BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Tinjauan Darah 1. Darah Sebagian besar tubuh manusia adalah berupa cairan yang sangat penting dalam proses sistem metabolisme tubuh, cairan tersebut adalah darah. Darah berbeda dengan organ lain karena berbentuk cairan. Darah merupakan suspensi dari partikel dalam larutan koloid cair yang mengandung elektrolit. (Muttaqin Arif, 2009) Volume darah manusia sekitar 8% dari berat badan normal dan berjumlah sekitar 5 liter. Empat puluh lima sampai 60% darah mengandung sel darah merah terutama ertitrosit, sisanya terdapat leukosit, trombosit, dan komponen lainnya. (A.V. Hoffbrand dan J.F. Pettit. 1992) Bagian darah yaitu sel-sel darah dan plasma darah. Sel-sel darah merupakan bagian padat, yang terdiri dari eritrosit (sel darah merah), leukosi (sel darah putih), dan trombosit (keping darah). Plasma darah bagian cair dari darah, yang terdiri dari serum dan fibrinogen. (Mehta, Atul dan Victor Hoffbrand, 2005) Darah mempunyai fungsi yang sangat penting, diantaranya : mengedarkan sari makanan ke seluruh tubuh yang dilakukan oleh plasma darah, mengangkut sisa oksidasi dari sel tubuh untuk dikeluarkan dari tubuh yang dilakukan oleh plasma darah, mengangkut oksigen ke seluruh yang dilakukan oleh sel-sel darah merah, membunuh kuman yang masuk 5
6 ke dalam tubuh yang dilakukan oleh sel darah putih, menutup luka yang dilakukan oleh keping-keping darah, menjaga kestabilan suhu tubuh. (A.V. Hoffbrand, dkk. 2005) 2. Morfologi Sel Eritrosit Morfologi sel terdiri dari bentuk, warna, ukuran dapat diamati pada sediaan apus dengan pewarnaan Giemsa/Wright/lainnya. Bentuk normal bikonkav dengan diameter 6 8µm warna kemerah-merahan. Eritrosit normal berukuran sama dengan inti limfosit kecil pada sediaan apus.( A.V. Hoffbrand dan J.F. Pettit. 1992) 3. Kelainan Morfologi Eritrosit Kelainan morfologi eritrosit berupa kelainan ukuran (size), kelainan bentuk (shape), kelainan warna (staining characteristics), dan benda-benda inklusi. Berikut macam-macam kelainannya : Kelainan ukuran : 1. Mikrosit : eritrosit lebih kecil daripada eritrosit normal, dengan ukuran < 6µm. Gambar 1.1 mikrosit
7 2. Makrosit : eritrosit lebih besar daripada eritrosit normal, dengan ukuran > 8µm. Ganbar 1.2 Makrosit 3. Sferosit : eritrosit lebih kecil, lebih bulat, dan lebih padat warnanya daripada eritrosit normal. Tidak didapat bagian yang pucat ditengah sel. Gambar 1.3 Sferosit 4. Anisositosis : banyak diantara sel eritrosit lebih banyak bervariasi dalam ukurannya daripada keadaan normal. Sering didapat pada anemia berat. Kelainan bentuk : 1. Acanthosytes : ditandai dengan adanya proyeksi halus dipermukaan erotrosit, menyerupai duri (kata Yunani : acantha : duri). Kelainan
8 bawaan yang jarang : acanthtocytosis, bisa mencapai lebih dari 50 %. Ada hubungan dengan metabolisme fosfolipid. Gambar 2.1 Achantosite 2. Burr cell : menunjukkan proyeksi-proyeksi atau tonjolan-tonjolan pendek misalnya pada uremia dan carsinomatosis. Bedakan dengan acanthosit dan sel crenated (artefak). Gambar 2.2 Burr Cell 3. Crenated : merupakan kelainan bentuk dari eritrosit (poikilositosis) yang berbentuk seperti artefak. Krenasi berawal dari sel eritrosit yang mengalami pengerutan akibat cairan yang berada di dalam sel keluar melalui membran. (Mehta, Atul dan Victor Hoffb rand. 2005). Morfologi krenasi dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, misalnya terjadinya kesalahan pada prosedur pemeriksaan pra-analitik (penambahan antikoagulan, jenis antikoagulan).
