3. METODE PENELITIAN

3. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap. Tahap preparasi dan pembuatan sosis fermentasi ikan patin (formula dan reformulasi bahan) dilakukan di Laboratorium Preparasi dan Diversifikasi Pengolahan Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK). Tahap pembuatan kultur starter bakteri asam laktat L. plantarum 1B1 dilakukan di Laboratorium Produksi dan Mikrobiologi Ruminansia Besar Fakultas Peternakan (LARUMBA) Fakultas Peternakan (FAPET). Tahap analisis sosis fermentasi ikan patin terdiri dari pengujian mikrobiologi dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi FAPET, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan FPIK dan Laboratorium Mikrobiologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian (FATETA). Pengujian ph dan a w, dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan FPIK dan Laboratorium Kimia Pangan FATETA. Pengujian sensori dilakukan di Laboratorium Sensori Teknologi Hasil Perairan FPIK. Pengujian asam amino dan asam lemak dilakukan di Laboratorium BALITBANG Pascapanen Pertanian, Kementerian Pertanian, Cimanggu. Pengujian asam amino bebas dilakukan di Laboratorium Biokimia Terpadu, Institut Pertanian Bogor (IPB). Waktu penelitian berlangsung dari bulan November 2009-bulan Juli 2010. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Bahan Bahan yang digunakan dalam pembuatan kultur starter bakteri asam laktat L. plantarum diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi FAPET, susu skim steril, sukrosa, de Man Rogosa Sharpe (MRS) Broth, de Man Rogosa Sharpe (MRS) Agar dan aquades. Bahan baku untuk pembuatan sosis fermentasi adalah ikan patin, selongsong, gula, es batu, minyak nabati (jagung), tepung tapioka,bakteri asam laktat L. plantarum 1B1, lada, bawang putih, bawang bombay, garam (NaCl), angkak, Isolate Soy Protein (ISP) dan karagenan jenis SR.EC.01 (produksi CV. Ocean Fresh). Bahan pengasapan terdiri dari serbuk gergaji, tempurung kelapa dan sabut kelapa. Bahan untuk analisa proksimat terdiri atas aquades, K 2 SO 4, HgO, H 2 SO 4, NaOH 30%, H 3 B0 3, indikator tashiro, HCl 0,02

38 N, kloroform, petroleum eter, NaCl jenuh, HCl 6 N, es kering-aseton, HCl 0,01 N, n-oktil alkohol, buffer kalium borat, peraksi OPA, asam sulfosalisilat 5%, NaOH 0,5 N-metanol, pikoiotiosianat, trimetilamin, natrium asetat 1 M, bourtiflouridmetanol, heksan, ninhidrin, etanol 95%, silika gel dan alkohol 95%. Bahan analisis mikrobiologi terdiri atas Plate Count Agar (PCA), Buffered Peptone Water (BPW) 0,1%, Butterfield s phosphate-buffered water (KH 2 PO 4 ), sodium klorida 0,85%, aquades, de Man Rogosa Sharpe (MRS) Broth, de Man Rogosa Sharpe (MRS) Agar, Lauryl Sulfate Tryptose (LST) Broth, Escherichia Coli (EC) Broth, Levine-Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar, Lactose Broth (LB), Rappapport-Vassiliadis (RV), Tetrathionate (TT) Broth, Bismuth Sulfite (BS) Agar, Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar, Hectoen Enteric (HE) Agar, Triple Sugar Iron (TSI) Agar, Lysin Eisen (LI) Agar, Baird Parker Agar (BPA), egg yolk tellurite emulsion, Potato Dextros Agar (PDA). 3.2.2 Alat Alat yang digunakan dalam preparasi ikan patin dan pembuatan sosis fermentasi meliputi pisau, talenan, wadah, kain saring, timbangan, grinder, food processor, blender, stuffer, steamer dan smoke house. Alat yang digunakan untuk kultur starter dan analisis mikrobiologi terdiri atas alat-alat gelas, pipet, mikropipet, oven, inkubator, timbangan analitik, pemanas listrik, sudip, autoklaf, bunsen, laminar, shaker, pipet ukuran 1 ml steril, jarum inokulasi, stomacher, tabung Durham, stick hockey, kantong steril, slide kaca, mikroskop dan tabel Most Probable Number (MPN). Alat analisis kimia terdiri atas cawan logam, cawan porselin, vial (botol kaca), ampul, desikator, oven, timbangan analitik, pemanas listrik, bunsen, steam bath, hot plate, tanur, destilator, buret, corong, pipet, mikropipet, labu takar 50 ml, erlenmeyer 125 ml, labu soxhlet, extractor sochlet, alat kondensor, ph-meter Orion 410 A, a w -meter WA-360, kertas saring Whatman no.40 (kertas milipore), freeze dryer, kromatografi gas, eppendrof, Flame Ionization Detector (FID), mortar, parafilm, dan High Performance Liquid Chromatogaphy (HPLC). Alat uji sensori terdiri dari lembar kerja (score sheet), piring stearofoam dan kantong plastik steril.

39 3.3 Tahapan Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu tahap pendahuluan dan tahap lanjutan. Tahap pendahuluan meliputi kultur bakteri asam laktat L. plantarum 1B1, preparasi ikan patin, pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula bahan sosis A 1, A 2, A 3 (formula bahan sosis pada Tabel 5). Tujuan pada tahapan pendahuluan ini awalnya dilakukan kultur bakteri asam laktat L. plantarum yang dilakukan penyegaran dalam susu skim steril sebagai kultur kerja yang telah memenuhi syarat sebagai kultur starter, yakni 10 7 CFU/mL, selanjutnya tahap preparasi ikan patin untuk mendapatkan daging lumat atau surimi mentah sebagai bahan baku utama dalam pembuatan sosis fermentasi ikan patin. Hasil berupa surimi mentah ikan patin disimpan dalam freezer untuk selanjutnya diolah. dan pembuatan sosis fermentasi ikan patin ini dilakukan pada masing-masing formula bahan sosis tersebut. Selanjutnya tahap pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula bahan sosis A 1, A 2 dan A 3 untuk memperoleh satu formula bahan sosis terpilih. Tahap lanjutan meliputi pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan reformulasi bahan dari formula bahan A1, A 2 dan A 3, bertujuan untuk memperoleh satu formula bahan sosis terpilih dan pembuatan sosis fermentasi hanya dilakukan pada satu formula bahan sosis tersebut. Selanjutnya sosis fermentasi ikan patin dengan formula bahan terpilih dilakukan penyimpanan pada suhu ruang dengan pengamatan hari ke-0, ke-4, ke-8, ke-12 dan hari ke-16 serta dilakukan analisis. Analisis yang dilakukan meliputi analisis sensori rating intensitas dan hedonik, mikrobiologi terdiri dari total koloni mikroba (TPC), bakteri asam laktat, Escherichia coli, Staphylococcus sp, Salmonella sp, dan kapang/khamir serta analisis kimia terdiri dari analisis proksimat, asam amino, asam amino bebas dan asam lemak. 3.3.1 Tahap pendahuluan Tahap pendahuluan meliputi kultur bakteri asam laktat L.plantarum 1B1, preparasi ikan patin dan pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula bahan sosis A 1, A 2 dan A 3.

