BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian. Penelitian dilaksanakan dari bulan Desember 2008 sampai dengan Mei 2009. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, dan Kandang Hewan Coba FKH IPB. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur Sprague-Dawley dewasa sebanyak 48 ekor dengan berat badan tikus berkisar antara 150 200 gram yang diperoleh dari Animal Facility, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan lain yang diperlukan adalah larutan borax, ekstrak rumput kebar, NaCl fisiologis, larutan giemsa, dan larutan eosin. Alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah perangkat kandang tikus, counter (alat hitung), kamera digital, erlenmeyer, seperangkat alat bedah, mikroskop, haemocytometer, kaca preparat dan gelas objek. Metode Penelitian Pembuatan Larutan Ekstrak Rumput Kebar Semua bagian rumput kebar yang digunakan (akar, batang dan daun) dikeringkan dengan penjemuran panas matahari. Selanjutnya rumput kebar yang telah kering tersebut direbus dengan aquabides (dengan perbandingan 600 g rumput kebar dalam 6 lt aquabides) sambil diaduk pada suhu 60 0 C. Perebusan dilakukan selama 6 jam. Hasil rebusan disaring dan ampas direbus kembali dengan proses yang sama sebanyak 3 kali perebusan. Larutan hasil rebusan disaring dan dibiarkan dingin, selanjutnya dilakukan evaporasi dengan mengunakan rotari evaporator (EYELA Rotary Evaporator N-1000) pada suhu 60 0 C sampai volume menjadi 3 liter, untuk selanjutnya dijadikan bubuk dengan metode pengering bekuan (freeze drying) (Flexi-Dry TM MP U.S. Pat #4,823,478). Bubuk yang terbentuk disimpan dalam botol kaca steril. Ekstrak
rumput kebar yang digunakan dalam penelitian dilarutkan kembali dengan menggunakan aquades sesuai dosis. Penentuan Dosis Ekstrak Rumput Kebar Penentuan dosis eksrak rumput kebar pada tikus didasarkan pada dosis standar yang diberikan untuk manusia. Dosis rumput kebar yang diberikan pada manusia dengan berat badan antara 50-70 kg adalah sebanyak 30 g rumput kebar kering atau sekitar 0.95 g bahan yang terlarut dalam 200 ml larutan ekstrak rumput kebar (Nilai konversi hasil pengering bekuan di Laboratorium Teknologi Pangan dan Gizi FATETA-IPB). Pemberian ekstrak rumput kebar pada mencit didapatkan dosis 0.135 mg/gram bobot badan/hari (Sadsoestoeboen 2005). Selanjutnya dalam penelitian ini digunakan tabel konversi dosis Laurence dan Bacharach (1986) (Lampiran 2). Dari hasil perhitungan didapatkan dosis untuk tikus adalah 0.0945 mg/gram bobot badan/hari. Persiapan Hewan Model Tikus ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat ram dan dialas sekam (Gambar 8). Pakan berupa pellet dan air minum diberikan secara ad libitum. Lingkungan kandang dibuat agar tidak lembab, ventilasi yang cukup serta penyinaran yang cukup dimana lamanya terang 14 jam dan lamanya gelap 10 jam. Masing-masing tikus ditempatkan dalam kandang per kelompok perlakuan. Hewan percobaan terlebih dahulu dipelihara selama satu minggu ditempat tersebut sebelum diperlakukan. Hal ini bertujuan untuk penyesuaian dengan lingkungan. Pembuatan hewan model infertil Dalam rangka menganalisa suatu zat yang diduga dapat meningkatkan fertilitas jantan diperlukan suatu hewan model dengan kondisi fertilitas yang rendah. Untuk mengatasi hal tersebut diatas, perlu dilakukan penelitian pendahuluan untuk mendapatkan hewan coba tersebut.
A. Kandang Plastik B. Kandang kelompok perlakuan Gambar 8 Tempat hewan peliharaan Gambar 9 Pemberian borax dengan cara mencekok Penelitian dilaksanakan dengan menggunakan larutan borax. Tikus normal sebanyak 15 ekor diberi larutan borax dengan cara mencekok (Gambar 9) selama 30 hari berturut-turut, dengan dosis 600 mg/kg berat badan dalam 1 ml CMC 1% (Kaspul 2004). Setelah pemberian borax dihentikan, sebanyak 15 ekor tikus dikorbankan untuk dianalisa konsentrasi spermatozoanya sesuai dengan waktu yang telah ditetapkan (Gambar 10). Pemberian borax 600 ml/kg bb/hari selama 30 hari Hari 0 30/HO H3 H6 H9 H16 H23 H30 Analisa konsentrasi spermatozoa Gambar 10 Protokol pembuatan hewan model infertil Hasil penelitian pendahuluan menunjukkan bahwa jumlah spermatozoa tikus mengalami penurunan setelah diberi perlakuan borax selama 30 hari (Gambar 11).
