23 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biologi Lingkungan Program Studi Pendidikan Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Penelitian dilakukan pada bulan Mei-Juni 2016. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah timbangan analitik, labu Erlenmeyer 100 ml, tabung reaksi, rak tabung, beaker glass, pipet ukur, spatula, gelas ukur, jarum ose, jarum inokulen, cawan petri, pembakar bunsen, batang pengaduk, batang Drugalsky, Laminar Air Flow (LAF), autoclave, pipet tetes, magnetic stirrer, mikroskop, gelas objek, gelas penutup, pipet kapiler, hot plate, filler pump, jangka sorong, incubator, label, kasa, kertas saring, kertas jerami, kompor listrik, tip, pinset, vortex, spidol, penggaris, sprayer, nampan plastik, tissue, kapas, korek api, kantong plastik 2 kg, wrapping, aluminium foil. 3.2.1 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah perkebunan tomat, aquades, alkohol, Medium Nutrient Agar (NA), Medium Nutrient Broth (NB), medium uji Tripe Sugar Iron Agar (TSIA), medium uji Protease Broth (MR-VP), medium uji Simmons s Citrate Agar, medium uji Urea 23
24 Broth, medium Motility Test Medium (SIM), insektisida Chlorpyrifos, fungisida Mancozeb, alkohol 70%, spirtus, reagen methyl red, reagen α-naphtol, kristal violet, kalium iodide, safranin, larutan kovac, reagen katalase (H2O2) 3%, reagen melachite green, enthelen, dan minyak imersi. 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian isolasi dan identifikasi bakteri dari tanah pertanian tomat adalah metode survey. Metode tersebut bertujuan untuk mengetahui adanya bakteri pada lahan pertanian tomat yang menggunakan insektisida Chlorpyrifos (Dursban 250EC) dan fungisida Mancozeb (Dithane M- 24) dengan cara sederhana, yaitu mengambil tanah pada lahan tanaman tomat sebanyak 5 titik secara acak. Isolasi sampel dan identifikasi dilakukan di laboratorium mikrobiologi dan biologi lingkungan. Data diperoleh dalam bentuk nama jenis isolat, tumbuh atau tidaknya isolat pada medium yang mengandung pestisida, dan zona bening yang terbentuk pada kultur. Selanjutnya data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan kuantitatif. 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pembuatan Medium 3.4.1.1 Medium Nutrien Agar (NA) Medium NA dibuat dengan cara menimbang 1,5 gram beef ekstrak, 2,5 gram pepton, 1 gram yeast ekstrak, dan 7,5 gram agar. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan panaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat serta memasukan 12 ml untuk medium NA
25 cawan. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 3.4.1.2 Medium Nutrien Broth (NB) Medium NB dibuat dengan cara menimbang 1,5 gram beef ekstrak, 2,5 gram pepton, dan 0,5 gram potassodium nitrat. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan panaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 1,5 atm selama 15 menit. 3.4.1.3 Medium Triple Sugar iron Agar (TSIA) Medium TSIA dibuat dengan cara menimbang 5 gram polipepton, 5 gram laktosa, 5 gram sukrosa, 0,5 gram glukosa, 2,5 gram NaCl, 0,1 feroamoniun sulfat, 0,1 gram Na-thiosulfat, 0,0125 gram fenol red, dan 6 gram agar. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 2 atm selama 15 menit. 3.4.1.4 Medium Uji Protease Broth (MR-VP) Medium MR-VP dibuat dengan cara menimbang 3,5 gram polipepton, 2,5 gram glukosa, dan 2,5 gram KH2PO4. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen
26 dan dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 2 atm selama 15 menit. 3.4.1.5 Medium Uji Simmon Sitrat Medium Simmon Sitrat dibuat dengan cara menimbang 0,1 gram magnesium sulphate, 0,1 gram ammonium dihydrogen phosphate, 0,4 gram sodium ammonium phosphate, 1 gram sodium citrate, 2,5 gram sodium chloride, 0,04 gram bromothymol blue dan 7,5 gram agar. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 2 atm selama 15 menit. 3.4.1.6 Medium Uji Urea Broth Medium Urea Broth dibuat dengan cara menimbang 0,5 gram pepton, 0,5 gram dextrose, 0,6 gram disodium phosphat, 0,4 gram pottasium dihydrogen phosphate, 2,5 gram sodium chloride, dan 0,004 gram phenol red. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan tidak sampai mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 5 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 2 atm selama 15 menit.
