OVER-EKSPRESI GEN OsWRKY76 UNTUK KETAHANAN TERHADAP CENDAWAN BLAS (Pyricularia grisea Sacc.) PADA PADI ANIVERSARI APRIANA

OVER-EKSPRESI GEN OsWRKY76 UNTUK KETAHANAN TERHADAP CENDAWAN BLAS (Pyricularia grisea Sacc.) PADA PADI ANIVERSARI APRIANA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan terhadap Cendawan Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada Padi adalah karya saya dengan arahan dari komosi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesisi ini. Bogor, Agustus 2008 Aniversari Apriana NIM A351050091

ABSTRACT ANIVERSARI APRIANA. Over-expression of OsWRKY76 Gene for Blast Resistance (Pyricularia grisea Sacc.) in Rice. Under direction of SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Rice plant is estimated to have 109 transcription factor genes of OsWRKY family. Though few of these genes has been known involved in the defense mechanism, the function of the most of them has not been uncovered yet. This study was intended to show that over-expression of OsWRKY76 gene in transgenic rice increase the resistance to blast infection. A construct of pcambia-1301::35s::oswrky76 has been successfully assembled and transformed into embryogenic calli of rice cv. Nipponbare using A. tumefaciens strain Agl-1 and EHA 105. A number of 126 independent lines has been produced, in which Agl-1 showed higher efficiency than EHA 105. PCR analysis of randomly selected 25 independent lines showed that all of them positively contained the over-expression construct of the OsWRKY76 gene. DNA blot analysis showed that a range of 1-4 copies of the over-expression construct of the OsWRKY76 gene was integrated in the genoms of randomly selected 26 independent lines. Out of 6 independent lines containing single copy of the construct, 3 independent lines showed better resistance than non-transgenic plants upon the inoculation using dominant Pyricularia grisea isolat 173. Key word: transcription factor, OsWRKY gene, blast resistance

RINGKASAN ANIVERSARI APRIANA. Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan Terhadap Cendawan Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada Padi. Dibimbing oleh SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Salah satu kendala dalam peningkatan produksi beras adalah adanya cekaman biotik dan abiotik. Salah satu penyakit utama yang menyerang tanaman padi adalah penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc. Serangan cendawan blas pada padi dapat menurunkan hasil 1-50 %, sementara bila menyerang leher malai dapat menurunkan hasil sampai 100 %. Cendawan blas cepat berubah virulensinya, tergantung pada genotipe inang dan lingkungan sekitarnya. Hasil-hasil penelitian mengenai sistem pertahanan tanaman terhadap patogen menunjukkan adanya interaksi produk gen Avr dari patogen dan produk gen R dari tanaman. Gen Avr patogen menjadi protein elicitor yang berinteraksi secara fisik dengan protein reseptor kinase yang merupakan produk dari gen R dari tanaman. Protein reseptor kinase yang diaktifkan melalui interaksi ini selanjutnya bisa mengaktifkan protein-protein yang lain seperti faktor transkripsi. Faktor transkripsi akan mengaktifkan ekspresi gen-gen yang terlibat langsung dalam memberikan proteksi pada tanaman, seperti kitinase dan glucanase. WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Tanaman padi diperkirakan mempunyai 109 gen yang termasuk dalam famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya. Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas. Dengan teknologi DNA dimungkinkan untuk memasukkan suatu gen asing yang diinginkan ke dalam tanaman dengan tidak dibatasi dari mana sumber gen asing tersebut berasal Teknik yang digunakan untuk memasukkan suatu gen asing tersebut salah satunya dapat dengan bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens.

Rekayasa genetik tanaman padi untuk mendapatkan varietas tahan penyakit perlu dilakukan, salah satunya dapat dengan cara memanipulasi tingkat ekspresi dari faktor transkripsi yang terkait dengan sistem pertahanan tanaman dengan strategi over-ekspresi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan dan menguji efek overekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada tanaman padi. Penelitian ini terdiri dari 2 subkegiatan yaitu 1. Konstruksi dan introduksi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 melalui Agrobacterium tumefaciens pada tanaman padi Nipponbare, dan 2. Analisis integrasi dan uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 pada padi Nipponbare terhadap cendawan Pyricularia grisea Sacc. Pada kegiatan pertama dilakukan perakitan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor biner pcambia-1301, dan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam kalus embriogenik padi Nipponbare dengan bantuan A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. Transforman yang diperoleh kemudian dianalisis molekuler dengan teknik PCR. Hasil dari penelitian ini adalah telah berhasil dirakit konstruk overekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor biner pcambia-1301. Transformasi kalus embriogenik padi Nipponbare dengan bantuan A.tumefaciens yang mengandung rakitan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 menghasilkan 126 galur independen, di mana transformasi menggunakan Agrobacterium strain Agl-1 lebih banyak menghasilkan galur independen dibandingkan dengan strain EHA 105. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR menunjukkan bahwa dari 25 galur independen generasi T0 yang dianalisis, semua positif mengandung rakitan over-ekspresi gen OsWRKY76. Pada kegiatan kedua dilakukan analisis integrasi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam tanaman padi transgenik Nipponbare generasi T0 dengan metode Southern Blot dan mengevaluasi ketahananan tanaman transgenik terhadap infeksi cendawan Pyricularia grisea. Hasil analisis blot DNA memperlihatkan dari 26 galur independen yang dianalisis terdapat 1-4 kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang terintegrasi di dalam genom tanaman. Dari 6 galur independen yang mengandung kopi tunggal konstruk over-

