42 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen murni (True Experimental). Penelitian eksperimen murni bertujuan untuk mengetahui kemungkinan hubungan sebab akibat dengan cara mengenakan satu atau lebih kelompok eksperimen kepada satu atau lebih kondisi perlakuan dan membandingkan hasilnya dengan satu atau lebih kelompok kontrol yang tidak dikenai perlakuan (Sukmadinata, 2013). Penelitian ini menggunakan penelitian eksperimental dengan rancangan penelitian The Postest-only Control Group Design, yaitu untuk perlakuan awal tidak dilakukan karena diasumsikan bahwa di dalam suatu populasi tertentu tiap unit populasi adalah sama (homogen), sedangkan pengukuran akhir yaitu untuk melihat perbedaan antara kelompok eksperimen dan kelompok kontrol positif dan negatif dengan pemberian berbagai dosis filtrat selada air. Berikut skema rancangan penelitian eksperimen murni yang digunakan yaitu The Postest-only Control Group Design: X1 X2 R A PA A 1 B PB B 1 C PC C 1 Gambar 7. The Postest-only Control Group Design 42
43 Keterangan: R : random acak X1 : perlakuan kontrol negatif (-) X2 : perlakuan kontrol positif (+) PA-Pc : kelompok perlakuan filtrat selada air dengan dosis 0,51g/200gBB, 1,02g/200gBB, dan 1,53g/200gBB. A 1 -C 1 : mengukur kadar kolesterol total setelah perlakuan filtrat selada air. 3.2 Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap. Rancangan jenis ini memiliki ciri-ciri dimana penelitian yang dilakukan di lingkungan laboratorium dianggap homogen. Rancangan ini merupakan rancangan yang perlakuannya diletakkan dan dilakukan secara acak pada seluruh percobaan. Hal ini berarti seluruh unit percobaan memiliki peluang yang sama besar untuk menerima perlakuan. Penempatan setiap unit eksperimen dilakukan dengan melakukan pengundian dengan hasil berikut: Tabel 2. Denah Rancangan Acak Lengkap Keterangan: X1,X2,A-C B 2 A 4 X1 4 B 1 X1 3 X1 1 C 1 X2 3 X2 4 B 3 A 5 A 3 B 4 A 1 C 2 X2 2 X1 2 C 3 X2 5 X2 1 C 5 B 5 X1 5 C 4 A 2 : perlakuan 1-5 : ulangan
44 3.3 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang, Jl. Bendungan Sutami No. 188 A. Penelitian dilaksanakan selama 1,5 bulan 21 April 02 Juni 2017. 3.4 Populasi, Sampel dan Teknik Sampling 3.4.1 Populasi Populasi adalah keseluruhan objek yang dipakai dalam penelitian yang terdiri dari manusia, benda-benda, hewan, tumbuhan, nilai maupun peristiwa sebagai sumber data yang memiliki karakteristik tertentu (Sukamdinata, 2013). Populasi dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan dengan rata-rata berat badan tikus ±150 gram pada usia 3 bulan. 3.4.2 Sampel Sampel adalah sebagian dari populasi yang dijadikan objek atau sumber data yang sebenarnya dari suatu penelitian (Sukamdinata, 2013). Sampel dalam penelitian ini adalah 25 ekor tikus putih yang dibagi dalam 5 kelompok perlakuan. 3.4.3 Teknik Sampling Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah random sampling, yaitu cara pengambilan sampel dari anggota populasi dengan menggunakan acak tanpa memperhatikan strata (tingkatan) dalam anggota populasi tersebut. Dalam suatu penelitian diperlukan suatu ulangan dalam perlakuan, hal ini dikarenakan dibutuhkan derajat ketelitian terhadap suatu penelitian. Menurut Hanafiah (2005), jumlah ulangan dianggap cukup baik apabila memenuhi syarat berikut:
45 (t-1) (r-1) 15 Keterangan r t : Replikasi (jumlah ulangan) : Treatment (jumlah perlakuan) (t-1) (r-1) 15 (5-1) (r-1) 15 4 (r-1) 15 4r - 4 15 4r 15+4 r 19 4 r 5 n = t x r = 5 x 5 = 25 Berdasarkan hasil perhitungan diatas, didapatkan bahwa jumlah pengulangan yang diperlukan adalah sebanyak 5 kali. Denah Rancangan Acak Lengkap pada penelitian ini menggunakan 5 perlakuan yang masing-masing diulang 5 kali. Sampel dalam penelitian ini adalah 25 ekor tikus putih.