27 3.4.1.7 Medium Uji Sulfide Indole Motility (SIM) Medium SIM dibuat dengan cara menimbang 10 gram trypton, 0,1 gram ferrous ammonium sulphate, 0,2 gram sodium thiosulphate, dan 1,75 gram agar. Medium dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer dan tambahkan aquades steril 500 ml. Medium diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih. Medium dimasukan ke dalam tiap tabung reaksi sebanyak 7 ml dan tutup dengan sumbat. Medium disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 2 atm selama 15 menit. 3.4.2 Isolasi dan Seleksi 3.4.2.1 Medium untuk Isolasi dan Seleksi Medium isolasi dan seleksi yang digunakan adalah NA yang masing-masing mengandung 10% insektisida Chlorpyrifos dan 10% fungisida Mancozeb. Hal tersebut diartikan sebagai cara membuat medium dengan menimbang 10 gram pestisida dilarutkan dalam 100 gram NA. 3.4.2.2 Pengambilan Sampel Sampel tanah diperoleh dari tanah pertanian tomat di Desa Kutabawa, Kecamatan Karangreja, Kabupaten Purbalingga. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada satu lahan pertanian tomat dengan luas 588 m 2 yang menggunakan insektisida Chlorpyrifos dan fungisida Mancozeb. Pengambilan sampel tanah dilakukan secara acak pada 5 titik (pinggir dan tengah dalam). Sampel tanah diambil dari bagian permukaan tanah sampai kedalaman sekitar 20 cm (Lumantouw et al., 2013). Tanah diaduk-aduk supaya homogen, kemudian diambil sebanyak 5 sendok makan lalu segera dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer steril,
28 dimasukkan ke dalam es box, dan dibawa ke laboratorium. Semua pekerjaan dilakukan secara aseptis. 3.4.2.3 Prosedur Isolasi, Pemurnian dan Seleksi Bakteri Setiap sampel tanah dari titik pengambilan dilakukan isolasi mikrobanya. Sampel tanah tersebut secepatnya dibawa ke laboraturium untuk dilakukan isolasi dengan waktu tidak melebihi 3 jam (Mudryk et al., 2009). Sampel tanah yang diambil ditapis melalui penyaring untuk memisahkan tanah dari batu-batu dan materi tumbuhan. Langkah-langkah isolasi bakteri dari tanah pertanian tomat adalah sebagai berikut. a. Menyiapkan alat terlebih dahulu yaitu tabung reaksi masing-masing berisi 9 ml aquades steril, pipet ukur 1 ml, dan medium NA cawan. b. Mengambil sampel tanah menggunakan spatula secara aseptis sebanyak 1 gram, lalu memasukkannya ke dalam labu Erlenmeyer yang berisi 9 ml aquades steril (pengenceran 10-1 ). c. Mengambil 1 ml suspensi dari pengenceran 10-1 menggunakan pipet ukur steril dan memasukannya pada tabung reaksi 9 ml aquades steril (pengenceran 10-2 ). d. Mengambil kembali 1 ml suspensi dari pengenceran 10-2 dan memasukannya pada tabung reaksi 9 ml aquades steril (pengenceran 10-3 ). e. Mengambil suspensi bakteri (sampel tanah) pada pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 sebanyak 0,1 ml untuk ditumbuhkan pada medium NA cawan secara spread plate menggunakan batang Drugalsky yang masing-masing mengandung 10% insektisida dan 10% fungisida. Menginkubasi biakan selama 2x24 jam pada suhu 37 o C.