40 Kultur bakteri asam laktat Lactobacillus plantarum 1B1 Tahap kultur bakteri asam laktat L. plantarum dilakukan sebelum tahap pembuatan sosis fermentasi ikan patin. Bakteri tersebut diperoleh dari Laboratorium Peternakan (FAPET) dan disegarkan lebih dahulu pada media MRS-Broth (Lampiran 13). Penyegaran koloni bakteri asam laktat L. plantarum 1B1 dilakukan yaitu diambil sebanyak 1 ml dan diinokulasi ke dalam media MRS Broth 9 ml selama waktu 24 jam dan diinkubasi pada suhu 37 o C. Hasil dari penyegaran tersebut, diambil sebanyak 1 ml dan diinokulasi ke dalam larutan susu skim steril 10% dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama waktu 48 jam yang disebut sebagai kultur induk. Dengan metode yang sama dilakukan untuk memperoleh kultur antara. Hasil kultur antara dengan metode yang sama dilakukan untuk memperoleh kultur kerja. Hasil dari kultur kerja selanjutnya ditumbuhkan pada media MRS Agar untuk memperoleh koloni bakteri asam laktat L. plantarum. Kultur kerja dapat digunakan pada pembuatan sosis fermentasi ikan patin apabila jumlahnya telah memenuhi syarat yakni mencapai 10 7 CFU/mL. Kultur starter bakteri asam laktat yang digunakan pada produk pangan yakni 10 7-10 8 CFU/mL (Ishibashi & Shimamura (1993) ; Rebucci et al. (2007) ; Adams & Moss (2008) ; Arief et al. (2008)). Diagram alir kultur bakteri asam laktat disajikan pada Gambar 7. Kultur murni bakteri L. plantarum 1B1, diperoleh dari lab.mikrobiologi Fakultas Peternakan, IPB Penyegaran pada media MRS Broth selama 24 jam, inkubasi pada suhu 37 o C Ditumbuhkan 1 ml dari kultur induk ke larutan susu skim 10%, di inkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam (hasil disebut kultur antara) Ditumbuhkan 1 ml dari media MRS Broth ke dalam larutan susu skim steril 10%, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam (hasil disebut kultur induk) Ditumbuhkan 1 ml dari kultur antara ke larutan susu skim 10%, di inkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam (hasil disebut kultur kerja) ditumbuhkan pada media MRS Agar Dihitung populasinya Gambar 7 Diagram alir kultur starter bakteri asam laktat (Adams & Moss (2008 ; Arief et al. 2008).

41 Preparasi ikan patin Preparasi ikan patin yang dilakukan meliputi pencucian ikan patin dengan menggunakan air dingin bersih, penghilangan tulang, filleting, penggilingan fillet, pencucian daging lumat dengan menggunakan air dingin suhu 0-5 o C dan dilakukan penyaringan sebanyak dua kali dengan menggunakan kain saring. Setelah itu daging ikan patin lumat atau surimi mentah tersebut diletakkan dalam wadah plastik steril dan ditimbang untuk selanjutnya digunakan pada tahap pembuatan sosis fermentasi ikan patin. Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan formula bahan sosis A1, A 2 dan A 3 Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan menggunakan bahan baku daging ikan patin, tepung tapioka, minyak nabati (minyak jagung), garam, gula, bumbu, L. plantarum 1B1, ISP, karagenan, angkak, susu skim dan es batu. Penambahan bahan pada sosis fermentasi ikan patin ini juga berdasarkan hasil penelitian terdahulu mengenai bahan sosis fermentasi daging sapi yang dilakukan oleh Arief (2008) yang disajikan pada Tabel 4. Tabel 4 Formula bahan sosis fermentasi daging sapi Bahan Daging sapi (g) Minyak nabati (ml) Tepung tapioka (g) Garam (g) Es batu (g) Bawang putih (g) Gula pasir (g) Kultur bakteri L.plantarum (ml) Lada halus (g) Sumber : Arief (2000). Formula 0 60 20 200 12,5 12,5 20 5 Berdasarkan formula bahan sosis fermentasi daging sapi seperti pada Tabel 4, pada penelitian ini dilakukan modifikasi formula untuk memperoleh formula sosis fermentasi dengan bahan baku ikan patin. Modifikasi formula yang dilakukan yaitu dengan penambahan bahan sosis fermentasi berupa angkak, Isolate Soy Protein (ISP), karagenan dan bumbu berupa bawang bombay. Formula bahan sosis fermentasi ikan patin pada penelitian ini disajikan pada Tabel 5.

