BAB 3 PERCOBAAN 3.1 Bahan Propolis Gold (Science&Nature ), minyak lavender (diperoleh dari PT. Martina Berto), aquadest, Crillet 4 (Trimax), Crill 4 (diperoleh dari PT. Pusaka Tradisi Ibu), setostearil alkohol, propilen glikol, tokoferol asetat, metil paraben, propil paraben, sudan merah, tryptone soya agar (TSA), tryptone soya broth (TSB), NaCl 0,9%, dan etanol. 3.2 Alat Mikroskop, kaca objek, timbangan elektronik, Ultra Turrax T 25 (Janke & Kunkel IKA Labortechnic), viskosimeter Brookfield tipe DV-I digital, ph meter Beckman, sentrifuga Hettich EBA 8S, Illuminated chamber (Hotpack model 317322), oven (WTB Binder, 40 C), lemari pendingin (4 C), inkubator, otoklaf, dan peralatan gelas di laboratorium. 3.3 Mikroorganisme Uji Propionibacterium acnes (koleksi Laboratorium Mikrobiologi FKUI Jakarta) 3.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Propolis dan Minyak Lavender Masing-masing pengujian aktivitas antibakteri propolis dan minyak lavender dilakukan dengan menggunakan metode difusi agar terhadap Propionibacterium acnes. 3.4.1 Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121EC selama 15 menit untuk mensterilisasi media, tabung reaksi, cakram, larutan NaCl 0,9% dan peralatan gelas lainnya. 3.4.2 Pembuatan Media Padat Media padat dibuat dengan cara melarutkan TSA dalam aquadest dan dipanaskan hingga larutan menjadi bening. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol media, mulut botol disumbat dengan kapas berlemak lalu ditutup dengan aluminium foil dan diikat dengan 15
16 benang kasur untuk disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121EC selama 15 menit. Agar dituang ke dalam media pembiakan dan dibiarkan dingin serta memadat. 3.4.3 Pemeliharaan Mikroba Uji Koloni bakteri dipelihara pada media TSA (tryptone soya agar) dan diinkubasi pada suhu 37EC selama 24 jam kemudian disimpan pada suhu 2-5EC. 3.4.4 Pembuatan Kurva Tumbuh P. Acnes P. acnes diinokulasikan pada TSB dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 72 jam. Bakteri diambil dalam rentang 2-3jam untuk dibuat kurva tumbuhnya. Dibuat pengenceran bakteri kemudian bakteri hasil pengenceran dimasukkan ke dalam TSA dan diinkubasi pada suhu 37EC. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh dihitung dan dibuah kurva pertumbuhannya. 3.4.5 Pembuatan Suspensi Mikroba Inokulasi bakteri dibuat suspensi dalam TSB (tryptone soya broth) steril dan diinkubasi pada suhu 37EC selama 60 jam. Kemudian suspensi bakteri diencerkan dengan TSB steril sehingga kekeruhannya mencapai transmitan yang memberikan 1,8 x 10 7 cfu/ml dengan spektrofotometer spectronic 20 pada λ 580 nm. 3.4.6 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum Propolis dan Minyak Lavender Sebanyak 20 ml agar TSA steril dituang ke dalam cawan Petri steril, kemudian ke dalam cawan Petri dimasukkan 0,1 ml suspensi bakteri (1,8 x 10 7 cfu/ml). Cawan Petri digoyang perlahan-lahan agar suspensi bakteri tersebar merata dan didiamkan sampai memadat. Setelah agar memadat, dibuat 6 lubang reservoir pada agar tersebut dan masingmasing lubang kemudian diisi dengan 0,05 ml larutan propolis dengan konsentrasi 100; 50; 10; 5; 1; 0,1; 0,07; 0,05; 0,03; dan 0,01% v/v serta minyak lavender dengan konsentrasi 100, 50, 40, 30, 20, dan 10% v/v. Propolis diencerkan dengan propilen glikol sedangkan minyak lavender diencerkan dengan etanol. Cawan Petri dibiarkan satu jam pada temperatur ruangan kemudian diinkubasi secara anaerob fakultatif pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi, diameter hambat yang dihasilkan oleh setiap larutan uji diukur.
