III. METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan bulan Mei hingga November 2006 di Laboratorium Kesehatan Ikan Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi dan Laboratorium Kesehatan Ikan, Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Rancangan Penelitian Penelitian dilakukan dalam dua tahap. Penelitian tahap satu untuk mengkaji pengaruh suhu terhadap gambaran darah ikan dan keterkaitannya dengan kejadian infeksi KHV. Penelitian tahap dua dilakukan untuk menguji efektifitas suplementasi kromium-ragi (Cr 3+ ) sebagai bahan immunostimulan untuk meningkatkan respon imunitas selular non spesifik ikan mas dalam menghadapi serangan KHV. Penelitian tahap satu dan dua menggunakan model eksperimental laboratorium. Penelitian tahap satu dalam aplikasinya berupa penginfeksian KHV secara intramuscular (Dosis FID 50-120 jam), pada ikan mas yang dipelihara dalam suhu media yang berbeda. Rancangan yang digunakan pada penelitian tahap ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), terdiri dari 3 perlakuan, yaitu penginfeksian virus pada level suhu media : 20±2 o C (T i ), 25±2 o C (T ii ) dan 30±2 o C (T iii ). Masing-masing perlakuan suhu media, diaplikasikan dengan 3 ulangan. Adapun untuk penelitian tahap dua menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial (Faktorial RAL), terdiri atas faktor suhu dan dosis kromiumragi (Cr 3+ ). Faktor suhu menggunakan 2 level suhu media yaitu T i (suhu 20±2 o C) dan T ii (suhu 25±2 0 C), sedangkan dosis kromium-ragi terdiri dari 3 level yaitu, suplementasi kromium ragi dalam pakan sebanyak 1.5 ppm (K1); 2.0 ppm (K2); 2.5 ppm (K3) dan kontrol yaitu kromium 0 ppm (K0). Kombinasi perlakuan suhu media pemeliharan dan konsentrasi kromium ragi yang diaplikasikan pada penelitian tahap dua dapat dilihat secara lengkap pada Tabel 1.
24 Tabel 1. Kombinasi perlakuan konsentrasi kromium-ragi (Cr 3+ ) dan suhu media pemeliharaan pada penelitian tahap dua Perlakuan * Cr 3+ -ragi Cr 3+ -ragi Cr 3+ -ragi Cr 3+ -ragi 0 ppm (K0) 1.5 ppm (K1) 2.0 ppm (K2) 2.5 ppm (K3) Suhu 20±2 0 C (T i ) K0T i (A) K1T i (B) K2T i (C) K3T i (D) Suhu 25±2 0 C (T ii ) K0T ii (E) K1T ii (F) K2T ii (G) K3T ii (H) Keterangan * : Masing-masing kombinasi diulang sebanyak 3 kali. Prosedur Penelitian Penelitian Tahap Satu: Penentuan Pengaruh Suhu terhadap Infeksi KHV Ikan dan wadah pemeliharaan Ikan yang digunakan adalah ikan mas berumur 3 bulan dengan bobot 10-12 gram, diaklimatisasi selama 1 bulan dalam satu wadah, untuk mendapatkan ikan yang berukuran sama dan menentukan status kesehatan ikan. Ikan tersebut merupakan ikan bebas KHV, berasal dari daerah bebas serangan KHV. Validasi ikan uji bebas KHV ini dilengkapi pula dengan pemeriksaan DNA virus menggunakan metoda PCR. Selama proses aklimatisasi kondisi kesehatan ikan dievaluasi. Ikan yang digunakan selain bebas KHV, merupakan ikan yang sehat, tidak terserang parasit dan bakteri. Wadah penelitian adalah akuarium berukuran 60 X 40 X 40 cm 3 sebanyak 9 buah. Sebelum digunakan, akuarium dibersihkan dengan larutan KMnO 4 5 ppm, kemudian dibilas air bersih dan dikeringkan. Pemeliharan, aplikasi perlakuan suhu media Setelah wadah siap kemudian diisi dengan air bersih, yaitu air yang telah melewati proses klorinasi. Setelah akuarium diisi air ikan ditebar sebanyak 15 ekor ikan/akuarium Ikan dikondisikan di akuarium pada suhu 25-26 o C selama 4 minggu. Penyesuaian suhu air media sesuai dengan perlakuan