29 f. Menumbuhkan masing-masing koloni yang terpisah dan menunjukkan yang berbeda-beda ke dalam medium NA cawan dengan cara streak qadrant. Menginkubasi biakkan selama 2x24 jam pada suhu 37 o C. g. Memindahkan kembali koloni-koloni yang terpisah pada masing-masing biakkan tersebut pada medium NA cawan dengan cara goresan sinambung (zig-zag). Menginkubasi biakkan selama 2x24 jam pada suhu 37 o C. h. Pekerjaan point g dilakukan berulang-ulang sehingga diperoleh biakan yang seragam. i. Menginokulasi koloni-koloni dengan karakteristik yang telah seragam (biakan murni) ke medium NA miring yang diduga bakteri dengan cara streak lurus, menginkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37 o C. Setiap isolat ditumbuhkan pada dua medium. Medium yang digunakan mengandung 10% insektisida dan 10 % fungisida. Isolat pada tabung pertama digunakan untuk kerja (working culture) yang diperbaharui setiap 1 bulan sekali, isolat pada tabung kedua disimpan sebagai stock culture yang diperbaharui setiap 6 bulan sekali. 3.4.3 Pengamatan Karakteristik Bakteri 3.4.3.1 Pengamatan Karakteristik Makroskopis Morfologi Koloni Bakteri Isolat-isolat murni yang telah diperoleh dari hasil isolasi ditumbuhkan pada medium NB lalu dilakukan pengenceran hingga 10-7 kemudian ditumbuhkan pada medium NA secara spread plate sebanyak 0,1 ml dan di inkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37 o C untuk memperoleh koloni-koloni tunggal. Setelah diinkubasi dapat melakukan pengamatan secara makroskopis pada koloni bakteri.
30 Karakteristik makroskopis yang dapat diamati meliputi bentuk koloni yaitu berbentuk titik, bulat, tidak teratur, seperti akar, dan berfilamen atau berbenang, serta kumparan. Tepi koloni dapat berbentuk utuh, berombak, berbelah, bergerigi, berbenang, dan keriting. Warna koloni terdiri dari keputihan, kekuningan, kemerahan, cokelat, jingga, orange, pink, hijau, dan ungu. Elevasi koloni meliputi rata, timbul datar, melengkung, dan cembung. Struktur koloninya halus mengkilat, kasar, berkerut, atau kering seperti bubuk. Selain itu, ukurannya pun beragam dapat dilakukan denga mengukur diameter dari koloni bakteri yang tumbuh (Irianto, 2012). Motilitas dilakukan untuk mengetahui arah sebar pertumbuhan bakteri pada suatu permukaan medium. Menanam biakan murni bakteri pada media SIM dengan cara tusuk atau stab inoculation, kemudian menginkubasi pada suhu 37 0 C selama 2x24 jam. Hasil positif (motil) menunjukkan jika bakteri tumbuh pada seluruh permukaan media, hasil negatif (nonmotil) jika bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja. Bakteri motil akan bermigrasi ke seluruh permukaan agar dan bekas tusukan. (Maryanto et al., 2014). 3.4.3.2 Pengamatan Karakteristik Mikroskopis Bakteri Pengamatan karakteristik mikroskopis bakteri dapat diamati menggunakan mikroskopik dengan perbesaran 100x10 yang dapat ditambahkan dengan minyak imersi agar sel bakteri lebih jelas. Pengamatan secara mikroskopis ini dilakukan dengan beberapa cara yaitu pewarnaan Gram dan pewarnaan endospora (Cappuccino & Sherman, 1987).