17 3.5 Formulasi Sediaan Krim Formulasi sediaan krim diawali dengan penentuan nilai required hydrophilic-lipochilic balance (RHLB) minyak zaitun, optimasi jumlah emulgator, jumlah zat pengental, dan formula untuk sediaan akhir. 3.5.1 Penentuan Nilai RHLB Sejumlah Crill 4 dan Crillet 4 ditimbang sesuai dengan nilai HLB yang ditentukan kemudian Crill 4 ditambahkan ke 20 g minyak zaitun, sedangkan sejumlah Crillet 4 ditambahkan ke 77 g aquadest. Kedua fasa dipanaskan di atas penangas air sampai temperatur 60-70ºC, kemudian dicampur dan dilakukan pengadukan dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Setelah itu pengadukan dihentikan dan dilakukan pengamatan kestabilan fisik formula selama satu minggu. Formula dibuat dengan nilai HLB 5,6,7,8, dan 9 kemudian dilanjutkan dengan rentang RHLB yang lebih sempit yaitu 5,5; 6; 6,5; 7; dan 7,5. 3.5.2 Optimasi Jumlah Emulgator Formulasi sediaan krim dibuat dengan menggunakan 30% b/b minyak zaitun, 5% b/b setostearil alkohol, 10% b/b propilen glikol dan kombinasi emulgator Crill 4 dan Crillet 4 dengan HLB 6,5 yang bervariasi yaitu 3, 5, dan 7%. Crill 4 dan setostearil alkohol ditambahkan ke dalam sejumlah minyak zaitun, sedangkan sejumlah Crillet 4 dan propilen glikol ditambahkan ke sisa fasa air. Kedua fasa dipanaskan di atas penangas air sampai temperatur 60-70ºC, kemudian dicampur dan dilakukan pengadukan dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit. Setelah itu pengadukan dihentikan dan dilakukan pengamatan kestabilan fisik formula. 3.5.3 Optimasi Jumlah Zat Pengental Formula dibuat dengan jumlah setostearil alkohol sebanyak 3, 4, dan 5% b/b. Prosedur dilakukan seperti prosedur pada optimasi jumlah emulgator dan viskositas tiap formula diukur dan dibandingkan. 3.5.4 Optimasi Formula untuk Sediaan Krim Pada tahap ini optimasi formula dilakukan dengan menggunakan minyak dan surfaktan dalam jumlah yang bervariasi, seperti tertera pada Tabel 3.1. Prosedur pembuatan krim
18 dilakukan seperti prosedur pada optimasi jumlah emulgator. Seluruh formula diamati kestabilan fisiknya dan dipilih dua formula untuk dibandingkan viskositas dan phnya. Tabel 3.1 Optimasi Formula untuk Sediaan Krim Bahan Minyak zaitun Setostearil alkohol Emulgator Propilen Glikol Aquadest (% b/b) Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 Formula 5 30 30 30 40 40 5 5 5 5 5 5 7 10 5 7 10 10 10 10 10 50 50 45 40 38 3.5.5 Pembuatan Krim Dari hasil optimasi yang dilakukan diperoleh formula akhir yang akan digunakan untuk selanjutnya yaitu formula 1. Sejumlah Crill 4, 5 g setostearil alkohol, dan 20 mg tokoferol ditambahkan ke 30 g minyak zaitun, sedangkan sejumlah Crillet 4 dan 10 g propilen glikol ditambahkan ke sisa fasa air. Kedua fasa dipanaskan di atas penangas air sampai temperatur 60-70ºC, kemudian kedua fasa dicampur dan dilakukan pengadukan dengan kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Sebanyak 180 mg metil paraben dan 20 mg propil paraben yang telah dilarutkan dalam 1 ml etanol dan sejumlah zat aktif ditambahkan ke dalam sediaan dan pengadukan dilanjutkan sampai 15 menit. Sediaan krim dibuat sebanyak tiga bets. Formula sediaan krim tertera pada tabel 3.2.