dilakukan sebelum penginfeksian virus, dengan cara penambahan es untuk suhu 20±2 o C dan pemasangan water heater untuk 30±2 o C. Besarnya perubahan suhu/hari sebesar ± 2 o C/hari, hingga diperoleh suhu media 20±2 o C, 25±2 o C dan 30±2 o C, yang kemudian diperlakukan selama 3 minggu masa penginfeksian virus. Selama pemeliharaan ikan diberi pakan komersial sebanyak 5% bobot badan/hari dilakukan pada pagi, siang dan sore hari. Pergantian air dilakukan setiap hari sebanyak 50-70% pada pagi hari. Air yang digunakan untuk
25 pergantian air telah disiapkan 24 jam sebelumnya hasil proses klorinasi dan diaerasi. Sebelum proses pergantian air, suhu air disesuaikan terlebih dahulu dengan pemberian es dan atau dipertahankan dengan water heater Virus yang digunakan dan metoda infeksi Virus yang digunakan adalah virus herpes yang diperoleh dan ikan mas yang terserang penyakit herpes di karamba jaring apung Cirata. Ekstraksi virus dilakukan dengan cara menggerus insang ikan dengan mortar dan ditambahkan larutan NaCI fisiologis, sehingga menghasilkan konsentrat virus 10%. Pada pelaksanaan penggerusan ini, mortar dan larutan NaCl fisiologis dalam kondisi dingin. Hasil gerusan yang telah halus, disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit dengan suhu 5 C. Supernatan diambil dengan syringe kemudian disaring dengan kertas saring miliphore 0.45 µm. Hasil saringan ini merupakan inokulan baku virus herpes. Untuk keperluan selama penelitian bahan inokulan virus ini kemudian diawetkan dalam deep freezer (suhu -85 C). Sebelum dipakai bahan inokulan baku virus tersebut ditambah dengan larutan NaCl fisiologis untuk mendapatkan konsentrasi 10-5, titer yang akan digunakan untuk menginfeksi ikan mas. Dalam penelitian ini konsentrasi virus yang digunakan adalah dosis FID 50-120 jam (berdasarkan hasil penelitian pendahuluan, tertera pada lampiran 24). Hasil pengenceran ditambahkan antibiotik 10.000 IU penecillin dan 10.000 μg streptomycin. Ikan yang telah dikondisikan pada suhu sesuai perlakuan, diinjeksi 0,1 ml inokulum virus herpes dengan konsentrasi 10-5. Pengumpulan data Pengamatan kejadian infeksi KHV dilakukan berdasarkan pengamatan gejala klinis (secara visual). Pengamatan gejala klinis dilakukan setelah injeksi virus hingga hari ke-21 berdasarkan deskripsi ikan terinfeksi KHV sesuai Hedrick et al. (2000); OATA (2001); Sunarto et al. (2002), terdiri atas pemeriksaan kerusakan insang (pendarahan, kerusakan lamella, adanya bercak kekuningan dan insang warna buram), pendarahan pada bagian tubuh, perubahan warna tubuh yang menjadi buram, ketebalan lendir, penurunan nafsu makan ikan, ikan susah bernafas dan posisi renang ikan. Jumlah ikan yang mati karena infeksi virus herpes pada masing-masing perlakuan suhu dihitung dari awal infeksi hingga hari
26 ke-21. Ikan yang mati terinfeksi KHV, adalah ikan mati dan atau sekarat (moribund) yang menunjukkan gejala klinis khas serangan KHV. Prosentase ikan mati karena terinfeksi KHV dihitung berdasarkan rumus: N t I = --------- X 100% N o Keterangan : I = Prosentase ikan mati karena terinfeksi KHV (%) N t = Jumlah ikan mati terinfeksi KHV (ekor) N o = Jumlah ikan tiap unit percobaan (ekor) Validasi kejadian infeksi virus dilakukan pada setiap ikan uji, dengan bantuan metoda histologi. Ikan yang terinfeksi KHV dengan gejala klinis khas yang parah atau sekarat (moribund), diambil dan insangnya dipreparasi untuk keperluan analisa histologi. Sisa ikan