Jumlah Spermatozoa/mm 3 suspensi 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 H3 H6 H9 H16 H23 H30 Normal Perlakuan Gambar 11 Rataan jumlah spermatozoa tikus setelah 30 hari perlakuan borax Jumlah spermatozoa tikus yang diberi borax bersifat tidak permanen. Hal ini terlihat dari rataan jumlah spermatozoa tikus yang dapat kembali ke jumlah normal. Jumlah spermatozoa normal rata-rata sebesar 10830/mm 3 suspensi. Pada hari ke-3 setelah pemberhentian pemberian borax jumlah spermatozoa menurun sebanyak 62,49% dibanding yang normal. Peningkatan jumlah spermatozoa mulai terjadi pada hari ke-23 menjadi 62,04% bila dibandingkan dengan jumlah spermatozoa tikus normal. Peningkatan mulai mendekati normal pada hari ke-28 yaitu menjadi 83,37%. Dari hasil penelitian pendahuluan ini dapat disimpulkan bahwa untuk membuat hewan model tikus infertil perlu dilakukan pencekokan dengan larutan borax dosis 600 ml/kg bb/hari selama 30 hari berturut-turut. Pengamatan harus dilakukan sebelum tikus menjadi normal kembali yaitu sebelum 28 hari akhir pemberian borax. Selanjutnya ditetapkan lamanya perlakuan, yaitu 7 hari, 14 hari, 21 hari dan 28 hari. Perlakuan Sebanyak 48 ekor dibagi kedalam dua kelompok perlakuan yaitu kelompok tikus infertil dan kelompok tikus normal. Masing-masing kelompok dibagi lagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok kontrol dan kelompok pemberian ekstrak rumput kebar, dengan dosis 0,0945 mg/gram bobot badan/hari. Setelah tikus mendapat perlakuan rumput kebar sesuai kelompoknya, dilakukan
pemeriksaan mikroskopis terhadap parameter reproduksi meliputi bobot testis, konsentrasi spermatozoa (jumlah), persentase viabilitas spermatozoa serta morfologi spermatozoa. Adapun diagram penelitian tersaji pada gambar 12. Tikus Jantan n=48 Tikus infertil (Pemberian borax) n=24 Tikus normal (Tanpa pemberian borax) n=24 Tanpa pemberian rumput kebar n=12 Pemberian rumput kebar n=12 Tanpa pemberian rumput kebar n=12 Pemberian rumput kebar n=12 7 h 14 h 21h 28 h n=3 n=3 n=3 n=3 7 h 14 h 21h 28 h n=3 n=3 n=3 n=3 7 h 14 h 21h 28 h n=3 n=3 n=3 n=3 7 h 14 h 21h 28 h n=3 n=3 n=3 n=3 Paramerer yang diukur : Bobot badan. bobot testis, konsentrasi spermatozoa, morfologi spermatozoa dan viabilitas spermatozoa Gambar 12 Protokol perlakuan dan parameter yang diuji. Pengamatan parameter uji 1. Bobot Badan Pengukuran bobot badan dilakukan dengan cara menimbang tikus. Penimbangan dilakukan tiap ekor perkelompok perlakuan setiap minggu. 2. Kinerja Reproduksi Hewan Jantan a. Bobot Testis Tikus-tikus jantan dimatikan secara pembiusan dengan mengunakan eter. Pengukuran berat testis relatif dilakukan dengan cara menimbang kedua testis
yang terlebih dahulu dibersihkan dari caput dan cauda epididymis dimana hasilnya dihitung sebagai berikut: berat testis(g) Berat testis relatif = ------------------- X 100%. berat badan(g) b. Kualitas Spermatozoa Spermatozoa diperoleh dari cauda epididymis kanan yang diambil dari hewan yang telah dimatikan. Cauda epididymis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml garam fisiologis hangat (37 C), kemudian dipotong potong dengan gunting kecil hingga halus dan diaduk dengan gelas pengaduk. Larutan ini disebut suspensi spermatozoa (Modifikasi dari First 1991). Suspensi spermatozoa ini digunakan untuk pengamatan kualitas spermatozoa Pengamatan kualitas spermatozoa dilakukan menurut Soehadi dan Arsyat (1983). Adapun kualitas spermatozoa yang dianalisa adalah konsentrasi spermatozoa, morfologi spermatozoa dan viabilitas spermatozoa. b. 1. Konsentrasi Spermatozoa Suspensi spermatozoa dihisap dengan pipet leukosit sampai tanda 1,0. Pipet yang telah berisi suspensi spermatozoa kemudian diencerkan dengan larutan garam fisiologis sampai tanda 11. Kemudian pipet dikocok rata. Sebelum menghitung spermatozoa, terlebih dahulu beberapa tetes campuran spermatozoa dibuang agar yang terhitung nanti adalah bagian yang benar benar mengandung spermatozoa homogen. Campuran spermatozoa dimasukkan ke dalam kotak kotak kamar hitung Neubauer, jumlah spermatozoa pada 5 x 16 kotak (Gambar 13) dihitung di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 kali. Hasil perhitungan merupakan jumlah spermatozoa dalam mm 3 suspensi.