ekspresi gen OsWRKY76, terdapat 3 galur independen memperlihatkan ketahanan lebih baik dari tanaman non-transgenik pada saat diinokulasi dengan Pyricularia grisea isolat 173. Kata kunci: faktor tanskripsi, gen OsWRKY, ketahanan terhadap blas

Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

OVER-EKSPRESI GEN OsWRKY76 UNTUK KETAHANAN TERHADAP CENDAWAN BLAS (Pyricularia grisea Sacc.) PADA PADI ANIVERSARI APRIANA Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Agronomi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

Judul Tesis Nama NIM : Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan terhadap Cendawan Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada Padi : Aniversari Apriana : A351050091 Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. Ir. Sudarsono, M.Sc. Ketua Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.S. Anggota Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko, S.P, M.Si. Anggota Diketahui Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S. Tanggal Ujian : 22 Agustus 2008 Tanggal Lulus :

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Bonny Poerwanto, M.S.

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan pada Allah SWT atas segala limpahan karunia-nya sehingga penelitian dan penulisan tesis yang merupakan salah satu syarat untuk meraih gelar Magister Sains di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan September 2006- Mei 2008, dengan judul Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan terhadap Cendawan Blas (Pyricularia Grisea Sacc.) pada Padi. Tesis ini dibagi dalam dua subjudul penelitian yaitu Konstruksi dan Introduksi Konstruk Over-ekspresi Gen OsWRKY76 melalui Agrobacterium tumefacies pada Tanaman Padi Nipponbare dan Analisis Integrasi dan Uji Efek Over-ekspresi Gen OsWRKY76 pada Padi Nipponbare terhadap Cendawan Pyricularia grisea Sacc. Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang sebesarbesarnya kepada Prof.Dr.Ir Sudarsono,MSc. Selaku ketua komisi pembimbing, Dr.Ir. Nurul Khumaida, MS dan Dr.Ir. Kurniawan Rudi Trijatmiko, MS selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak membimbing dan mengarahkan penulis selama menjalani pendidikan dan penelitian di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Tak lupa penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr.Ir. Bonny Poernomo, MS selaku dosen penguji luar komisi tesis. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian atas kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk menjalani pendidikan di IPB. Tak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada Bapak Dr. M Herman selaku ketua Kelti Biologi Molekuler, BB-BIOGEN yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk menjalani studi di IPB. Disamping itu juga kepada BB-BIOGEN dan Badan Litbang Pertanian yang telah memberikan beasiswa. Selanjutnya kepada Bapak Dr.Ir. Munif Ghulamahdi, MS sebagai ketua program studi Agronomi SPs IPB penulis sampaikan ucapan terima kasih atas bimbingan dan dorongan yang telah diberikan selama penulis menjalani masa studi. Penulis juga mengungkapkan rasa terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada Ayahanda, Ibunda, dan Ibu mertua serta seluruh keluarga atas dorongan,

do a, kasih sayangnya sehingga penulis mempunyai motivasi untuk menyelesaikan studi dan penelitian. Kepada suami tercinta dan anak-anakku tersayang trimaksih atas dorongan semangat serta kesabaran dan pengertiannya selama penulis menjalani masa studi sampai dapat menyelesaikan studi. Tidak lupa penulis juga berterima kasih yang sedalam-dalamnya kepada rekan-rekan kantor Mitri, Wening, Tri Joko, Mbak Dinar, Mbak Nita, Teh Nur, Kak Heri, Muslih, Syarif dan lainnya yang tidak dapat penulis sebut satu-persatu yang selalu memberikan dorongan semangat dan bantuannya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian ini. Penulis menyadari bahwa di dalam penyusunan tulisan ini masih banyak kekurangan dan kelemahan. Maka dari itu, penulis sangat mengharap adanya kritik dan saran dari pembaca demi sempurnanya tulisan ini. Semoga tulisan karya ilmiah ini dapat bermanfaat di kemudian hari. Amien. Bogor, Agustus 2008 Aniversari Apriana