42 Tabel 5 Formula bahan sosis fermentasi ikan patin No Bahan Jumlah (A 1 ) 1. Daging ikan (g) 0 2. Minyak nabati (ml) 150 3. Tepung tapioka (g) 4. Garam (g) 35 5. Bawang putih (g) 6. Gula pasir (g) 40 7. Bakteri L. Plantarum (ml) 10 8. Lada halus (g) 2 9. Isolat Soy Protein (g) - 10. Karagenan (g) 20 11. Angkak (g) 5 12. Susu skim (g) 50 13. Bawang bombay (g) 14. Es batu (g) Jumlah (A 2 ) 0 150 35 40 10 2-10 4 75 Jumlah (A 3 ) 0 150 125 35 40 10 2 2-3 50 Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dilakukan setelah dipersiapkan ketiga formula A 1, A 2, A 3 dan kultur starter bakteri asam laktat L. plantarum 1B1. Daging lumat berupa surimi mentah ikan patin yang telah disiapkan digiling menggunakan food processor dan ditambahkan berturut turut garam, bawang putih, bawang bombay, lada, gula, ISP, karagenan, susu skim, angkak, tepung tapioka, minyak jagung dan terakhir kultur kerja bakteri L. plantarum 1B1 serta dihomogenkan. Setelah itu, adonan tersebut dimasukkan ke dalam casing dengan menggunakan stuffer dan diikat sepanjang 10 cm. Selanjutnya dilakukan pengukusan dengan menggunakan steamer pada suhu 40 o C selama 30 menit. Pengukusan bertujuan untuk pembentukan gel pada sosis fermentasi ikan patin dengan melalui tahap gelasi myosin selama pemanasan yaitu melalui tahap pertama pada suhu 4-41 o C. Pada tahapan pengukusan, bakteri asam laktat L. plantarum 1B1 yang terdapat dalam adonan sosis tersebut sesuai dengan suhu pertumbuhan yaitu suhu optimum bakteri L. plantarum adalah 37 o C dan maksimum adalah 45 o C. Setelah selesai pengukusan, kemudian dilakukan proses conditioning pada suhu ruang selama waktu 24 jam. Semua proses pembuatan sosis fermentasi ikan patin ini dilakukan pada kondisi higienis. Proses conditioning sosis fermentasi ikan patin setelah 24 jam, selanjutnya dilakukan proses pengasapan di dalam smoke house. Proses pengasapan yang dilakukan adalah pengasapan dingin pada suhu 30 o C selama 3 hari, masing

43 masing 3 jam per hari. Setiap hari dilakukan pengasapan selama 3 jam. Sumber asap berasal dari tempurung, sabut kelapa, dan serbuk gergaji. Pengaturan suhu asap dingin dilakukan dengan cara dijauhkan dari sumber asap yang terdapat dalam smoke house, dan diletakkan botol mineral berisi air yang telah dibekukan. Skema proses pembuatan sosis fermentasi ikan patin dapat dilihat pada Gambar 8. Surimi mentah ikan patin Digrinder Pencampuran dan pengadukan adonan (formula A 1, A 2 dan A 3 ) Pengisian ke dalam selongsong (casing) sepanjang 10 cm, diikat dengan benang kasur Pengasapan pada suhu 30 o C selama 3 hari masing masing 3 jam (Sano et al. 1988) Garam,bumbu,gula,ISP,su su skim, karagenan, angkak, minyak jagung, tepung tapioka, bakteri L. plantarum Disteam pada suhu 40 o C selama 30 menit (Sano et al. 1988) Proses conditioning pada suhu ruang selama 24 jam Sosis fermentasi ikan patin Analisis sensori (uji rating intensitas dan uji hedonik) formula A 1, A 2 dan A 3 Reformulasi bahan sosis formula bahan dengan nilai tertinggi (A 1 dan A 3 ) Sosis fermentasi ikan patin dengan formula terpilih Gambar 8 Proses pembuatan sosis fermentasi ikan patin formula terpilih. Sosis fermentasi ikan patin berdasarkan formula A 1, A 2, A 3 kemudian dilakukan uji sensori rating intensitas dan hedonik. Hasil uji sensori rating intensitas dan hedonik dengan nilai tertinggi, selanjutnya dilakukan reformulasi bahan yang bertujuan untuk memperoleh sosis fermentasi ikan patin formula terpilih.

44 3.3.2 Tahap lanjutan Tahap lanjutan meliputi pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan reformulasi bahan dari formula bahan A 1, A 2 dan A 3, penyimpanan sosis fermentasi ikan patin formula terpilih pada suhu ruang dan dilakukan analisis yang meliputi analisis sensori hedonik, mikrobiologi (TPC), bakteri asam laktat L. plantarum 1B1, bakteri E. coli, Staphylococcus sp., Salmonella sp. dan kapang/khamir), kimia (ph dan a w ) serta sosis fermentasi ikan patin dengan penyimpanan terpilih dilakukan analisis kimia (asam amino, asam amino bebas dan asam lemak). Pembuatan sosis fermentasi ikan patin dengan reformulasi bahan sosis A1, A 2 dan A 3 Sosis fermentasi ikan patin berdasarkan hasil uji sensori rating intensitas dan hedonik yang memiliki nilai tertinggi dari ketiga formula A1, A 2, A 3 meliputi kategori tekstur, warna, aroma dan rasa dilakukan reformulasi bahan untuk memperoleh formula terpilih. Reformulasi bahan yang dilakukan adalah tepung tapioka, ISP, karagenan dan angkak. Hasil reformulasi bahan sosis fermentasi ikan patin disajikan pada Tabel 6. Tabel 6 Hasil reformulasi bahan formula terpilih sosis fermentasi ikan patin Bahan Daging ikan (g) Minyak nabati (ml) Tepung tapioka (g) Garam (g) Bawang putih(g) Gula pasir(g) Bakteri L. plantarum (ml) Lada halus(g) Isolat Soy Protein(g) Karagenan (g) Angkak (g) Susu skim (g) Bawang bombay (g) Es batu (g) Jumlah Bahan 0 150 125 25 60 10 2 2 20 5 50 Reformulasi bahan sosis fermentasi ikan patin juga dilakukan berdasarkan kelebihan dan kekurangan dari ketiga formula (A 1, A 2, A 3 ) untuk memperoleh satu formula bahan sosis fermentasi ikan patin. Reformulasi bahan sosis

45 fermentasi ikan patin berupa satu formula bahan selanjutnya dilakukan uji sensori hedonik secara keseluruhan (tekstur, warna, aroma dan rasa), untuk memperoleh formula bahan terpilih. Analisis selama penyimpanan suhu ruang dari sosis fermentasi ikan patin formula terpilih Sosis fermentasi ikan patin formula terpilih selanjutnya disimpan pada suhu ruang selama 16 hari. Selama penyimpanan, dilakukan analisis sensori (hedonik), analisis mikrobiologi meliputi TPC, koloni bakteri asam laktat L plantarum 1B1, E. coli, Staphylococcus sp., Salmonella sp., dan kapang/khamir serta analisis kimia (ph dan a w ). Hasil sosis fermentasi ikan patin penyimpanan terpilih selanjutnya dilakukan analisis kimia yang meliputi asam amino, asam amino bebas, asam lemak, dan proksimat (kadar air, kadar abu, protein, lemak). Diagram alir sosis fermentasi ikan patin selama penyimpanan suhu ruang disajikan pada Gambar 9. Sosis fermentasi ikan patin formula terpilih Analisis Proksimat Sensori Penyimpanan suhu ruang selama 0, 4, 8, 12 dan 16 hari Sensori (hedonik) Mikrobiologi ph a w Sosis fermentasi ikan patin dengan waktu penyimpanan terpilih Disteam pada suhu 80 o C, 30 menit (Sano et al. 1988) Analisis Asam amino Asam amino bebas Asam Lemak Sosis fermentasi ikan patin formula terpilih Proksimat Gambar 9 Diagram alir sosis fermentasi ikan patin formula terpilih selama penyimpanan suhu ruang.

