BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Penelitian tentang uji sitotoksisitas rebusan daun sirsak (Annona muricata L) terhadap kultur primer sel otak baby hamster yang dipapar dengan dimetilbenz(α)antrase (DMBA) secara in vitro ini dilakukan melalui pengujian eksperimental di laboratorium. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian tentang uji sitotoksisitas rebusan daun sirsak (Annona muricata L) terhadap kultur primer sel otak baby hamster yang dipapar dengan dimetilbenz(α)antrase (DMBA) secara in vitro ini dilakukan pada bulan Juli- oktober 2012 di Laboratorium Kultur Jaringan Hewan Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang. 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator, oven, autoklaf, Laminar Air Flow (LAF), refrigator, incubator CO 2 5%, timbangan analitik, sentrifuge, tabung sentrifuge 10 ml, botol tutup ulir (scot), vacuum bucner, spuit, gunting, pinset, pipet pasteur, mikropipet 20-200 µl dan 100-1000 µl (Biored), blue tips dan yellow tips, cawan petri, TCdisk 35 mm (Iwaki), tabung tube 1 ml, 40
41 tabung reaksi, rak tabung, beaker glass, filter single use 0.2 µm (Sartorius mini start), scalpel, parafilm, masker, hand glove, penutup kepala, kertas label, tissue, aluminium foil, mikroskop inverted, hemocytometer, hand counter, bunsen, panci, kompor, korek dan karet. 3.3.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baby hamster yang berumur 2 hari, daun Sirsak (Annona muricata L), dimetilbenz (α) antrasen (DMBA), media Dulbeccos Modified Eagles medium with high glucose (DMEM, Gibco, Burlington, ON 12800-017), DMSO, Phosphat Buffer Saline (PBS, Gibco 21600-051), tripsin (Gibco, 15090), tripsin EDTA 2.5% (Gibco, 15050-065), Foetal Bovine Serum (FBS, Sigma 12003c), penicillin (Meiji Indonesia), streptomycin (Meiji Indonesia), fungizone (Gibco, 15290-08), DI steril, NaHCO 3, tripan blue, hepes, alkohol 70%, tipol. 3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Preparasi Alat Tahap awal yang dilakukan sebelum penelitian yaitu sterilisasi alat, hal ini bertujuan agar semua alat yang akan digunakan steril sehingga saat bekerja tidak terkontaminasi. Alat-alat yang akan digunakan disterilisasi dengan cara direndam alat-alat tersebut dengan tipol selama 1 x 24 jam, kemudian digosok dan dibilas sebanyak 21 kali pada air yang mengalir, pada bilasan terakhir dibilas dengan
42 Aquades. Dikeringkan dalam oven dengan suhu 50 o C, selanjutnya dibungkus dengan aluminium foil dan disterilisasi. Sterilisasi terdiri dari dua macam yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Sterilisasi basah dilakukan pada alat- alat yang berbahan plastik, langkah kerjanya yaitu diautoklaf dengan suhu 121 o C dengan tekanan 1.5 atm selama 15 menit kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 50 o C selanjutnya dimasukkan ke dalam LAF dan diuv selama 2 jam sebelum digunakan. Sterilisasi kering dilakukan pada alat-alat yang berbahan kaca, cara sterilisasinya yaitu dioven dengan suhu 125 o C selama 3 jam. 3.4.2 Preparasi Bahan 3.4.2.1 Pembuatan Rebusan Daun Sirsak (Annona muricata L) Rebusan daun sirsak diperoleh dari daun sirsak yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua, daun diambil dari daun keempat atau daun kelima dari ujung., lalu dicuci bersih dan diangin-anginkan tanpa sinar matahari langsung selama 3 minggu. Kemudian dihaluskan dan ditimbang sebanyak 100 gr selanjutnya direbus dengan 1000 ml diatas kompor hingga diperoleh pelarut setengah bagian dari volume awal, sambil sesekali diaduk. Rebusan disaring dengan vacuum buchner. Cairan yang diperoleh kemudian diuapkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh sediaan kental kemudian dipekatkan dengan nitrogen cair sampai diperoleh ekstrak daun sirsak.