19 Tabel 3.2 Formula Krim Propolis dan Minyak Lavender Bahan Propolis Minyak lavender Minyak zaitun Setostearil alkohol Propilen glikol Emulgator Tokoferol asetat Metil paraben Propil paraben Alkohol Aquadest Formula Krim Propolis (A) (% b/b) 1,00-30,00 10,00 0,18 1,00 47,78 Formula Krim Minyak Lavender (% b/b) - 30,00 30,00 10,00 0,18 1,00 18,78 Keterangan: - : tidak ditambahkan ke dalam formula 3.6 Evaluasi Sediaan Evaluasi sediaan krim meliputi evaluasi organoleptik; viskositas; ph; homogenitas; dan uji stabilitas fisik menggunakan metode freeze-thaw, sentrifuga dan uji stabilitas dipercepat menggunakan illuminated chamber. 3.6.1 Pengamatan Organoleptik Pengamatan organoleptik meliputi bau, warna dan pertumbuhan jamur. 3.6.2 Uji Tipe krim Tipe krim dievaluasi dengan mengoleskan sediaan krim di atas kaca objek dan kemudian ditambah larutan sudan merah dan diamati di bawah mikroskop. Tipe emulsi merupakan minyak dalam air apabila fasa minyak dapat diwarnai oleh sudan merah. 3.6.3 Uji Kestabilan Fisik Untuk menguji kestabilan fisik krim digunakan metode sentrifugasi, metode freeze thaw, dan uji dipercepat.
20 a. Metode Sentrifugasi Sediaan krim sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga lalu disentrifuga dengan kecepatan 3750 rpm selama lima jam dengan interval waktu pengamatan setiap setengah jam. Diamati pemisahan fasa minyak dan fasa air yang terjadi setiap interval waktu pengamatan b. Metode Freeze Thaw Sediaan krim ditimbang sebanyak dua gram dan dimasukkan ke dalam vial. Tiap formula disiapkan masing-masing tujuh vial. Satu vial akan digunakan sebagai kontrol dan disimpan pada suhu 25EC sedangkan enam vial lainnya digunakan untuk siklus freeze thaw untuk disimpan di dalam suhu 4EC selama 48 jam kemudiaan dipindahkan ke suhu 40EC selama 48 jam. Ini merupakan satu siklus. Setelah itu dilanjutkan sampai siklus keenam. Setiap satu siklus selesai, dikeluarkan satu vial untuk tiap formula dan diamati perubahan diameter globul dan pemisahan fasa. c. Uji Dipercepat Sebanyak empat botol sediaan krim disimpan dalam Illuminated chamber pada suhu 40EC dan kelembaban 75%. Setiap satu minggu satu botol dikeluarkan dan diamati pemisahan fasa, viskositas, ph, dan perubahan diameter globul. 3.6.4 Uji Homogenitas Sediaan Sediaan dioleskan tipis-tipis pada permukaan kaca objek kemudian diamati homogenitas sediaan di bawah mikroskop. Untuk mendapatkan permukaan yang homogen dilakukan dengan menggeser sejumlah sediaan dari ujung satu sampai yang lainnya dengan menggunakan bantuan kaca objek yang lain. 3.6.5 Pengukuran ph Sediaan yang memiliki kestabilan fisik paling baik diukur ph nya dengan ph meter Beckman setiap minggu. 3.6.6 Uji Viskositas Pengukuran viskositas sediaan dilakukan dengan alat viskometer brookfield, menggunakan spindle 28 dan putaran 1 rpm setiap minggu selama sediaan disimpan pada temperatur ruangan.
21 3.7 Pengujian Aktivitas Antibakteri krim Propolis Sediaan krim propolis dan pembanding propolis baku 1% v/v diuji aktivitas antibakterinya terhadap bakteri Propioniobacterium acnes dengan metode difusi agar seperti pada penentuan nilai KHM.