46 3.4 Prosedur Analisis Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi analisis sensori (uji rating intensitas dan uji hedonik), analisis mikrobiologi dan analisis kimia. 3.4.1 Analisis sensori Uji sensori menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk menilai mutu produk perikanan yang telah mengalami proses pengolahan. Uji sensori yang dilakukan dalam penelitian produk sosis fermentasi ikan patin ini meliputi uji rating intensitas (Meilgaard 1999) dan uji hedonik (SNI 01-2346-2006). a) Uji rating intesitas (skala kategori) (Meilgaard 1999). Uji rating intensitas bertujuan untuk menentukan suatu atribut sensori tertentu yang bervariasi diantara sejumlah contoh (jumlah contoh bervariasi dari 3-6 contoh). Panelis diminta menilai intensitas atribut sensori tertentu pada skala kategori dari beberapa contoh produk. Skala pengukuran yang dipakai adalah skala 5-poin, 7-poin atau 9-poin. Data yang diperoleh dari skala pengukuran kategori merupakan data ordinal. Data tersebut dianalisis dengan menstransfer data kategori ke dalam angka 1 sampai 7 (misalnya menggunakan skala 7-poin). Melalui penstransferan, data kategori dapat dianalisis dengan mengasumsikan sebagai data interval, sehingga data dapat dianalisis dengan analysis of varians (ANOVA). Panelis yang digunakan pada uji ini adalah panelis terlatih sebanyak 8-12 orang. Panelis diberitahukan terlebih dahulu untuk mengenal format pengujian yang digunakan serta maksud dari skala nilai yang telah ditetapkan (Lampiran 1). b) Uji hedonik (SNI 01-2346-2006) Uji hedonik digunakan untuk mengukur tingkat kesukaan terhadap produk dengan menggunakan lembar penilaian. Panelis yang digunakan adalah panelis non standar atau panelis yang tidak terlatih sebanyak 30 orang. Penilaian contoh yang diuji berdasarkan tingkat kesukaan panelis. Jumlah tingkat kesukaan bervariasi tergantung dari rentangan mutu yang ditentukan. Penilaian dapat diubah dalam bentuk angka dan selanjutnya dapat dianalisis secara statistik non parametrik dengan Kruskall Wallis, dilanjutkan dengan analisis sidik ragam

47 (ANOVA) untuk melihat perbedaan pada sampel. Jika berpengaruh nyata dapat dilanjutkan dengan uji Duncan (Lampiran 2 & 3). 3.4.2 Analisis Mikrobiologi a) Pengujian kuantitatif total koloni mikroba (Total Plate Count) (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009) Media total koloni mikroba (TPC) yang digunakan adalah Plate Count Agar (PCA) (Lampiran 4). Sampel diambil sebanyak 50 g, dilarutkan dengan 450 ml Butterfield s phosphate-buffered water (KH 2 PO 4 ) steril. Hasil tersebut sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10-1. Selanjutnya dipipet secara aseptik sampel larutan pengenceran 10-1 sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam larutan Butterfield s phosphate-buffered water 9 ml steril. Hasil tersebut sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10-2. Metode yang sama dilakukan sampai pada sampel larutan pengenceran 10-5. Selanjutnya dari setiap sampel larutan pengenceran, diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan steril secara duplo, kemudian ditambahkan media PCA steril sebanyak 15-20 ml dengan suhu ±45 o C. Selanjutnya cawan tersebut diratakan dengan melakukan gerakan membentuk angka delapan dan didiamkan sampai media pada cawan tersebut menjadi padat. Apabila media pada cawan telah padat, cawan dibalikkan dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni bakteri. Jumlah koloni bakteri dapat dihitung sebagai berikut: koloni/ml = rata rata jumlah koloni x faktor pengenceran atau /g b) Pengujian kuantitatif total bakteri asam laktat (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009) Media tumbuh untuk bakteri asam laktat yang digunakan adalah de Man Rogosa Sharpe (MRS) Agar (Lampiran 5). Sampel sebanyak 50 g dilarutkan dengan 450 ml Butterfield s phosphate-buffered water (KH 2 PO 4 ) steril untuk mendapatkan sampel dengan larutan pengenceran 10-1. Hasil sampel larutan pengenceran 10-1, dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan kedalam 9 ml larutan Butterfield s phosphate-buffered water (KH 2 PO 4 ) steril. Hasil tersebut sebagai sampel larutan dengan pengenceran 10-2. Demikian seterusnya dilakukan sampai pada sampel larutan pengenceran 10-9. Selanjutnya sampel larutan dari

48 pengenceran yang dikehendaki (10-6 - 10-9 ) diambil sebanyak 1 ml dan diletakkan ke dalam cawan steril dan dituangkan media MRS Agar steril sebanyak 15-20 ml dengan suhu ± 45 o C. Selanjutnya cawan tersebut diratakan dengan melakukan gerakan membentuk angkak delapan. Cawan didiamkan sampai media dalam cawan tersebut menjadi padat. Apabila media pada cawan tersebut sudah padat, cawan dibalikkan dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Selanjutnya dihitung total koloni bakteri asam laktat, sama seperti penghitungan pada total koloni mikroba. c) Pengujian kualitatif bakteri Escherichia coli (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009) Uji pendugaan coliform, fecal coliform dan Escherichia coli Sampel sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam wadah steril. Selanjutnya ditambahkan 450 ml larutan Butterfield s phosphate-buffered water steril ke dalam wadah yang berisi sampel, dihomogenkan dengan stomacher selama waktu 2 menit. Sampel larutan tersebut sebagai larutan pengenceran 10-1. Larutan pengenceran 10-1 dipindahkan dengan pipet steril sebanyak 1 ml ke dalam 9 ml larutan Butterfield s phosphate-buffered water steril untuk memperoleh larutan pengenceran 10-2. Metode yang sama dibuat untuk memperoleh larutan pengenceran 10-3. Selanjutnya dipipet 1 ml dari setiap larutan pengenceran yang digunakan (10-1 -10-3 ) ke dalam 3 seri tabung Durham yang berisi 9 ml larutan Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LSTB) steril (Lampiran 6) dan diinkubasi pada suhu 35 C selama 24±2 jam. Apabila setelah 24±2 jam belum terbentuk gas (negatif), maka ditambahkan waktu inkubasi 24 jam menjadi 48±2 jam. Apabila tabung tersebut telah terbentuk gas, maka tabung tersebut dinyatakan positif. Uji konfirmasi fecal coliform dan Escherichia coli dengan Most Probable Number (MPN) Sampel dalam tabung yang telah dinyatakan positif (uji pendugaan) dipindahkan dengan menggunakan jarum inokulasi ke dalam tabung yang telah berisi 9 ml Escherichia Coli Broth (ECB) steril (Lampiran 7) dan diinkubasi pada suhu 45,5 C selama 24 jam±2 jam. Apabila belum terbentuk gas (negatif), maka dapat diinkubasi kembali selama 48 jam±2 jam. Hasil uji dinyatakan positif bila