43 3.4.2.2 Uji Fitokimia Rebusan Daun Annona muricata L a. Uji Fenol dan Tanin Ekstrak daun sirsak dimasukkan ke dalam tabung reaksi selanjutnya dicampur dengan FcL3 dan garam gelatin kemudian dihomogenkan dan ditunggu, jika berwarna ungu kehitaman maka ekstrak tersebut mengandung fenol dan tannin. b. Uji Flavonoid Ekstrak daun sirsak dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian dilarutkan dalam 1-2 ml metanol panas 50%. Setelah itu ditambah logam Mg dan 0,5 ml HCl pekat. Larutan berwarna merah atau jingga yang terbentuk, menunjukkan adanya flavonoid. 3.4.2.3 Pembuatan Media DMEM Pembuatan 100 ml stok media DMEM adalah 1.35 g, NaHCO 3 0.37 g, hepes 0.238 g, penicilin 0.06 g, streptomiycin 0.01 g, fungizone 100 µl, dan semua bahan dilarutkan dalam DI steril sebanyak 100 ml. Bahan-bahan tersebut dihomogenkan dan disaring menggunaka filter single use 0.2 µm didalam Laminar Air Flow (LAF). Media yang digunakan sebagai kultur sel otak baby hamster adalah campuran media stock dengan 10 % suplementasi FBS (Fetal Bovine Serum). Sedangkan untuk washing sel menggunakan NaCl fisiologis, PBS dan medium non serum.
44 3.4.2.3 Pembagian kelompok Sampel Sampel kultur sel otak baby hamster dikelompokkan menjadi 7 kelompok. a. Kelompok K (-) : sel otak baby hamster + DMEM+ 10% FBS b. Kelompok K (+) : sel otak baby hamster +DMEM+10% FBS + 0,1 µg/ml DMBA + rebusan daun sirsak (Annona muricta L) 0 µg/ml c. Kelompok P1 : sel otak baby hamster +DMEM+10% FBS + 0,1 µg/ml DMBA + Rebusan daun sirsak (Annona muricta L) 10 µg/ml d. Kelompok P2 : sel otak baby hamster +DMEM+10% FBS + 0,1 µg/ml DMBA + Rebusan daun sirsak (Annona muricta L) 20 µg/ml e. Kelompok P3 : sel otak baby hamster +DMEM+10% FBS + 0,1 µg/ml DMBA + Rebusan daun sirsak (Annona muricta L) 40 µg/ml f. Kelompok P4 : sel otak baby hamster +DMEM+10% FBS + 0,1 µg/ml DMBA + rebusan daun sirsak (Annona muricta L) 80 µg/ml g. Kelompok P5 : sel otak baby hamster +DMEM+10% FBS + 0,1 µg/ml DMBA + rebusan daun sirsak (Annona muricta L) 160 µg/ml. 3.4.3 Isolasi Sel Otak Baby Hamster Baby hamster yang berumur 2 hari didislokasi, dibedah dengan gunting steril dan diambil seluruh otaknya dengan pinset steril kemudian dicuci dalam NaCl fisiologis steril yang ditambah antibiotik sebanyak dua kali, dilanjutkan dicuci dengan PBS ditambah antibiotik, selanjutnya dicacah dalam tripsin dan PBS (1:1),
45 kemudian diinkubasi selama 20 menit. Selanjutnya disaring dan ditambahkan PBS, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge. Disentrifuge 1500 rpm selama 10 menit, kemudian dibuang supernatan dan pelet ditambah DMEM dengan serum 0% yang ditambah antibiotik, disentrifuge kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Selanjutnya dibuang supernatan disisakan pellet 1 ml, selanjutnya dipipeting dan diambil 100 µl yang dimasukkan dalam tissue culture dish yang telah berisi DMEM lengkap, FBS 10% dan Antibiotik. Diinkubasi. 3.4.4 Perlakuan Pemberian Dimetilbenz(α)Antrasen dan Rebusan Daun Sirsak (Annona muricata L) Pemberian DMBA pada sel yaitu saat awal penanaman, media DMEM+ serum 10% ditambahkan DMBA dengan konsentrasi 0,1 µg/ml. Setelah semua bercampur kemudian media yang berisi DMEM, serum 10% dan DMBA dimasukkan ke Well yang berisi 24 dan ditanami sel otak sebanyak 50 ul selama 48 jam kemudian diamati, jika sudah mengalami perubahan menjadi sel kanker maka dilakukan washing dan diberi perlakuan rebusan daun sirsak dengan konsentrasi berbeda. Setelah 48 jam, sel diamati dan dihitung menggunakan rumus haemacytometer.