9 Gambar 2.3 Crenated 4. Eliptosit : bentuk seperti elip atau oval. Juga disebut ovalosit. Bila ada dalam jumlah yang besar mungkin disebabkan karena anomali bawaan, ovalositosis. Gambar 2.4 Eliptosit 5. Stomatosit : bentuk seperti topi Meksiko. Pusatnya tidak hipokrom tetapi berwarna merah. Gambar 2.5 Stomatosit
10 6. Leptosit : disebut juga sel target karena dibagian tengah eritrosit yang pucat terdapat lingkaran berwarna merah dipusat eritrosit. Gambar 2.6 Leptosit 7. Poikilositosis : bentuk tidak rata. Tergolong disini : sel burr, sel buah jambu, dan sebagainya. 8. Sabit / sickle : bentuk sabit. Berwarna lebih padat daripada eritrosit biasa. Didapat pada anemia hemolitik sel sabit. Gambar 2.7 Sickle 9. Schistosit : hasil fragmentasi eritrosit, bisa berbentuk segitiga, elips dengan indentasi atau sebagai sel dengan permukaan tidak rata. Biasanya didapat pada anemia hemolitik. Kelainan warna : 1. Hipokrom : warna pucat pada bagian tengah, erotrosit lebih besar dari biasanya.
11 Gambar 3.1 Hipokrom 2. Polikromasia : mengikat zat warna asam sehingga disamping warna merah ada kebiru-biruan. Pematangan sitoplasma lebih lambat dibandingkan pematangan inti. 3. Anulosit : diameter cekungan ditengah eritrosit yang berwarna lebih pucat dari darah tepi, berukuran besar (sel hipokrom ekstrem). Gambar 3.2 Anulosit 4. Benda Heinz : berasal dari polimerisasi dan presipitasi molekul (banyak) hemoglobin yang telah mengalami denaturasi. Benda Heinz bisa multiple dan biasanya terletak ditepi. Benda-benda inklusi : 1. Benda Howell-Jolly : inklusi berwarna biru, tunggal atau berganda, biasanya berada ditepi sel dan dapat berukuran sampai 1µm diameter. Berasal dari sisa ini (lihat cincin Cabot).
12 Gambar 4.1 Howell-Jolly 2. Cincin Cabot : cincin lembayung pada pusat eritrosit atau ditepi. Berasal dari sisa inti seperti halnya dengan Howell-Jolly. Gambar 4.2 Cincin cabot 3. Siderosit : ada granula besi yang tersebar tak merata. Memberikan reaksi positif dengan pewarnaan Prussian Blue (biru kehijauan). 4. Titik Basofil : eritrosit berisi granula biru kecil. Granula bisa bersifat kasar. Sel itu sebenarnya retikulosit, didapat pada anemia berat. Gambar 1.5 Titik Basofil 5. Eriteosit berinti : eritrosit yang mengalami maturasi normal.
13 B. Antikoagulan 1. Definisi Antikoagulan Antikoagulan merupakan zat yang digunakan untuk mencegah terjadinya pembekuan pada darah dengan cara mengikat kalsium atau menghambat pembentukan trombin yang diperlukan untuk mengkonversi fibrinogen menjadi fibrin dalam proses pembentukan darah. (E.N. Kosasih, 1984) Darah membeku bila berada di luar tubuh, apabila didiamkan bekuan akan mengkerut dan serum terperas keluar, sehingga antikoagulan digunakan untuk menghindarkan terjadinya pembekuan darah. Antikoagulan sering digunakan untuk pemeriksaan darah lengkap. ( E.N. Kosasih, 1984) 2. Jenis Antikoagulan Ada bermacam-macam jenis antikoagulan, namun tidak semua macam antikoagulan dapat dipakai karena ada antikoagulan yang dapat mempengaruhi morfologi dari sel-sel darah yang akan diperiksa. Berikut jenis antikoagulan beserta penjelasannya : a. EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate) Darah EDTA dalam bentuk garam natrium, kalium atau lithium, dapat dipakai untuk beberapa macam pemeriksaan hematologi, seperti penetapan kadar hemoglobin, hitung jumlah leukosit, eritrosit, trombosit, retikulosit, hematokrit, penetapan laju endap darah menurut
14 Westergren dan Wintrobe, tetapi tidak dapat dipakai untuk percobaan hemoragik dan pemeriksaan faal trombosit. (R.Gandasoebrata, 2007) Pemeriksaan dengan memakai darah EDTA sebaiknya dilakukan segera, hanya kalau perlu boleh disimpan dalam lemari es dengan suhu 4 0 C. Darah EDTA yang disimpan pada suhu 4 0 C selama 24 jam memberikan nilai hematokrit yang lebih tinggi. Pembuatan sediaan apus darah tepi dapat dipakai darah EDTA yang disimpan dengan waktu paling lama 2 jam. Darah EDTA dapat disimpan paling lama 24 jam di dalam lemari es tanpa mendatangkan penyimpanan yang bermakna, kecuali untuk jumlah trombosit dan nilai hematokrit. (R.Gandasoebrata, 2007) b. Heparin Heparin adalah antikoagulan dalam bentuk cairan, dapat mengakibatkan leukosit bergumpal-gumpal (R.Gandasoebrata, 2007) Tiap 1 mg heparin menjaga membekunya 10 ml darah. Kelemahan dari heparin yaitu tidak digunakan untuk membuat sediaan darah apus, karena dapat memberikan latar belakang biru pada sediaan apus setelah diwarnakan. (E.N. Kosasih, 1984) c. Natriumsitrat dalam larutan 3,8% Natriumsitrat untuk pemeriksaan laju endap darah cara Westergren dengan perbandingan 1 volume antikoagulan denagn 4 volume darah, misalnya 0,4 ml citrat dan 1,6 ml darah. Natriumsitrat 3,8% tidak dapat