49 pada tabung tersebut terbentuk gas. Selanjutnya dengan menggunakan tabel MPN (Lampiran 8) untuk menentukan nilai MPN berdasarkan jumlah tabung ECB yang positif sebagai jumlah E.coli/mL atau E.coli/g. Fecal coliform dan E.coli yang terdapat dalam sampel tabung diinterpretasikan dengan mencocokkan kombinasi jumlah tabung yang positif berdasarkan tabel MPN. Kombinasi yang diambil, dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif dan pada pengenceran berikutnya terdapat tabung yang negatif. Uji bakteri Escherichia coli Sampel larutan tabung ECB positif (uji konfirmasi) diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan steril. Selanjutnya ditambahkan media Levine- Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar steril sebanyak 15-20 ml (Lampiran 9), dan digerakkan membentuk angka delapan agar media dan sampel larutan tersebar merata pada cawan tersebut dan dibiarkan sampai padat. Setelah itu diiinkubasi pada suhu 35 C selama 18-24 jam. Koloni bakteri E. coli berdiameter 2-3 mm, berwarna hitam atau gelap pada bagian pusat koloni, dengan atau tanpa metalik kehijauan yang mengkilat pada cawan tersebut. d) Pengujian kualitatif bakteri Salmonella sp. (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009) Pra-pengayaan Sampel sebanyak 25 g secara aseptik dimasukkan ke dalam wadah steril dan ditambahkan sebanyak 225 ml larutan Lactose Broth (LB) steril (Lampiran 10) dan dihomogenkan dengan stomacher selama waktu 2 menit. Hasil larutan berisi sampel tersebut, dipindahkan ke dalam erlenmeyer steril 500 ml dan diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam±2 jam. Pengayaan Sampel dari hasil pra-pengayaan tersebut dihomogenkan dan dipindahkan sampel tersebut masing masing sebanyak 0,1 ml ke dalam media Rappaport- Vassiliadis (RV) sebanyak 10 ml (Lampiran 11) dan 1 ml ke dalam media Tetrathionate (TT) Broth sebanyak 10 ml (Lampiran 12). Selanjutnya sampel dalam masing-masing media tersebut dihomogenkan. Sampel dengan dugaan cemaran bakteri Salmonella sp. tinggi (a high microbial load), pada sampel yang

50 berisi media RV diinkubasi pada suhu 42 C ± 0,2 C selama 24 jam±2 jam dan pada sampel yang berisi media TT Broth diinkubasi pada suhu 43 C±0,2 C selama 24 jam±2 jam. Sampel dengan dugaan cemaran bakteri Salmonella sp. rendah (low microbial load), sampel yang berisi media RV diinkubasi pada suhu 42 C±0,2 C selama 24 jam±2 jam, dan sampel yang berisi media TT Broth diinkubasi pada suhu 35 C±2,0 C selama 24 jam±2 jam. Uji bakteri Salmonella sp. Sampel pada media pengayaan RV dan TT Broth dihomogenkan, kemudian sampel dalam media pengayaan TT Broth distreak (digores) dengan menggunakan jarum inokulasi pada media Bismuth Sulfite (BS) Agar (Lampiran 13), Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar (Lampiran 20) dan Hectoen Enteric (HE) Agar (Lampiran 14). Metode tersebut diulangi lagi untuk sampel dalam media pengayaan RV. Selanjutnya media Bismuth Sulfite (BS) Agar, Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar dan Hectoen Enteric (HE) Agar yang telah distreak masing masing dengan sampel dalam media pengayaan RV dan TT Broth, diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam ±2 jam. Tipe morfologi koloni bakteri Salmonella sp. Tipe morfologi koloni bakteri Salmonella sp. yaitu sebagai berikut: a) koloni bakteri pada cawan media Bismuth Sulfite (BS) Agar berwarna coklat, keabuan atau kehitaman, terkadang metalik. Di sekitar koloni bakteri berwarna coklat, namun semakin lama waktu inkubasi koloni tersebut akan berubah menjadi warna hitam, hasil tersebut dinamakan halo effect. b) koloni bakteri pada cawan media Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar berwarna merah muda dengan atau tanpa bintik hitam. c) koloni bakteri pada cawan Hectoen Enteric (HE) Agar berwarna biru kehijauan, biru dengan atau tanpa titik hitam. Hasil koloni bakteri yang terlihat pada cawan BS agar setelah diinkubasi selama 24 jam±2 jam pada suhu 35 o C, selanjutnya diinokulasi ke media miring Triple Sugar Iron (TSI) Agar (Lampiran 15) dan Lysine Iron Agar (LIA) (Lampiran 16) dengan cara menusuk ke dasar media dan juga digores pada media miring tersebut dan diinkubasi selama 24 jam±2 jam pada suhu 35 C. Koloni