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Yogyakarta, pada tanggal 23 April 1970 sebagai anak keempat dari pasangan Jumhan Pida dan Titi Wrestiati. Pada tahun 1983 penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar di SD Muhammadiyah Purwodiningratan I Yogyakarta, dan melanjutkan ke SMP Negri 8 Yogyakarta dan lulus pada tahun 1986. Selanjutnya penulis melanjutkan ke SMA Negri 2 Yogyakarta, dan lulus pada tahun 1989. Penulis memperoleh gelar Sarjana Sains dari Fakultas Biologi, Jurusan Botani, Universitas Gadjah Mada pada tahun 1996. Pada tahun 2005 penulis mendapat kesempatan melanjutkan studi di Program Studi Agronomi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Beasiswa Pendidikan diperoleh dari BB-BIOGEN dan Badan Litbang Pertanian, Departemen Pertanian. Penulis bekerja sebagai staf peneliti di Kelompok Peneliti Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor, sejak tahun 1996 sampai sekarang. Selama bekerja Penulis terlibat dalam berbagai program penelitian tanaman padi, khususnya mengenai perakitan tanaman transgenik.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... xii xiii xv PENDAHULUAN... 1 Latar Belakang... 1 Tujuan... 4 Hipotesis Penelitian... 4 TINJAUAN PUSTAKA... 5 Penyakit Blas... 5 Sistem Pertahanan Pada Tanaman... 6 Pengaturan Aktivitas Faktor Transkripsi di dalam Tanaman. 8 Dasar Transformasi Tanaman Melalui Agrobacterium... 9 KONSTRUKSI DAN INTRODUKSI KONSTRUK OVER- 12 EKSPRESI GEN OsWRKY76 MELALUI AGROBACTERIUM TUMEFACIES PADA TANAMAN PADI NIPPONBAR... Abstrak... 12 Abstract... 13 Pendahuluan... 14 Bahan dan Metode... 19 Hasil dan Pembahasan... 27 Kesimpulan... 43 ANALISIS INTEGRASI DAN UJI EFEK OVER-EKSPRESI GEN 44 OsWRKY76 PADA PADI NIPPONBARE TERHADAP CENDAWAN PYRICULARIA GRISEA SACC... Abstrak...... 44 Abstract... 45 Pendahuluan... 46 Bahan dan Metode... 50 Hasil dan Pembahasan... 55 Kesimpulan... 61 PEMBAHASAN UMUM... 62 KESIMPULAN DAN SARAN... 67 DAFTAR PUSTAKA... 68 LAMPIRAN... 73

DAFTAR TABEL 1 Hasil transformasi kalus padi varietas Nipponbare dengan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 melalui A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA-105... 2 Skala penyakit blas daun berdasarkan sistem evaluasi standar IRRI... 3 Jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 pada 26 galur- galur independen hasil analisis Southern Blot... 4 Tingkat ketahanan galur Nipponbare transgenik dibandingkan dengan tanaman non-transgenik... Halaman 38 54 56 58

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Diagram alur penelitian... 20 2 Bagan alur prosedur prosedur kegiatan konstruksi over-ekspresi 21 gen OsWRKY76... 3 Skema konstruk 35SCaMV::OsWRKY76::35SCaMV dengan situs 23 pemotongan enzim restriksi dan ukuran dari masing-masing fragmen... 4 Hasil amplifikasi 5 sampel DNA Nipponbare dengan primer untuk 28 gen OsWRKY76. Ukuran gen OsWRKY76 yang diharapkan adalah sebesar 1200 bp ditandai dengan anak panah... 5 Hasil konfirmasi keberadaan fragmen gen OsWRKY76 pada 29 plasmid pgem-t easy yang dipotong dengan enzim BamHI dan SalI, menghasilkan fragmen dengan ukuran + 3.000 bp (fragmen pgem-t Easy) dan 1.200 bp (fragmen OsWRKY76 sampel nomor 1, 2, 4, dan 5). Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan ukuran fragmen yang tidak sesuai... 6 (A) Hasil pemotongan plasmid psp13 dengan enzim HindIII dan 31 BamHI menghasilkan fragmen promotor 35SCaMV dengan ukuran 550 bp dan fragmen plasmid pbs-sk+ (3.000 bp), (B) Hasil pemotongan plasmid pst8 dengan enzim SalI dan EcoRI menghasilkan fragmen erminator 35SCaMV dengan ukuran 210 bp dan fragmen plasmid pbs-sk+ (3.000 bp)... 7 Hasil pemotongan plasmid biner pcambia-1301 dengan enzim 32 HindIII dan EcoRI menghasilkan fragmen berukuran 11.837 bp... 8 Hasil pemotongan plasmid pcambia 1301-OsWRKY76 dengan 34 enzim restriksi EcoRI.Ukuran yang dihasilkan dari pemotongan tersebut adalah: 210 bp yang merupakan ukuran terminator 35SCaMV, 710 bp merupakan ukuran sebagian potongan gen OsWRKY76, 1040 bp merupakan ukuran dari gabungan promotor 35SCaMV dan sebagian potongan gen OSWRKY76, dan 11.837 bp merupakan ukuran fragmen pcambia 1301... 9 Hasil konfirmasi dari 2 sampel plasmid untuk mengetahui keberadaan gen kimera (promoter 35SCaMV, gen OsWRKY76, dan terminator 35SCaMV) pada plasmid biner pcambia-1301, dengan menggunakan 2 cara pemotongan (A) pcambia1301 rekombinan dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI menghasilkan produk hasil pemotongan dengan ukuran 210, 710, 1040, dan 11837 bp, dan (B) pcambia-1301 rekombinan dipotong menggunakan 3 enzim restriksi HindIII, BamHI dan SalI, menghasilkan produk dengan ukuran 550, 1200, dan 13047 bp. Ket.: Kb = marker 1 Kb plus (Invitrogen), 1,3 = plasmid dari koloni bakteri nomor 1 dan 3... 34