46 3.5 Jenis Variabel 3.5.1 Variabel Bebas Variabel bebas adalah variabel yang mempengaruhi atau yang menjadi sebab perubahannya atau timbulnya variabel terikat. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah berbagai dosis filtrat selada air (Nasturtium officinale R. Br). 3.5.2 Variabel Terikat Variabel terikat adalah variabel yang dipengaruhi atau yang menjadi sebab akibat, karena adanya variabel bebas. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah penurunan kadar kolesterol total pada tikus putih jantan yang telah mengalami hiperkolesterolemia. 3.5.3 Variabel Kontrol Variabel kontrol adalah variabel yang dikendalikan atau dibuat konstan sehingga hubungan variabel independen terhadap dependen tidak dipengaruhi faktor luar yang tidak diteliti. Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah jenis kelamin tikus, umur tikus, makanan, minuman, pakan hiperkolesterolemia, kandang tikus, dan perawatan untuk tikus. 3.6 Definisi Operasional Variabel 1) Filtrat yang digunakan adalah filtrat selada air (Nasturtium officinale R. Br) yang masih mudah dan segar. 2) Parameter penurunan kadar kolesterol darah tikus yaitu menghitung kolesterol total setelah perlakuan filtrat, sedangkan untuk menganalisis kadar kolesterol darah tikus digunakan metode CHOD-PAP. 3) Jenis kelamin tikus putih yang digunakan yaitu tikus putih jantan.
47 4) Umur tikus yang digunakan adalah tikus putih berumur 3 bulan. 5) Makanan yang digunakan adalah pakan BR-1yang diberikan pada pagi hari. 6) Minuman yang digunakan adalah aquades. 7) Pakan hiperkolesterolemia yang digunakan adalah kuning telur puyuh sebanyak 4ml yang diinduksi secara direct. 8) Kandang tikus yang digunakan adalah bak plastik yang ditutup dengan kawat, kandang diberi sekam sebagai alas yang digunakan untuk menyerap kotoran tikus. 9) Perawatan yang dilakukan yaitu membersihkan kandang tikus sebanyak 1 kali dalam 2 hari. 3.7 Prosedur Penelitian 3.7.1 Tahap Persiapan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1) Alat pemeliharaan tikus a. Kandang pemeliharaan 5 buah b. Kawat penutup 5 buah c. Tempat minum 10 buah d. Sekam 20 bungkus 2) Alat untuk membuat filtrat selada air a. Beaker glass 2 buah b. Blender 1 buah c. Saringan 1 buah
48 d. Kain kasa 3 gulung e. Spatula 1 buah f. Gelas ukur 25ml 1 buah g. Timbangan analitik 1 buah 3) Alat untuk membuat diet tinggi lemak a. Beaker glass 1 buah b. Sendok 1 buah 4) Alat untuk memberi perlakuan filtrat selada air a. Sonde 2 buah b. Handscone 1 box c. Sarung tangan 3 pasang 5) Alat untuk membedah tikus putih a. Alat section 1 set b. Kloroform 50 ml c. Masker 5 buah d. Syringe ukuran 3cc 1 box e. Jarum pentul 1 bundel f. Kertas label 1 pack 6) Alat untuk mengukur kadar kolesterol total e. Sentrifuge 1 buah f. Tabung vacutainer 25 buah g. Ependroff 25 buah
49 2. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1) Bahan untuk memelihara tikus a. Pakan Br-1 15 kg b. Aquades 5 liter 2) Bahan untuk membuat filtrat selada air a. Daun selada air 4 kg b. Aquades secukupnya 3) Bahan untuk membuat diet tinggi lemak a. Kuning telur puyuh = 4 ml/200gbb 4) Bahan untuk mengukur kadar kolesterol a. Kapas 1 buah b. Alkohol 70% 1 liter 3.7.2 Tahap Pelaksanaan 1) Pembuatan Filtrat Selada Air (Nasturtium officinale R. Br) a. Selada air (Nasturtium officinale R. Br) segar dibuat dengan mencuci selada air dengan air mengalir. b. Melakukan pemotongan selada air (Nasturtium officinale R. Br) dengan menghaluskan bahan tersebut menggunakan mortal-martil atau menggunakan blender tanpa penambahan aquades. c. Melakukan penyaringan pada erlenmeyer menggunakan kain kasa. d. Memindahkan filtrat selada air (Nasturtium officinale R. Br) sesuai dengan volume yang diinginkan pada gelas ukur.