yang bertahan terhadap serangan virus dipreparasi pada akhir penelitian. Melalui metoda histologi infeksi virus dievaluasi berdasarkan keberadaan badan inklusi virus pada preparat histologi. Pembuatan preparat histologi insang melalui tahapan: penyiapan sediaan, dehidrasi, clearing (penjernihan), embedding (infiltrasi), pemotongan (trimming), pewarnaan (staining), mounting dan mikrofotografi. Tahapan pembuatan preparat histologi dapat dilihat pada Lampiran 26. Preparat histologi kemudian diamati dengan bantuan mikroskop. Pengamatan terhadap status kesehatan ikan pada berbagai suhu media penginfeksian KHV dikaji berdasarkan gambaran darahnya. Pengamatan terhadap gambaran darah lebih diarahkan untuk melihat respon imunitas selular. Pemeriksaan respon imunitas selular terdiri atas prosentase hematokrit, penjenisan leukosit, total leukosit dan indeks fagositik. Pemeriksaan dilakukan dengan cara melakukan pembiusan dan mengambil darah dari 3 ekor ikan pada masing-masing unit penelitian, dari bagian kaudal (vena caudalis) dengan syringe 1 ml yang telah dibilas dengan anti koagulan (Na-sitrat 3,8%). Darah yang telah diambil ditampung ke dalam tabung mikro tube dan selanjutnya diperiksa. Metode pengukuran parameter darah tertera pada Lampiran 25. Kualitas air Parameter kualitas air yang diukur terdiri atas suhu air, kandungan oksigen terlarut, ph, amoniak, nitrit. Suhu air diukur setiap hari dengan menggunakan
27 thermometer maksimum-minimum, sedangkan parameter yang lain diukur setiap minggu. Penelitian Tahap Dua: Penentuan Efektivitas Suplementasi Kromiumragi sebagai Immunostimulan pada Suhu Rentan KHV Penelitian tahap dua mengaplikasikan 2 level suhu media yaitu T i (suhu 20±2 o C) dan T ii (suhu 25±2 o C), dimana kedua suhu tersebut bersifat rentan terhadap infeksi KHV (hasil penelitian tahap satu), sedangkan dosis kromium-ragi terdiri dari 3 level yaitu, suplementasi kromium ragi dalam pakan sebanyak 1.5 ppm (K1); 2.0 ppm (K2); 2.5 ppm (K3) dan kontrol yaitu kromium 0 ppm (K0). Ikan dan wadah pemeliharaan Ikan yang digunakan adalah ikan mas berumur 4 bulan dengan bobot 20-25 gram, diaklimatisasi selama 4 minggu untuk mendapatkan ikan yang berukuran sama dan menentukan status kesehatan ikan. Ikan yang digunakan merupakan bagian dari populasi ikan yang sama, yang digunakan pada penelitian tahap satu Wadah penelitian adalah akuarium berukuran 60 X 40 X 40 cm 3 sebanyak 24 buah. Sebelum digunakan, akuarium dibersihkan dengan larutan KMnO4 5 ppm, kemudian dibilas air bersih dan dikeringkan. Pakan yang digunakan Pakan yang digunakan adalah pakan ikan komersial berbentuk pellet dengan kandungan protein 28%. Pakan dihancurkan dengan blender kemudian dibagi 3 kelompok, masing-masing ditambahkan kromium-ragi, hingga diperoleh konsentrasi kromium (Cr 3+ ) sebesar 1.5 ppm, 2.0 ppm dan 2.5 ppm. Masingmasing kelompok pakan tersebut dihomogenkan dan dibentuk pellet kembali. Sedangkan untuk kontrol (kromium 0 ppm) adalah pakan tanpa penambahan kromium. Pemeliharaan, aplikasi perlakuan suhu dan pemberian pakan kromium-ragi Setelah wadah siap diisi dengan air yang bersih hasil klorinasi, selanjutnya ikan ditebar sebanyak 15 ekor/akuarium. Setelah ikan dipelihara selama 3 minggu, maka suhu mulai diaklimasi dengan perubahan 2 0 C/hari hingga mencapai suhu perlakuan dan kemudian dipertahankan pada masing-masing kisaran perlakuan dengan pemasangan water heater dan atau penambahan es ke dalam akuarium.