31 1) Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengetahui bentuk sel dan sifat Gram bakteri. Pewarnaan dilakukan dengan membuat apusan bakteri dari isolat murni yang berumur 2x24 jam menggunakan jarum ose pada kaca objek, lalu di lewatkan di atas api. Meneteskan kristal violet pada apusan dan mendiamkan selama 1 menit, mencuci zat warna menggunakan aquades mengalir. Meneteskan kalium iodide, mendiamkan selama 1 menit, dan mencuci dengan aquades mengalir. Meneteskan safranin, mendiamkan selama 1 menit dan mencuci dengan aquades mengalir. Mengeringkan dengan tissue dan mengamati preparat di bawah mikroskop. Ada dua hal kemungkinan yang terjadi, yaitu pertama warna tambahan terhapus sehingga yang tampak adalah zat warna asli (ungu), dalam hal ini bakteri disebut bakteri Gram positif. Kedua, zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak nampak, dalam hal ini bakteri disebut bakteri Gram negatif (Cappuccino & Sherman, 1987). 2) Pewarnaan Endospora Endospora adalah spora yang terbentuk di dalam dinding sel bakteri untuk perlindungan dari kondisi lingkungan di sekitar bakteri yang tidak menguntungkan. Pewarnaan endospora dilakukan dengan cara mengulaskan isolat murni yang berumur 2x24 jam menggunakan jarum ose di atas kaca objek kemudian menutupnya dengan kertas merang. Pewarna pertama yang diteteskan adalah malachite green sambil diletakkan di atas penangas air dijaga jangan sampai kering, apabila kering ditambahkan malachite green lagi. Memindahkan kaca objek dari penangas air, membilasnya dengan aquades mengalir, lalu meneteskan
32 safranin dan mendiamkannya selama 30 detik. Mencuci apusan tersebut dengan aquades mengalir, kemudian mengeringkan dengan tissue. Lalu preparat diberi minyak imersi terlebih dahulu kemudian amati dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif perbesaran 1000x. Endospora akan bewarna hijau sedangkan bagian sel lainnya bewarna merah (Cappuccino & Sherman, 1987). 3.4.4 Uji Biokimia Bakteri Uji biokimia yang dilakukan adalah uji indol, uji fermentasi karbohidrat, uji methyl red, uji voges proskauer, uji penggunaan sitrat, uji katalase, uji urease, dan uji H2S (Cappucinno & Sherman, 1987) 3.4.4.1 Uji Indol Uji indol dilakukan dengan menyiapkan medium SIM agar tegak terlebih dahulu. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri menggunakan stab (tusuk ke bawah) menginokulasi biakan pada suhu 37 0 C selama 2X24 jam, kemudian menambahkan larutan kovac dan mengocoknya parlahan-lahan sampai terlihat cincin merah pada permukaan medium. Hasil uji indol positif dapat diamati dengan adanya cincin merah pada permukaan medium. Pengujian indol dilakukan untuk mengamati kemampuan bakteri dalam mendegradasi asam amino triptofan sehingga menghasilkan indol. 3.4.4.2 Uji Fermentasi Karbohidrat Uji fementasi karbohidrat dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSIA miring terlebih terlebih dahulu, satu medium sebagai kontrol. Bakteri diinokulasikan ke medium TSIA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 0
33 selama 1x24 jam. Pengujian dilakukan dengan mengamati adanya perubahan warna medium pada bagian permukaan dan bagian dasar medium. Bagian permukaan medium disebut slant, sedangkan bagian dasar medium disebut butt. Perubahan warna medium tersebut adalah sebagai berikut. Slant dan butt tidak mengalami perubahan warna, menunjukan tidak terjadi fermentasi karbohidrat. Slant berwarna merah, sedangkan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas. Kondisi tersebut menunjukkan telah terjadi fermentasi glukosa. Slant dan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas. Kondisi tersebut menunjukan telah terjadi fermentasi sukrosa dan laktosa. Butt berwarna kehitaman menunjukan adanya produksi gas H2S. 3.4.4.3 Uji MR (methyl red) Uji methyl red dilakukan dengan menyiapkan medium MR-VP terlebih dahulu. Membuat satu tabung medium sebagai kontrol. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri yang akan diuji. Lalu menginkubasi biakan pada suhu 37 0 C selama 1x24 jam. Pengujian dilakukan dengan menuangkan 1/3 suspensi biakkan ke dalam tabung reaksi yang lain, kemudian meneteskan reagen methyl red sebanyak 1-2 tetes ke dalam biakkan. Hasil uji positif dapat diamati dengan adanya cincin merah pada permukaan medium. Pengujian metil merah dilakukan untuk mengamati kemampuan bakteri dalam mengoksidasi glukosa sehingga menghasilakan asam.