46 3.4.5 Pengamatan dan Perhitungan 3.4.5.1 Pengamatan Konfluen Pengamatan konfluen sel dilakukan untuk melihat pertumbuhan sel otak baby hamster yang telah dipapar dengan dimetilbenz(a)antrasen (DMBA). Konfluen sel dilihat dari prosentase sel yang tumbuh homogen atau meratanya sel sebagai sel monolayer sampai menutupi cover glass. Pengamatan konfluen sel dilakukan setelah 24 jam 3.4.5.2 Pengukuran Sitotoksisitas Uji sitotoksisitas yang dilakukan dalam penelitian ini adalah uji sitotoksisitas secara langsung yang dilakukan secara manual dengan menghitung jumlah sel hidup dibandingkan dengan sel mati. Media dibuang, sel otak dicuci dengan 1 ml PBS ditambah 10 µl fungizon sebanyak 2x, diberi tripsin EDTA 1 ml dan dikocok pelan. Diinkubasi selama 25 menit, hasil tripsin dimasukkan ke dalam tabung sentrifus kemudian ditambah 1 ml PBS dan antibiotic, disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 13000 rpm, supernatant dibuang dan pellet ditambah 1 ml PBS dan antibiotic, disentrifugasi. Diambil pellet sebanyak 100 µl. kemudian diamati dibawah mikroskop dengan pewarna tripan blue 0,5% karena tripan blue tidak mengubah integritas membran plasma dan memperlambat proses kematian sel. Tripan blue memfasilitasi identifikasi sel yang akan dilihat dengan mikroskop (Bolt, 2001). Kepadatan sel otak dihitung dengan menggunakan haemocytometer, perhitungan sel dilakukan pada 5
47 bilik hitung yang masing- masing terdiri dari 16 kotak dan diambil rata- ratanya, kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor koreksi untuk setiap bidang besar (volumenya 10-4 ml), jumlah sel dihitung dengan rumus : n/5xpx10 4 sel/ml Keterangan : n = jumlah sel dalam 4 bilik 5 = jumlah bilik haemocytometer yang dihitung 10 4 = 1 ml per kapasitas haemocytometer P = faktor pengenceran Presentase kematian sel dengan metode perhitungan langsung (viable cell count) dihitung menggunakan rumus yang dipakai oleh Doyle dan Griffith yaitu : % viabilitas = jumlah sel yang hidup x 100% Jumlah sel hidup + mati % kematian = 100%- % viabilitas Angka persen kematian yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.
48 3.4.5.3 Pengamatan Apoptosis Sel Otak Pengamatan apoptosis sel otak yang telah diberi perlakuan menggunakan tripan blue saat perhitungan sel. Sel yang mati terserap warna biru sedangkan sel yang hidup bening tanpa terwarnai. 3.4.6 Analisis Data Untuk mengetahui peran ekstrak daun sirsak dalam media kultur terhadap proliferasi sel otak baby hamster, diambil data dari hasil pengamatan yang sudah dilakukan, diuji statistik dengan analisis probit untuk menentukann nilai LC50. Analisis dengan model probit merupakan kependekan dari Probability Unit, yaitu model peluang tertua yang pertama kali diperkenalkan oleh Bliss. Selanjutnya model ini dikembangkan dan dipelajari oleh Finney pada tahun 1977. Penggunaan analisis regresi probit sejauh ini sering digunakan untuk menguji daya racun suatu jenis tumbuhan terhadap penyakit, sehingga bermanfaat untuk menentukan tingkat dosis terhadap presentasi kematian objek yang diinginkan. Analisis data uji toksisitas dengan analisis probit untuk menghitung nilai LC50 (Lenny, 2006).
49 Table 3.1 Data Konfluen Kultur Primer Sel otak Baby Hamster yang dipapar DMBA yang diberi rebusan daun sirsak (Annona muricata Linn) Perlakuan Konfluenitas sel 1 hari 2 hari 4 hari Total Rata-rata U1 U2 U3 U1 U2 U3 U1 U2 U3 K(-) K(+) P1 P2 P3 P4 P5 Tabel 3.2 Data Sitotoksisitas Menggunakan Metode Pewarnaan Tripan Blue 0,5 % Konsentrasi (µg/ml) 10 Log konsentrasi Probit % viabilitas % kematian 20 40 80 160