28 Sejalan dengan pemberian suhu maka pemberian pakan kromium-ragi dilakukan pula yaitu dimulai pada awal minggu ke-5. Pemberian pakan berkromium diberikan sebelum penginfeksian virus (28 hari pertama), dan dilanjutkan pula setelah penginfeksian virus (selama 28 hari), hingga akhir penelitian tahap dua. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Tabel 2. Setiap unit penelitian masing-masing diberi pakan yang mengandung kromium-ragi sesuai dengan perlakuan dengan dosis 5% bobot biomassa/hari, dan pemberiannya dilakukan 3 kali/hari, pada pagi, siang dan sore hari. Pergantian air dilakukan setiap hari sebanyak 50-70%/hari, dilakukan pada pagi hari. Air yang digunakan untuk pergantian air telah disiapkan 24 jam sebelumnya hasil proses klorinasi dan diaerasi. Sebelum proses pergantian air, suhu air disesuaikan dengan pemberian es dan atau dipertahankan dengan water heater. Tabel 2. Uraian tahapan kegiatan pada penelitian tahap dua Uraian Tahapan Kegiatan Waktu (minggu ke-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Aklimatisasi ikan Aplikasi suhu dan pakan berkromium Uji tantang virus Virus yang digunakan dan metoda infeksi Bahan virus yang digunakan pada penelitian tahap dua adalah virus dari sumber yang sama yang digunakan pada penelitian tahap satu, demikian pula dengan metode preparasi dan penginfeksian adalah sama seperti pada penelitian tahap satu. Sedangkan penginfeksian virus dilakukan pada hari ke-29 (28 hari setelah pemberian pakan berkromium). Pengumpulan data Pengamatan terhadap beberapa parameter darah dilakukan untuk menilai status kesehatan ikan selama pemberian pakan berkromium, baik pada masa sebelum penginfeksian virus maupun pada saat setelah penginfeksian virus. Pengamatan parameter gambaran darah dan metode pengukurannya, sesuai dengan penelitian tahap satu. Pengambilan sample darah dilakukan pada hari ke-0 (sebelum pemberian pakan kromium ragi), dan setelah pemberian pakan
29 berkromium yaitu : hari ke-7, 14, 21, 28 (sebelum infeksi virus) dan hari ke-36, 43, 50, 57 (setelah penginfeksian virus). Pengamatan kematian karena infeksi KHV dievaluasi berdasarkan gejala klinis secara visual, dan dilakukan setelah penginfeksian virus (hari ke-29) hingga hari ke-57 (metode pengamatan sesuai penelitian tahap satu). Ikan yang mati terinfeksi KHV, adalah ikan mati dan atau sekarat (moribund) yang menunjukkan gejala klinis khas terserang KHV, hingga hari ke-57. Prosentase ikan mati karena terinfeksi KHV dihitung berdasarkan rumus sesuai penelitian tahap satu. Kualitas air Parameter kualitas air yang diukur terdiri atas suhu air, kandungan oksigen terlarut, ph, amoniak, nitrit. Suhu air diukur setiap hari dengan menggunakan thermometer maksimum-minimum, sedangkan parameter yang lain diukur setiap minggu. Analisis Data Data gambaran darah yang diukur pada penelitian ini meliputi prosentase hematokrit, total lekosit, jenis leukosit dan indeks fagositik (parameter-parameter imunologi) dianalisis secara statistik dengan ANOVA menggunakan SPSS 12. Apabila signifikan, maka digunakan uji lanjut Duncan. Adapun variabel kualitas air, gejala klinis (visual) dan histopatologi dianalisa secara deskriptif.