15 digunakan untuk menghitung leukosit, eritrosit dan trombosit. (R.Gandasoebrata, 2007) d. Natrium Fluoride ( NaF ) Digunakan dalam bentuk bubuk. Dengan perbandingan 10 mg untuk 1 ml darah. (E.N. Kosasih, 1984) 3. Darah EDTA 10% EDTA yang sering dipakai dalam pemeriksaan hematologi adalah larutan dengan kadar EDTA 10% yang artinya 10g EDTA serbuk dilarutkan dalam 100ml aquades. Tiap 1 mg EDTA menghindarkan membekunya 1 ml darah. Pemakai EDTA dalam jumlah yang berlebihan perlu dihindari, bila dipakai EDTA lebih dari 2 mg per ml maka nilai hematokrit menjadi lebih rendah dari yang sebenarnya. Zat kering boleh dipakai untuk menghindarkan terjadi pengenceran darah, akan tetapi dalam hal terakhir ini perlu sekali menggoncanggoncangkan atau menghomogenkan wadah yang berisi darah dan EDTA selama 1-2 menit karena zat EDTA yang kering agak sukar larut atau lambat melarut. (R.Gandasoebrata, 2007) Berikut perhitungan perbandingan darah dan antikoagulan : 10 g EDTA serbuk dalam 100 ml aquades adalah EDTA 10% 1 ml EDTA cair = 0,1 g EDTA serbuk 1 ml = 100 mg 0,01 µl EDTA cair = 1 mg EDTA serbuk untuk 1 ml darah.
16 C. Volume EDTA terhadap Krenasi Aturan penambahan antikoagulan EDTA adalah 10µl untuk 1ml darah. Perbandingan volume darah dengan antikoagulan tidak sesuai dapat menyebabkan kesalahan pada hasil : jika volume terlalu sedikit ( EDTA terlalu berlebihan), sel-sel eritrosit mengalami krenasi, sedangkan trombosit membesar dan mengalami disintegrasi. Volume terlalu banyak (EDTA terlalu sedikit) dapat menyebabkan terbentuknya jendalan yang berakibat menurunnya jumlah trombosit. (Oesman, Farida & R. Setiabudy, 1992) D. Sediaan Apus Darah Tepi Sediaan apus darah merupakan salah satu cara pemeriksaan hematologi yang bertujuan untuk mengamati dan menilai berbagai unsur sel darah pada manusia seperti sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping-keping darah (trombosit). Sedi aan apus juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi parasit misalnya malaria dan mikrofilaria yang lain. Prinsip pemeriksaan sediaan apus darah yaitu dengan meneteskan darah lalu dipaparkan diatas objek glass, kemudian dilakukan pengecatan lalu diperiksa dibawah mikroskop. Objekglass harus kering, bersih dan bebas dari lemak sebelum darah di teteskan di objekglass. Persebaran sel tidak rata jika objekglass masih ada lemak atau tidak bersih. Ciri sediaan apus yang baik : 1. Sediaan tidak melebar sampai tepi kaca objek, panjangnya ½ sampai 2/3 panjang kaca.
17 2. Mempunyai bagian yang cukup tipis untuk diperiksa, pada bagian itu eritrosit tersebar rata berdekatan dan tidak saling bertumpukan. 3. Pinggir sediaan rata, tidak berlubang-lubang atau bergaris-garis. 4. Penyebaran leukosit yang baik tidak berkumpul pada pinggir atau ujung sedimen. 5. Bentuk seperti peluru. 6. Terdapat zona I VI Teknik pemeriksaan apus darah tepi : Sediaan apus darah terdiri atas bagian kepala dan bagian ekor. Bagian kepala sediaan apus, sel bertumpuk-tumpuk terutama eritrosit sehingga bagian ini tidak dapat untuk pemeriksaan morfologi sel. Pemeriksaan eritrosit sebaiknya dibagian belakang ekor, karena disini eritrosit terpisah satu sama lain. (Pendidikan Ahli Madya Analis Kesehatan, 1996). E. Sumber Kesalahan Pemeriksaan Laboratorium Hasil pemeriksaan laboratorium tidak semuanya menunjukkan ketepatan dan kebenaran, banyak faktor yang bisa mempengaruhi hasil pemeriksaan tersebut. Perbedaan tersebut bisa disebabkan karena kesalahan pada alat, human error ataupun yang lainnya. Berikut faktor penyebab variasi hasil pemeriksaan laboratorium : 1. Pengambilan spesimen : cara pengambilan, penambahan antikoagulan, tekanan osmosis dan konsentrasi larutan. 2. Perubahan spesimen : suhu, bekuan darah lama tidak dipisahkan dari serum, didalam laboratorium atau selama transpor ke laboratorium.