51 bakteri Salmonella sp. pada media TSI Agar, menghasilkan koloni bakteri berwarna merah (reaksi basa) pada media miring TSI Agar dan koloni bakteri berwarna kuning pada dasar tabung (reaksi asam) dengan atau tanpa memproduksi H 2 S (bertanda warna kehitaman) pada media TSI Agar tersebut. Koloni bakteri Salmonella sp. pada media LIA, menghasilkan warna ungu (adanya reaksi basa) pada dasar tabung media dan koloni bakteri warna kuning (adanya reaksi asam) pada dasar tabung media tersebut menandakan terjadi reaksi asam (negatif). Beberapa bakteri Salmonella sp. memproduksi H 2 S pada media LIA. e) Pengujian bakteri Staphylococcus sp. (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009) Sampel ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan dalam wadah steril. Selanjutnya ditambahkan 450 ml Butterfield s phosphate-buffered water steril dan dihomogenkan dengan stomacher selama 1-2 menit. Larutan tersebut sebagai pengenceran 10-1. Selanjutnya dari larutan pengenceran 10-1 diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam larutan Butterfield s phosphate-buffered water steril sebanyak 9 ml dan dihomogenkan. Larutan tersebut sebagai larutan dengan pengenceran 10-2. Metode yang sama dibuat untuk pengenceran 10-3 atau sampai pada pengenceran yang dikehendaki. Pengujian dengan media Baird Parker Agar (BPA) Media yang digunakan pada pengujian ini adalah Baird Parker Agar (BPA) (Lampiran 17). Media BPA sebanyak 58 gr dilarutkan ke dalam aquades 950 ml yang telah ditambahkan egg yolk tellurite emulsion sebanyak 50 ml (Lampiran 18) dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan tersebut dituang pada cawan steril sebanyak 15-20 ml dan didiamkan sampai media pada cawan tersebut menjadi padat. Diambil 1 ml sampel larutan pengenceran yang diperlukan (10-1 -10-3 ) ke atas permukaan media padat BPA dan diratakan dengan menggunakan hockey stick. Cawan tersebut didiamkan sampai sampel larutan terserap. Larutan sampel yang telah terserap pada cawan tersebut, kemudian diinkubasi pada suhu 35 o C selama 45-48 jam dengan posisi cawan terbalik. Diseleksi cawan tersebut yang mengandung jumlah koloni bakteri yaitu 20-200 koloni. Untuk koloni bakteri S. aureus memiliki ciri koloni bakteri berbentuk

52 bundar, halus, cembung dengan diameter 2-3 mm di permukaan media, berwarna keabuan sampai hitam pekat, terkadang dengan zona terang (off-white) di sekelilingnya (zona opak) dengan atau tanpa zona terang (clear zone). f) Pengujian kapang/khamir (Bacteriological Analytical Manual (BAM) 2009) Sampel ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan ke dalam wadah steril kemudian ditambahkan 450 ml larutan Buffer Peptone Water (BPW) 0,1% steril dan dihomogenkan dengan stomacher selama 2 menit. Homogenat tersebut sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10-1. Selanjutnya dipipet 1 ml larutan pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam 9 ml Buffer Peptone Water (BPW) 0,1% steril untuk memperoleh larutan pengenceran 10-2. Dengan metode yang sama tersebut, dilakukan untuk memperoleh larutan dengan pengenceran 10-3 sampai dengan larutan pengenceran 10-5. Sampel dari larutan pengenceran 10-1 -10-5 dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam cawan steril. Dilakukan secara duplo untuk setiap sampel larutan pengenceran. Selanjutnya ditambahkan media Potato Dextros Agar (PDA) steril (Lampiran 19) yang telah ditambahkan asam tartarat 10% yaitu 12-15 ml yang telah didinginkan (suhu 45±1) o C ke dalam masing masing cawan steril yang sudah berisi sampel larutan pengenceran tersebut. Dilakukan gerakan cawan membentuk angka delapan agar media dalam cawan tersebut tersebar merata. Media dalam cawan tersebut didiamkan sampai padat dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 35 o C selama 48 jam±2 jam dengan posisi cawan terbalik. Setelah diinkubasi koloni kapang/khamir dapat dihitung seperti pada penghitungan total koloni mikroba. 3.4.3 Analisis proksimat a) Analisis kadar air (Association of Official Analitical Chemist (AOAC 2005)) Analisis kadar air dilakukan menggunakan metode oven. Cawan kosong dikeringkan dalam oven suhu -102 o C selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator sampai mencapai suhu ruang dan ditimbang (A). Sampel sebanyak 5 g diletakkan pada cawan tersebut (B). Cawan yang berisi sampel dikeringkan ke

53 dalam oven bersuhu -102 o C selama 6 jam atau untuk produk yang tidak mengalami dekomposisi dengan pengeringan yang lama, dapat dikeringkan selama 1 malam (16 jam). Selanjutnya cawan dipindahkan ke dalam desikator sampai beratnya konstan dan ditimbang (C). Kadar air ditentukan dengan rumus : Kadar Air % = B C x % B A Keterangan : A = Bobot cawan kosong B = Bobot cawan + contoh sebelum dikeringkan C = Bobot cawan + contoh sesudah dikeringkan. b) Analisis kadar abu (AOAC 2005) Cawan pengabuan disiapkan, kemudian dibakar dalam tanur, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel sebanyak 5 g ditimbang dalam cawan tersebut, diletakkan ke dalam tanur pengabuan, dibakar sampai diperoleh abu berwarna abu atau sampai beratnya tetap. Pengabuan dilakukan selama dua tahap; pertama pada suhu sekitar 400 o C dan kedua pada suhu 550 o C. Selanjutnya sampel didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Penentuan kadar abu menggunakan rumus : Kadar abu (%) = berat abu (g) x berat sampel (g) c) Analisis kadar protein (AOAC 2005) Penetapan kadar protein dengan metode Kjeldahl meliput i tiga tahap yaitu dekstruksi, destilasi dan titrasi. Tahapan dekstruksi yakni sampel 0,1-0,2 g dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 50 ml dan ditambah sebanyak 2,0 mg K 2 SO 4, 40 mg HgO dan 10 ml H 2 SO 4. Kemudian di dekstruksi selama 30 menit hingga larutan berwarna menjadi hijau jernih. Setelah dekstruksi, sampel dibiarkan sampai dingin dan dipindahkan ke dalam labu takar 50 ml dan diencerkan dengan aquades hingga batas tera. Selanjutnya dilakukan destilasi yaitu dengan memasukkan sampel tersebut sebanyak 5 ml ke dalam destilator dan ditambahkan 10 ml NaOH 30% sampai berwarna coklat kehitaman, dan didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam Erlenmeyer 125 ml yang berisi