Sel yang Dihitung 3 Kotak hitung Sel Tidak Dihitung Gambar 13 Kamar hitung Neubauer b.2. Morfologi Spermatozoa Pengamatan morfologi, dilakukan dengan cara mengambil satu tetes suspensi sperma, kemudian dibuat sediaan hapus, fiksasi dengan methanol selama 15 menit dan diwarnai dengan giemsa 10% selama 30 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir setelah itu dikeringkan. Setelah kering preparat diamati dibawah mikroskop perbesaran 400 kali. Diamati sebanyak 200 spermatozoa. Pemeriksaan morfologi menentukan apakah sperma tersebut mengalami kelainan bentuk baik abnormalitas primer maupun sekunder. Abnormalitas primer terdiri atas macrocephalic, microcephalic, kepala ganda atau ekor ganda, serta bentuk kepala yang tidak normal. Abnormalias sekunder terdiri atas bentuk kepala pecah, ekor putus (pada bagian leher atau tengah-tengah), ekor melipat, terpilin atau tertekuk. Hasil pengamatan spermatozoa yang abnormal dinyatakan dalam persen (%). b.3. Viabilitas Spermatozoa Viabilitas spermatozoa diperiksa dengan cara pewarnaan supravital, dengan eosin v 0,5% (serbuk jingga). Pada gelas objek, satu tetes suspensi sperma ditambah satu tetes eosin, kemudian dibuat sediaan hapus. Pengamatan sediaan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali dan dihitung dengan mengunakan counter. Penghitungan dilakukan pada 200 spermatozoa,
spermatozoa hidup tidak berwarna, sedang spermatozoa yang mati berwarna merah. Hasilnya dinyatakan dalam persen (%) hidup. Rancangan Percobaan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat kelompok perlakuan yaitu 7, 14, 21 dan 28 hari dengan tiga kali ulangan. Penelitian dibagi kedalam dua tahap penelitian : Tahap I : untuk mengetahui kinerja ekstrak rumput kebar terhadap hewan yang diturunkan kinerja reproduksinya dengan menggunakan borax. Tikus-tikus yang telah dewasa kelamin (umur 10 minggu), dikelompokan menjadi dua kelompok sebagai berikut: 1. Kelompok kontrol = kelompok tikus yang diinduksi borax selama 30 hari dan dilanjutkan dengan pemberian plasebo selama selama 7, 14, 21 dan 28 hari. 2. Kelompok perlakuan = kelompok tikus yang diinduksi borax selama 30 hari dan dilanjutkan dengan pemberian rumput kebar selama 7, 14, 21 dan 28 hari. Tahap II: untuk mengetahui kinerja ekstrak rumput kebar terhadap hewan normal. Tikus-tikus yang telah dewasa kelamin, dikelompokan menjadi dua kelompok sebagai berikut: 1. Kelompok kontrol = kelompok tikus normal yang diberi plasebo selama 7, 14, 21 dan 28 hari. 2. Kelompok perlakuan = kelompok tikus yang diberi rumput kebar dosis 0.0945 mg/gram bobot badan selama 7, 14, 21 dan 28 hari. Analisis Data Analisa data menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) selang kepercayaan 95% (α = 0.05) dengan menggunakan program SPSS (Mattjik dan Sumertajaya 2006).