18 3. Personel : pelabelan pasien, kesalahan pembacaan atau perhitungan, kesalahan langkah dalam prosedur pemeriksaan. 4. Prasarana dan sarana laboratorium : suhu tidak sesuai dengan suhu yang ditentukan, reagensia tidak baik, dan tidak murni, rusak atau kadaluarsa, instrumentasi (seperti spektrofotometri,pipet, dll) tidak akurat. 5. Kesalahan sistemik : berkaitan dengan metode pemeriksaan (seperti alat, reagensia, dll) 6. Kesalahan ada rendum : variasi hasil yang tidak dapat dihindarkan bila dilakukan penentuan berturut-turut pada sampel yang sama walaupun prosedur pemeriksaan dilakukan dengan cermat. Random error mengikuti hukum statistik. (E.N.Kosasih dan A.S.Kosasih, 2006) F. Faktor Penyebab Krenasi 1. Lama Penyimpanan Sampel Pemeriksaan dengan menggunakan darah EDTA sebaiknya dilakukan dengan segera, bila terpaksa ditunda sebaiknya harus diperhatikan batas waktu penyimpanan untuk masing-masing pemeriksaan. (R.Ganda Soebrata, 1968) Penelitian tentang pemeriksaan hematologi sering dilakukan di lapangan, sehingga ada kecenderungan untuk melakukan penundaan pemeriksaan hematologi yang dibutuhkan. Penundaan waktu pemeriksaan sampel darah dengan antikoagulan EDTA maksimal adalah 2 jam, apabila waktu penundaan lebih dari 2 jam akan menyebabkan kelainan morfologi pada sel, misalnya krenasi.
19 2. Konsentrasi larutan Konsentrasi larutan sangat berpengaruh dalam melakukan pemeriksaan hematologi karena dapat mempengaruhi diagnosis dari hasil pemeriksaan laboratorium. Membran eritrosit bersifat semipermeabel yang berarti dapat ditembus oleh zat air dan zat-zat tertentu yang lain. Sel-sel darah akan membengkak dan pecah bila dimasukkan ke dalam larutan hipotonis karena membran plasma tidak kuat lagi menahan tekanan yang ada di dalam sel eritrosit itu sendiri. Sebaliknya, bila eritrosit berada pada larutan yang hipertonis, maka cairan eritrosit akan keluar menuju ke medium luar eritrosit, akibatnya eritrosit mengkerut. Sel-sel darah merah tidak akan mengalami perubahan dalam larutan isotonis. (Ratnaningsih, T. dan Usi Sukorini, 2005) 3. Jenis Antikoagulan Antikoagulan merupakan zat yang digunakan untuk mencegah terjadinya pembekuan darah pada pemeriksaan hematologi. Beberapa macam antikoagulan digunakan berdasarkan jenis pemeriksaannya. (R.Ganda Subrata, 1968). Tidak semua macam antikoagulan dapat dipakai untuk satu pemeriksaan, karena ada pemeriksaan yang tidak menggunakan antikoagulan dan ada jenis antikoagulan yang dapat mempengaruhi morfologi dari sel-sel darah yang akan diperiksa.
20 4. Volume Antikoagulan Antikoagulan yang sering digunakan dalam pemeriksaan hematologi adalah EDTA dalam bentu larutan. Perbandingan antikoagulan EDTA 10% dan darah adalah 10µl untuk 1ml darah. (R.Ganda Subrata, 1968) Penggunaan EDTA yang kurang dari ketentuan dapat menyebabkan darah membeku, sedangkan penggunaan lebih dari ketentuan dapat menyebabkan eritrosit mengkerut. G. Kerangka Teori Lama penyimpanan sampel Volume antikoagulan Krenasi Jenis antikoagulan Konsentrasi larutan H. Kerangka Konsep Variasi volume EDTA 10% krenasi Variabel Bebas : variasi volume EDTA 10% Variabel terikat : morfologi krenasi
21 I. Hipotesis H0 : Tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara pengaruh variasi volume antikoagulan terhadap morfologi krenasi pada eritrosit. H1 : Terdapat perbedaan yang signifikan antara pengaruh variasi volume antikoagulan terhadap morfologi krenasi pada eritrosit.