34 3.4.4.4 Uji VP (voges proskauer) Uji voges proskauer dilakukan dengan menggunakan 2/3 sisa biakkan pada uji methyl red. Pengujian dilakukan dengan meneteskan reagen α-naphtol sebanyak 15 tetes dan 40% KOH sebanyak 10 tetes. Mengocok biakkan sehingga terjadi aerasi sempurna pada suspensi biakkan selam 30 menit. Hasil uji positif dapat diamati dengan adanya warna merah pada medium. Medium voges proskauer untuk mendeteksi adanya bakteri penghasil asetil metil karbonil dari asam organik dalam metabolisme glukosa. 3.4.4.5 Uji Penggunaan Sitrat Penggunaan sitrat dilakukan dengan menyiapkan medium simmon sitrat miring terlebih terlebih dahulu. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri yang akan di identifikasi. Menginkubasi pada suhu 37 0 C selama 2-4x24 jam. Uji positif positif ditandai dengan terbentuknya warna biru pada medium. Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energy. 3.4.4.6 Uji Katalase Pengujian katalase dilakukan untuk mengetahui bakteri yang dapat menghasilkan enzim katalas. Uji katalase dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSA miring terlebih terlebih dahulu, satu medium untuk uji satu medium sebagai kontrol. Bakteri diinokulasikan ke medium TSA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 1x24 jam. Setelah diinkubasi kemudian reagen H2O2 3%
35 diteteskan ke koloni. Hasil uji katalase positif jika gelembung-gelembung gas pada koloni bakteri. 3.4.4.7 Uji Urease Uji urease dilakukan dengan menyiapkan medium cair urea broth terlebih dahulu. Menginokulasi medium dengan isolate bakteri yang akan diidentifikasi. Lalu menginkubasi biakan pada suhu 37 0 C selama 1X24 jam. Hasil uji positif dapat diamati dengan adanya perubahan warna dari merah jingga menjadi merah ungu, hal ini menunjukan terjadinya hidrolisis urea. Pengujian urease dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam mendegradasi urea dengan enzim urease. 3.4.4.8 Uji Hydrogen Sulfida (H2S) Uji hydrogen sulfide dilakukan dengan menyiapkan medium SIM agar tegak terlebih dahulu. Menginokulasi medium dengan isolat bakteri menggunakan stab (tusuk ke bawah) menginkubasi biakan pada suhu 37 0 C selama 2X24 jam. Hasil positif dapat diamati dengan adanya reaksi Fe menjadi FeS yang berwarna hitam atau terjadi penghitam karena pembentukan metal sulfide (blocking). Pengujian hydrogen sulfide (H2S) dilakukan untuk mengamati kemampuan bakteri dalam mengubah asam amino alanine dan H2S. 3.5 Identifikasi Identifikasi bakteri dilakukan menggunakan buku identifikasi bakteri dari Holt, dkk (1994) dalam Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 9 th.
36 3.6 Uji Tantang Bakteri pada Beberapa Konsentrasi Insektisida dan Fungisida Pada pengujian tersebut, semua medium NA ditambahkan konsentrasi kandungan masing-masing insektisida Chlorpyrifos dan fungisida Mancozeb yang berbeda-beda yaitu 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Pertama-tama, kultur murni diisolasi lalu ditanam pada medium NA cawan dengan konsentrasi pestisida yang berbeda-beda. Penanaman isolat bakteri dilakukan dengan cara streak lurus dengan panjang 5 cm kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2x24 jam. Selanjutnya dilakukan uji tantang bakteri dengan cara mengamati ada tidaknya zona bening pada kultur (Hatmanti, 2009). Hasil (+) menunjukkan adanya zona bening. Jika terdapat zona bening maka menandakan bakteri tersebut diduga mampu menguraikan dan menggunakan senyawa insektisida Chlorpyrifos atau fungisida Mancozeb menjadi senyawa yang lebih sederhana dan mudah larut dalam air karena sifat racun teruraikan, kemudian diukur menggunakan jangka sorong sedangkan jika hasil (-) tidak terdapat zona bening maka diduga bakteri tidak dapat menguraikan atau menggunakan pestisida tersebut. Kemudian mengamati tumbuh tidaknya bakteri pada medium NA pestisida tersebutdengan konsentrasi pestisida yang berbeda-beda. Jika bakteri tumbuh pada media tersebut maka bakteri tersebut mampu bertahan hidup (toleran). 3.7 Analisis Data Data yang diperoleh meliputi nama jenis bakteri, tumbuh tidaknya bakteri terhadap medium pestisida yang dianalisis secara deskriptif kualitatif sedangkan data dari perhitungan diameter zona bening dianalisis secara deskriptif kuantitatif
37 menggunakan One Way of Analisis of Varian (ANAVA) pada taraf kepercayaan 95% (Uyanto, 2006).