50 e. Menambahkan aquades sampai batas volume yang diinginkan. f. Memindahkan filtrat kedalam botol kaca dan mensterilkan dengan pemberian label kemudian ditutup menggunakan alumunium foil. 2) Penyiapan dan Pemeliharaan Hewan Uji Sebelum digunakan untuk penelitian, hewan diaklimatisasi selama 1 minggu agar dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan baru. Selama aklimatisasi, tikus diberikan minum dan makanan standar serta mengontrol kesehatan dan berat badan tikus. Pemeliharaan pada hewan uji dilakukan dengan memberi makan 1 kali sehari pada pagi hari, memberi minum dengan aquades serta mengganti sekam 2 hari sekali, dimaksudkan untuk menjaga kebersihan kandang agar tidak lembab dan tidak kotor. 3) Membuat Pakan Hiperkolesterolemia a. Memisahkan kuning telur dengan putih telur puyuh sebanyak 30 butir setiap pagi. 4) Penentuan Dosis Filtrat Selada Air Kebutuhan vitamin C yang dianjurkan adalah sebesar 20-30 mg per hari (Karinda, 2013). Kandungan vitamin C pada selada air yaitu sebesar 45-50mg/100g. Menurut Laurence (1964), faktor konversi dari manusia Eropa dengan berat badan 70kg terhadap hewan uji (tikus) dengan berat badan 200 g adalah 0,018. Berat badan rata-rata orang Indonesia adalah 50kg.
51 Perhitungan dosis filtrat selada air (Nasturtium officinale R. Br) dengan dosis bertingkat: Dosis konversi tikus yaitu: Dosis manusia x Faktor konversi = 40g x (70/50kg) x 0,018 = 0,51g/200gBB Pada penelitian digunakan filtrat selada air (Nasturtium officinale R. Br) dengan dosis bertingkat, yaitu: 1. Perlakuan A : Dosis 1 = 1 x 0,51g/200gBB = 0,51g/200gBB. 2. Perlakuan B : Dosis 2 = 2 x 0,51g/200gBB = 1,02g/200gBB. 3. Perlakuan C : Dosis 3 = 3 x 0,51g/200gBB = 1,53g/200gBB. Dosis efektif aplikasi pada manusia yaitu: Dosis tikus x Faktor konversi 1. Perlakuan A : Dosis 1 = 0,51g x 56 = 28,51g/200gBB 2. Perlakuan B : Dosis 2 = 1,02g x 56 = 57,12g/200gBB 3. Perlakuan C : Dosis 3 = 1,53g x 56 = 85,68g/200gBB 5) Pembagian Kelompok Tikus Putih Tikus yang digunakan sebanyak 25 ekor yang terbagi dalam 5 perlakuan dan tiap perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus. X1 : kontrol negatif (kontrol normal) X2 : kontrol positif (hiperkolesterolemia) A B C : hiperkolesterolemia + dosis 0,51g/200gBB. : hiperkolesterolemia + dosis 1,02g/200gBB. : hiperkolesterolemia + dosis 1,53g/200gBB.
52 6) Mengukur Kadar Kolesterol Total Darah Tikus dipuasakan ± 12 jam sebelum dilakukan pengambilan darah. Pengambilan darah dilakukan setelah perlakuan filtrat selada air. Pengambilan darah dilakukan pada bagian jantung dengan pembedahan pada hewan coba. Darah yang diambil dari jantung berkisar antara 2-3 ml. Darah yang diperoleh ditampung pada vakutener 2 ml. Darah disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Serum darah di pindahkan pada ependroff menggunakan spuit 3ml, kemudian ditambahkan larutan pereaksi kolesterol sebanyak 1 ml lalu dicampur dengan vortex, dan dibiarkan selama 20 menit ada suhu kamar. Sebagai blanko digunakan pereaksi kolesterol sebanyak 1ml dan aquades 0,01ml. Kemudian mengukur kadar kolesterol darah dengan menggunakan spektofotometer UV pada panjang gelombang 500nm. 3.8 Teknik Pengumpulan Data Teknik pengumpulan data yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan melalui observasi eksperimen yaitu dengan teknik pengambilan data secara langsung dengan cara mengamati dan mencatat aktivitas yang sedang berlangsung. Observasi di laboratorium ini difokuskan pada obyek perlakuan yaitu variabel terikat yang diberi perlakuan, kemudian data yang diperoleh diaplikasikan ke dalam bentuk tabel. Tabel tersebut akan mencangkup data rerata kadar kolesterol total dalam darah tikus putih dengan bantuan spektofotometer. Observasi pengukuran terhadap rerata kadar kolesterol total dalam darah tikus putih ditunjukkan pada tabel berikut:
53 Tabel 3. Pengukuran Kadar Kolesterol pada pada Tikus Putih Perlakuan Ulangan Total Rerata 1 2 3 4 5 X1 X2 A B C 3.9 Teknik Analisis Data Analisis data yang digunakan adalah analisis kuantitatif, dimana pengolahan data dilakukan menggunakan uji normalitas (Lilifors), uji homogenitas dianalisis dengan One Way Anova selanjutnya jika ada beda nyata dilanjutkan uji Duncan untuk mengetahui perlakuan yang terbaik.