54 larutan 5 ml H 3 BO 3 dan dititrasi dengan HCl 0,02 N hingga berwarna merah jambu. Larutan blanko untuk koreksi adanya senyawa nitrogen (N) yang berasal dari regensia yang digunakan dianalisis seperti sampel. Kadar N dihitung berdasarkan rumus perhitungan kadar protein : % kadar protein = 50/5 x (N x V) HCl x 14,007 x FK x % W x 0 Keterangan : Faktor 50 = Larutan contoh yang telah didekstruksi diencerkan 50 ml Faktor 5 = Banyaknya larutan contoh yang didestilasi N = Normalitas HCl yang digunakan V = volume HCl yang digunakan W = Berat sampel (mg) 14,700 = Berat atom Nitrogen FK = Faktor koreksi N-protein untuk ikan = 6,25. d) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) Analisis kadar lemak menggunakan metode ekstraksi soxhlet. Labu soxhlet kosong dikeringkan dalam oven suhu 105 o C selama 30 menit kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang (A). Sampel ditimbang sebanyak 5 g dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan dalam labu soxhlet (B). Selanjutnya kloroform atau petroleum eter sebanyak 150 ml dituangkan ke dalam labu soxhlet berisi sampel dan selanjutnya dimasukkan ke dalam extractor sochlet dan dipasang alat kondesor di atasnya dan labu lemak dibawahnya. untuk di refluks pada suhu 600 o C selama minimum 5 jam sampai pelarut yang kembali turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut yang tersisa dalam labu lemak di destilasi, setelah itu dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 o C lalu didinginkan ke dalam desikator dan ditimbang (C). Kadar lemak dihitung dengan rumus : % kadar lemak = [ (C A) / B] x % Keterangan : A = Bobot labu soxhlet kosong B = Bobot labu soxhlet + sampel sebelum diuapkan C = Bobot labu soxhlet + sampel sesudah diuapkan e) Analisis karbohidrat by-difference (AOAC 2005) Analisis karbohidrat dilakukan dengan menggunakan metode by difference yaitu dengan mengurangi nilai % dengan nilai kadar protein, kadar air, kadar lemak dan kadar abu.

55 Kadar karbohidrat dihitung dengan rumus : Kadar karbohidrat (%) = % -% (abu+lemak+protein+air). 3.4.3 Analisis Kimia a) Analisis ph (ph meter Orion 410 A) Prinsip analisis ph berdasarkan gabungan elektroda gelas hidrogen sebagai standar polimer dan elektroda kalomel referens, pasangan elektroda ini akan menghasilkan perubahan tegangan 59,1 mv/ph unit pada suhu 25 o C. Sampel sebanyak 10 g diencerkan dengan ± ml aquades, elektroda dari ph meter dicelupkan ke dalam sampel, nilai yang terbaca kemudian dicatat. Sebelumnya ph meter dikalibrasi dengan buffer 4 dan 7. b) Analisis a w (Shibaura a w meter WA-360) Analisis a w dilakukan dengan menggunakan a w -meter Shibaura WA-360. Sebelumnya alat dikalibrasi dengan menggunakan larutan NaCl jenuh pada kertas saring dan diletakkan pada cawan, kemudian nilai a w diset sampai dengan 0,7509. Sampel dipotong dengan ketebalan 0,2 cm dan diletakkan dalam cawan pengukur, setelah ditutup dan dikunci, alat dijalankan sampai menunjukkan tanda completed, nilai a w dapat dibaca. c) Analisis asam amino (Modifikasi AOAC 2005, Laboratorium Terpadu IPB) Tahap sebelumnya yaitu menentukan kadar protein dari sampel dengan metode Kjeldahl. Hasil berupa protein dianalisis pada tahap selanjutnya. Tahap hidrolisis asam amino yaitu 3 mg protein dimasukkan ke dalam ampul dan ditutup kemudian ditambahkan 1 ml HCl 6 N dan dikocok hingga homogen. Sampel larutan tersebut dibekukan dalam es kering aseton, yaitu freeze dryer dihubungkan dengan pompa vakum. Untuk mengeluarkan udara yang ada dalam sampel yang telah dibekukan, yakni dengan cara mengeluarkan penutup ampul dari dalam es kering-aseton. Pada saat sampel larutan dalam ampul mencair, udara yang terlarut dalam sampel larutan akan keluar. Jika gelembung udara terlalu banyak, atau keluar terlalu cepat, dimasukkan kembali ampul yang berisi sampel larutan ke dalam es kering-aseton dan divakum kembali. Cara ini diulangi sampai udara yang ada dalam sampel larutan dapat keluar seluruhnya. Jika masih ada gelembung udara, ditambahkan sebanyak 1 atau 2 tetes n-oktil alkohol sebagai

56 anti bubbling dan ampul tersebut divakum kembali selama 20 menit. Selanjutnya ampul dimasukkan ke dalam oven bersuhu o C selama 24 jam. Kemudian ampul tersebut didinginkan pada suhu ruang (telah dihidrolisis) dan setelah itu sampel larutan dalam ampul dipindahkan ke labu evaporator 50 ml dan ampul dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N. Cairan hasil bilasan tersebut dimasukkan ke dalam labu evaporator. Tahap pengeringan dilakukan dengan mengeringkan sampel menggunakan freeze dryer dalam keadaan vakum, untuk mengubah sistein menjadi sistin. Sampel larutan yang terdapat dalam labu evaporator, ditambahkan aquades sebanyak 10-20 ml dan dikeringkan dengan freeze dryer. Proses pengeringan ini diulangi sebanyak 2-3 kali. Selanjutnya ditambahkan 5 ml HCl 0,01 N ke dalam sampel larutan yang telah dikeringkan. Tahap derivatisasi yaitu sampel larutan yang telah dihidrolisis dalam 5 ml HCl 0,01 N, disaring dengan kertas milipore. Ditambahkan buffer kalium borat ph 10,4 dengan perbandingan 1:1. Sampel larutan sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam vial/labu dan ditambahkan pereaksi OPA sebanyak 25 µl. Selanjutnya dibiarkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Sampel larutan diinjeksi ke dalam kolom HPLC sebanyak 5 µl dan ditunggu selama ±25 menit sampai pemisahan semua asam amino selesai. Perhitungan kadar asam amino (%) dengan menggunakan rumus : Kadar asam amino (%) = d) Analisis kualitatif asam amino bebas dengan pereaksi ninhidrin (Wang 2006) Uji kualitatif asam amino bebas dengan menggunakan pereaksi ninhidrin untuk menentukan terdapatnya asam amino bebas dalam suatu bahan. Bila bereaksi dengan gugus amino pada asam amino bebas membentuk senyawa berwarna ungu, jika bereaksi dengan prolin dan hidroksiprolin akan berwarna kuning. Pereaksi ninhidrin terdiri dari 0,35 g ninhidrin dalam ml etanol sebanyak 95%. Uji kualitatif yaitu sampel ditimbang sebanyak 1 g, ditambahkan aquades sebanyak 2 ml dan dihaluskan. Larutan tersebut disentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Larutan supernatan diambil 0,5 ml dan