10 A. Plasmid pcambia -1301dengan daerah MCS (Multi Clonning Site) dan B. Plasmid pcambia-1301::35s::oswrky76 hasil kloning... 11 Hasil konfirmasi pemotongan plasmid pcambia- 1301::35S::OsWRKY76 yang diisolasi dari E.coli dengan enzim restriksi EcoRI, menghasilkan fragmen dengan ukuran 210 (terminator 35S),710 (potongan gen OsWRKY76), 1040 (potongan gen OsWRKY76 + promotor 35S), dan 11.837 bp (plasmid pcambia-1301)... 12 Hasil transformasi kalus padi Nipponbare melalui Agrobacterium tumefaciens yang mengandung vector biner pcambia- 1301::35S::OsWRKY76. Ket.: A. kalus pada media seleksi yang mengandung higromisin 50 mg/l, B. kalus yang tumbuh di media EIM (induksi embrio) yang mengandung antibiotik higromisin 50 mg/l, C. kalus yang berhasil beregenerasi di media regenerasi yang mengandung antibiotik higromisin 30 mg/l, D. plantlet di media perakaran yang mengandung antibiotik higromisin 40 mg/l, E. populasi tanaman padi Nipponbare transgenik hasil aklimatisasi di rumah kawat... 13 Hasil amplifikasi DNA padi Nipponbare transgenik generasi T0 yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dengan menggunakan primer untuk gen hptii (gen untuk ketahanan terhadap antibiotik higromisin). Pita dengan ukuran + 500 bp merupakan fragmen gen hptii. Ket.: KB=Marker 1 Kb Plus (Invitrogen), 1-25= sampel tanaman transgenik generasi T0, Nip=tanaman Nipponbare non-transgenik, A=Air, P=Plasmid pcambia-1301::35s::oswrky76... 14 Analisis Southern blot pada 26 galur tanaman padi Nipponbare transgenik berdasar metode Panaud et. al. (1993) dengan probe hptii. DNA genom dari tanaman transgenik dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI, diseparasi dengan elektroforesis, didenaturasi, ditransfer ke membran nilon Hybon N +, dan dihibridisasi dengan menggunakan probe hptii. Ket.:1-26 =secara berurutan sampel galur-galur NAW 1.1,NAW 2.12, NAW 3.2, NAW 4.1, NAW 5.2, NAW 6.3, NAW 7.3, NAW 8.2, NAW 11.1, NAW 12.1, NAW 13.1, NAW 14.4, NAW 15.3, NAW 16.1, NAW 17.1, NAW 18.1, NAW 22.1, NAW 23.1, NAW 25.6, NAW 26.3, NAW 29.2, NAW 30.5, NAW 34.3, NAW 35.3, NAW 36.1, NAW 37.2, λ= 1KB Ladder... 15 Daun padi Nipponbare transgenik tahan (3 galur) dan nontransgenik yang telah diinokulasi dengan cendawan blas (Pyricularia grisea) isolat uji 173.Keterangan: A: tanaman nontransgenik, B: galur NAW 1.1, C:galur NAW 36.1, D: NAW 37.2. Tanda anak panah menunjukkan adanya bercak serangan cendawan blas... 36 36 40 41 56 59

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi MediaTransformasi Padi... 73 2 Komposisi Media Pertumbuhan Bakteri... 77