyimpanan bahan pemeriksaan. 2. Sediaan apus terlalu biru memungkinkan disebabkan oleh apusan yang terlampau tebal, pewarnaan terlalu lama, kurang pencucian, zat warna atau larutan dapar yang alkalis. 3. Sediaan apus terlalu merah mungkin disebabkan oleh sat warna sediaan atau larutan dapar yang asam. Larutan dapar yang terlalu asam dapat menyebabkan lekosit hancur. 4. Bercak-bercak zat warna pada sediaan apus dapat disebabkan oleh zat warna tidak disaring sebelum dipakai atau pewarnaan terlalu lama sehingga zat warna mengering pada sedian. 5. Morfologi sel yang terbaik adalah bila menggunakan darah tepi langsung tanpa anti koagulan. Bila menggunakan anti koagulan sediaan apus harus dibuat segera, tidak lebih dari satu jam setelah pengambilan darah. Penggunaan antikogulan heparin akan menyebabkan latar belakang berwarna biru dan lekosit menggumpal. 6. Sediaan hapus yang tidak rata dapat disebabkan oleh kaca pengapus yang tidak bersih atau pinggirannya tidak rata atau oleh kaca objek yang berdebu, berlemak atau bersidik jari. 7. Fiksasi yang tidak baik menyebabkan perubahan morfologi dan warna sediaan. Ini mungkin terjadi apa bila fiksasi dilakukan menggunakan methanol yang tidak absolut karena telah menyerap uap air akibat penyimpanan yang tidak baik. 8. Fiksasi yang tidak dilakukan segera setelah sediaan apus kering dapat mengakibatkan perubahan morfologi lekosit.
E. Bahan dan Alat - Reagen Pewarna Wright Stain Pewarna ini mengandung eosin dan methylene blue dengan pelarut methanol. Buffer Phosphat ph 6,4 Bufer fosfat ini terdiri dari KH2PO4 dan Na2HPO4 - KH2PO4 6,63% - Na2HPO4 3,20% - Aquades 1 L F. Prosedur Kerja Pewarnaan 1. Hapusan yang sudah kering difiksasi dengan meneteskan pewarna Wright pada hapusan darah sehingga hapusan ini tertutup seluruhnya. 2. Pada hapusan yang baik eritrosit warnanya merah jingga (red orange) dan leukosiy berwarna biru dan intinya ungu. 3. Bila eritrosit berwarna biru, makan ini disebabkan karena bufer yang terlalu alkalis atau pencucian kurang bersih. 4. Bila inti sel tidak berwarna ungu tetapi biru, ini disebabkan karena pewarnaan yang kurang. 5. Bila pewarnaa dilakukan terlalu lama, kemudian dicuci berlebihan, maka inti sel masih terlihat tetapi granula sitoplasma tidak tampak lagi. 6. Untuk menghindari pengendapan metalic scum pada hapusan, janganlah memiringkan glas objek untuk membuang pewarna. 7. Pewarna tersebut harus dihanyutkan dengan menuangkan aquades yang cukup banyak, sedangkan hapusan tetap dalam posisi mendatar di atas rak pewarnaan. 8. Waktu fiksasi dan pewarnaan dapat diubah-ubah tergantung dari kualitas pewarna yang dipakai.