57 dicampur pelarut ninhidrin sebanyak 0,5 ml, ditempatkan pada tabung reaksi dan selanjutnya di homogenkan. Tabung ditutup rapat dengan parafilm, lalu dipanaskan pada suhu 80- o C selama 4-7 menit sampai berubah warna. Larutan berwarna ungu menunjukkan adanya asam amino bebas. Untuk menguji asam amino bebas secara kuantitatif dapat dilakukan melalui alat High Performance Liquid Chromatogaphy (HPLC). e) Analisis kuantitatif asam amino bebas (Modifikasi AOAC 2005, Laboratorium Terpadu IPB) Sampel sebanyak 2 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer ditambahkan 50 ml larutan asam sulfosalisilat 5% dan dikocok sampai homogen dan didiamkan sampai terjadi endapan maksimal. Selanjutnya sampel larutan dipindahkan ke labu 50 ml dan disaring dengan kertas milipore dan ditambahkan buffer kalium borat ph 10,4 dengan perbandingan 1:1. Setelah itu sampel larutan dimasukkan ke dalam labu sebanyak 10 µl dan tambahkan 25 µl pereaksi OPA, didiamkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Sampel larutan diinjeksi ke dalam kolom HPLC sebanyak 5 µl dan ditunggu selama ±25 menit sampai pemisahan semua asam amino bebas selesai. Perhitungan kadar asam amino bebas (%) dengan menggunakan rumus : Kadar asam amino (%)= f) Analisis kadar asam lemak (AOAC 2005) Analisis kadar asam lemak dengan menggunakan metode kromatogafi gas. Kadar lemak sampel diperoleh dari metode Sokhlet untuk dilakukan analisis kadar asam lemak. Prosedur kadar asam lemak yaitu : Preparasi sampel (hidrolisis dan esterifikasi) : Kadar lemak sampel ditimbang sebanyak 20-30 mg dan dimasukkan ke dalam tabung bertutup teflon. Selanjutnya ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N- metanol dan dipanaskan dalam tangas air selama 20 menit, suhu 80 o C, selanjtnya diangkat dan dibiarkan hingga dingin. Sampel tersebut ditambahkan 2 ml bourtiflourid-metanol dan dipanaskan pada suhu 80 o C selama 20 menit dan didinginkan. Selanjutnya sampel tersebut ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dalam

58 1 ml heksan dan dihomogenkan. Lapisan heksan dipindahkan dengan pipet tetes ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,1 g Na 2 SO 4 anhidrat dan didiamkan selama 15 menit. Fase cair dipisahkan dengan cara dipipet lapisan tersebut sebanyak 2-5 µl dan selanjutnya diinjeksi ke dalam alat kromatografi gas. Analisis komponen asam lemak, sebagai Fatty acid Metil Ester (FAME) : Sampel larutan diinjeksi sebagai FAME masing masing sebanyak 1 µl secara terpisah, sehingga diperoleh 2 kromatogram dari sampel dan standar. Selanjutnya dibandingkan waktu retensi standar dan sampel untuk mendapatkan jenis asam lemak. Kadar asam lemak tertentu dihitung menggunakan rumus 1: Asam lemak (%) = x % Kadar asam lemak tertentu dihitung menggunakan rumus 2: Asam lemak (%) = konsentrasi pelarut standar asam lemak Asam lemak (% = x % 3.5 Rancangan dan Analisis Data Percobaan satu faktor adalah percobaan yang dirancang dengan hanya melibatkan satu faktor dengan beberapa taraf sebagai perlakuan. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktor tunggal atau satu faktor dengan asumsi kondisi unit percobaan relatif homogen. Faktor tunggal adalah perlakuan waktu hari penyimpanan. Variabel yang diamati adalah waktu penyimpanan hari ke-0, ke-4, ke-8, ke-12 dan hari ke-16, yang disimpan pada suhu ruang dan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Model rancangan tersebut adalah : Y ij = µ + τ i + ε ij atau Y ij = µ i + ε Dimana : i = 1,2,,t dan j = 1,2,,r Y ij = Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = Rataan umum τ i = Pengaruh perlakuan ke-i µ i - µ ε = Pengaruh perlakuan ke-i ij ij

59 Hasil uji dilakukan dengan analisis ragam (ANOVA). Apabila hasil uji yang dilakukan berbeda nyata dimana jika F hitung > F tabel pada taraf nyataα 0,05 maka dilakukan uji lanjutan yaitu uji Duncan (Matjik & Sumertajaya 2006). Bentuk persamaannya adalah : R p = r αp;dbg atau 1/r h = Dimana r αp ; dbg adalah nilai tabel Duncan pada taraf nyata α, jarak peringkat dua perlakuan p dan derajat bebas galat sebesar db g. Uji sensori rating intensitas menggunakan Rancangan Blok Acak Lengkap (Randomized Complete Block Design) dan analisis data menggunakan analisis ragam (ANOVA). Apabila data signifikan (berbeda nyata) dari hasil analisis ragam, dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Test yang dapat menyatakan perbedaan diantara masing masing perlakuan (Meilgaard (1999). Semua data sensori rating intensitas menggunakan progam SPSS 16,0. Uji sensori hedonik secara keseluruhan (tekstur, warna, aroma dan rasa) pada penelitian ini menggunakan statistik non parametrik metode Kruskal Wallis (SNI 01-2346-2006). Statistik non parametrik metode Kruskal Wallis merupakan alternatif bagi uji F untuk pengujian kesamaan beberapa nilai tengah dalam analisis ragam untuk menghindar dari asumsi bahwa contoh diambil dari populasi normal (Walpole 1995). Hasil data dilanjutkan dengan menggunakan Multiple Comparison untuk data analisis ragam (ANOVA). Jika hasil data diperoleh signifikan (berbeda nyata), maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan Multiple Test. Semua data sensori hedonik diolah secara statistik menggunakan program SPSS 16.0.