METODE Lokasi dan Waktu Penelitian mengambil tempat di Laboratorioum Bagian Ilmu Produksi Ternak Perah Fakultas Peternakan IPB, Laboratorium pasca panen pertanian balai besar penelitian dan pengembangan pasca panen Bogor, dan Balai Besar Industri Agro (BBIA), Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Agustus 2009. Materi Bahan Bahan-bahan yang digunakan, antara lain: kultur starter bakteri asam laktat berasal dari biji Kefir yang digunakan sebagai starter granul, bakteri probiotik L. acidophilus (La RM-01) dan B. longum (Bl RM-01), semua kultur bakteri tersebut diperoleh dari laboratorium mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, IPB. Bahan-bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini, diantaranya: deman Rogose Sharpe Agar (MRSA), deman Rogose Sharpe Broth (MRSB), Bacteriological Agar (BA), PCA (Plate Count Agar), VRBA (Violet Red Bile Agar), Buffer Pepton Water (BPW), inulin, laktosa, sodium starch glycolate (SSG), aquades, NaOH 0,1 N, fenolftalein 1%, sodium alginate (1% w/v), CaCl 2, CaCO 3, gliserol, NaCl fisiologis, alumunium foil dan pengemas Low Density Polyethylene (LDPE). Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini, diantaranya: inkubator, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, cawan Petri, mikro pipet, lemari es, gelas ukur, ph meter, burret, spektrofotometer, stopwatch, separator, oven, autoclave, stirrer, sarung tangan plastik, mortar, timbangan digital, panci, kompor, sendok pengaduk, dan ayakan 12 dan 20 mesh. Rancangan Pengaruh jumlah bakteri probiotik pada proses enkapsulasi dan pengeringan freeze dry serta pengaruh jumlah BAL kefir pada proses pengeringan spray dry pada penelitian tahap I diujikan dengan menggunakan uji-t. Rancangan percobaan yang digunakan untuk pengujian formulasi adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola searah dengan menggunakan tiga kali ulangan, dan penilaian kualitas kefir hasil 13
aplikasi granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi dilakukan secara deskriptif. Model Model matematika yang digunakan pada pengujian formulasi adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie, 1995): Keterangan : Yij Yij = µ + τi + εij = hasil pengamatan pada perlakuan ke i dan ulangan ke j µ = nilai rataan umum τi ε = pengaruh formulasi granul ke-i = galat percobaan akibat pada ulangan ke-j dari perlakuan ke-i Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam, apabila data dengan analisis sidik ragam tersebut nyata maka akan dilanjutkan dengan uji lanjut Tukey. Prosedur Penelitian ini dilakukan melalui dua tahap, penelitian tahap I bertujuan untuk mengetahui proses pembuatan dan evaluasi granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi. Penelitian tahap II bertujuan untuk mengetahui kemampuan granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam memproduksi produk kefir sinbiotik serta menguji kulalitas mikrobiologis dan fisik dari kefir sinbiotik yang dihasilkan. Penelitian Tahap I Penelitian tahap I dibagi menjadi beberapa tahapan, diantaranya: persiapan kultur starter kefir, L. acidophilus, dan B. longum segar; penentuan waktu pemanenan bakteri asam laktat (BAL) kefir, L. acidophilus, dan B. longum; pengeringan kultur starter kefir, enkapsulasi dan pengeringan bakteri probiotik; formulasi, pembuatan dan evaluasi kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul. Persiapan Kultur Starter Kefir, L. acidophilus (La RRM-01) dan B. longum (Bl RRM-01) Persiapan kultur starter kefir, L. acidophilus (La RRM-01) dan B. longum (Bl RRM-01) dilakukan dengan pemeriksaan ketiga bakteri tersebut terhadap 14
kontaminasi melalui pengamatan mikroskopik preparat bakteri dengan bantuan metode pewarnaan Gram dan pengujian sifat katalase (Fardiaz, 1989). Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara pengolesan preparat bakteri pada gelas objek, dilanjutkan dengan fiksasi di atas api. Setelah itu kristal violet diteteskan di atas preparat, didiamkan selama ±1 menit, kemudian dibilas dengan akuades. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin selama ±1 menit dan kembali dibilas dengan aquades steril. Preparat kemudian dikeringudarakan, selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ±5 detik, dibilas kembali dengan akuades dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ±30 detik dan dibilas kembali dengan aquades, preparat kemudian dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x dengan bantuan minyak imersi. Pengujian katalase dilakukan dengan cara mengambil preparat bakteri dengan jarum ose dan dioleskan pada gelas objek, kemudian ditetesi dengan satu tetes H 2 O 2. Apabila dihasilkan gelembung-gelembung gas, maka bakteri yang diperiksa termasuk kelompok bakteri katalase positif, sebaliknya apabila tidak menghasilkan gelembung gas maka termasuk kelompok bakteri katalase negatif. Penentuan Waktu Pemanenan Bakteri Asam Laktat Asal Biji Kefir, L.acidophilus dan B. longum Penentuan waktu pemanenan dilakukan dengan cara mengikuti kurva pertumbuhan dari ketiga bakteri. Stok kultur kerja Kefir, L. acidophilus dan B. longum yang telah disegarkan masing-masing diinokulasikan sebanyak 5% (v/v) ke dalam 250 ml MRS Broth, lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Pertumbuhan biakan diamati setiap jam selama 24 jam dengan mengukur Optical Density (OD) menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke dalam persamaan garis kurva standar dengan menggunakan program excel untuk kemudian dikorelasikan sehingga didapatkan kurva pertumbuhannya. Pengeringan Kultur Starter BAL Kefir Kultur starter Kefir sebanyak 5% (v/v) diinokulasikan ke dalam susu sapi skim cair untuk menghasilkan kultur kerja. Kultur tersebut kemudian diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37 o C selama waktu inkubasi yang didapatkan pada penelitian 15
pendahuluan. Kultur kerja kemudian ditambahkan 4% maltodekstrin sebagai bahan filler dan anti lengket serta 6% laktosa sebagai bahan kriogenik (Hartaji, 2000; Pratiwi, 2005). Kesemuanya dicampur hingga homogen dengan cara diaduk, selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan pengeringan semprot pada suhu inlet 180 o C dan suhu outlet 80 o C. Diagram alir pembuatan kultur kering kefir dapat dilihat pada Gambar 1. Susu sapi skim cair + 5% Kultur Kefir Inkubasi pada suhu 37 o C selama waktu inkubasi yang telah didapat sebelumnya KKF RM-01 + 4% (b/v) maltodekstrin + 6% (b/v) laktosa Spray dry pada suhu inlet 180 o C dan suhu outlet 80 o C Kultur Starter Kefir Bubuk Gambar 1. Diagram Alir Pembuatan Kultur Starter Kefir Bubuk Enkapsulasi dan Pengeringan Bakteri L. acidophilus dan B. longum Enkapsulasi bakteri probiotik mengacu pada metode enkapsulasi Reyed (2007). Bakteri probiotik L. acidophilus dan B. longum masing-masing ditumbuhkan pada media MRSB dan diinkubasi pada suhu 37 o C serta dipanen pada fase logaritmik. Bakteri yang sudah dipanen kemudian disentrifugasi pada suhu 4 o C selama 20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm untuk memisahkan sel bakterinya. Sel dari 50 ml broth dilarutkan pada 100 ml campuran larutan susu skim (10%), inulin (2%), gliserol (5%), dan CaCO 3 (0,1%), kemudian diperangkap (dienkapsulasi) selama 45 menit di dalam 100 ml larutan alginat steril dengan konsentrasi 3%. Sel bakteri yang telah dienkapsulasi dalam alginat kemudian diteteskan pada larutan CaCl 2 (0,1M) untuk membentuk butir-butir biokapsul. Setelah satu jam biokapsul yang terbentuk kemudian disaring dan dipindahkan ke dalam larutan NaCl 16
fisiologis (0,85%) untuk mengompakkan struktur biokapsul. Setelah itu gel disaring kembali dan dipindahkan ke air distalasi kemudian diputar dengan stirrer secara perlahan selama 1 jam untuk menghilangkan residu CaCl 2. Biokapsul siap untuk dikeringkan dengan metode pengeringan beku (freeze dry). Alur pembuatan kultur starter kering probiotik terenkapsulasi dilihat pada Gambar 2. Inkubasi bakteri probiotik (L.acidophilus / B. longum) dalam MRSB (37 o C, 15 jam) Pemisahan sel bakteri dengan sentrifuse dingin (4 0 C) 10000 G selama 20 menit Sel dari 50 ml broth diresuspensi dengan 100ml aquades + larutan 10% skim, 5% gliserol, 0,1 % CaCO 3 + inulin 2% Diperangkap dalam 100 ml larutan sodium alginat steril (3% w/v) Penetesan dalam CaCl 2. H 2 O (0,1M) dan diamkan selama 1 jam, lalu disaring Perendaman dalam larutan NaCl fisiologis 0,85%, lalu disaring Perendaman dalam aquades lalu di stirred, saring Pengeringan probiotik terenkapsulasi dengan metode freeze dry Kultur starter kering probiotik terenkapsulasi Gambar 2. Diagram Alir Pembuatan Sinbiotik Kering Terenkapsulasi 17
Formulasi, Pembuatan, dan Evaluasi Kultur Starter Kefir dengan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam Bentuk Granul Granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi dibuat dengan 3 buah formulasi yang dibedakan berdasarkan imbangan SSG dan laktosa yang digunakan (KL 21 S 1, KL 20 S 2, dan KL 19 S 3 ). Ketiga buah komposisi formula imbangan laktosa dan SSG selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Formulasi Granul Kultur Starter Kefir Formulasi (%) Bahan Granul KL 21 S 1 KL 20 S 2 KL 19 S 3 Bakteri kultur starter: BAL kefir 50 50 50 Bakteri probiotik: Lactobacillus acidophilus 1 1 1 Bifidobacterium longum 1 1 1 Laktosa 21 20 19 Susu skim 26 26 26 Sodium Starch Glikolat 1 2 3 Total 100 100 100 Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan formulasi kultur starter kefir sinbiotik dalam bentuk granul terdiri atas kultur starter kefir kering dalam bentuk bubuk, sinbiotik terenkapsulasi kering dalam bentuk crumble, laktosa, sukrosa 5% (b/v), sodium starch glycolate (SSG) dan susu skim. Pembuatan granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi melalui metode granulasi basah meliputi tahaptahap penimbangan bahan-bahan yang akan digunakan, pencampuran bahan-bahan, penambahan larutan sukrosa dan pengayakan tahap pertama menggunakan ayakan 12 mesh. Hasil ayakan dikeringkan dengan oven pada suhu 40±1 o C selama 2 jam, kemudian diayak kembali dengan ayakan 20 mesh. Diagram alir pembuatan granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi secara singkat digambarkan diagram pada Gambar 3. 18
Penimbangan bahan baku granul Mixing I Penambahan Biokapsul Shifting I Drying 40±1 o C, 2 jam Shifting II Granul Pengemasan Gambar 3. Diagram Alir Pembuatan Granul Kultur Starter Kefir dengan Sinbiotik Terenkapsulasi Granul kultur starter dengan sinbiotik terenkapsulasi yang d ihasilkan dikemas secara vakum dan aseptik menggunakan alumunium foil berlapis Low Density Polyethylene (LDPE) pada bagian dalamnya dan tiap kemasan berisi 10 gram. Produk disimpan pada suhu refrigerator (5±1 o C). Granul yang telah dihasilkan kemudian diuji kualitas mikrobiologisnya, meliputi jumlah bakteri asam laktat, Total Plate Count (TPC), dan jumlah bakteri koliform. Jumlah Bakteri Asam Laktat (DSN, 1992) Sampel dan BPW dihomogenkan dan didapat pengenceran sepersepuluh (P -1 ). Selanjutnya dari P-1 dipipet 1 ml dan dilarutkan ke dalam larutan pengencer BPW 9 ml untuk memperoleh P-2, demikian seterusnya dengan cara yang sama dilakukan sampai P-7. Pemupukan dilakukan pada P-5 sampai P-7 dengan media deman Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjutnya medium MRSA yang telah dingin (±45 o 19
C) dituang ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12-15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan digerakkan membentuk angka delapan dan dibiarkan hingga agar-agar mengeras. Setelah agar mengeras, cawan Petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37 0 C selama 24-48 jam. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC). Total Plate Count (TPC) (DSN, 1992) Sampel dan BPW dihomogenkan dan didapat pengenceran sepersepuluh (P -1 ). Selanjutnya dari P-1 dipipet 1 ml dan diarutkan ke dalam larutan pengencer BPW 9 ml untuk memperoleh P-2, demikian seterusnya dengan cara yang sama dilakukan sampai P-7. Pemupukan dilakukan pada P-5 sampai P-7 dengan media Plate Count Agar (PCA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjunya PCA yang telah dingin (±45 o C) dituang ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12-15 ml. Campuran dihomogenkan dengan cara cawan digerakkan membentuk angka delapan dan dibiarkan hingga agar-agar mengeras. Cawan Petri selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C dengan posisi terbalik. Penghitungan koloni yang tumbuh dilakukan setelah 24-48 jam inkubasi. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC). Jumlah Bakteri Koliform (DSN, 1992) Penentuan jumlah koliform penduga dilakukan dengan cara sebanyak 1 ml dari inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan dipupukkan sebanyak 10-15 ml media VRBA (suhu antara 45-48 0 C). Cawan Petri dihomogenkan dengan cara cawan digerakkan membentuk angka delapan, setelah memadat sebanyak 3-4 ml media VRBA cair dituangkan kembali (overlay) di atas permukaan agar. Setelah media mengeras cawan Petri diinkubasikan pada posisi terbalik pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Jumlah mikroba ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standart Plate Count (SPC). 20
Penelitian Tahap II Penelitian tahap II terdiri atas pembuatan produk kefir sinbiotik menggunakan granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi dalam bentuk granul dan pengujian mikrobiologis produk kefir yang dihasilkan. Pembuatan Produk Kefir Sinbiotik Menggunakan Granul Kultur Starter Kefir dengan Sinbiotik Terenkapsulasi Granul kultur starter kefir diaplikasikan pada susu sapi skim bubuk yang direkondisikan. Jumlah susu skim yang digunakan disesuaikan dengan saran penyajian pada kemasan, yaitu 20 gram susu dilarutkan di dalam 200 ml air hangat. Dua puluh gram susu yang telah dilarutkan pada 200 ml air hangat kemudian dipasteurisasi pada suhu 85-90 o C selama 15 menit kemudian didiamkan sampai suhunya turun menjadi ±25 o C. Setelah itu, susu dipindahkan ke dalam gelas plastik yang telah disterilkan. Granul kultur starter kefir dengan sinbiotik terenkapsulasi diinokulasikan sebanyak 5% (b/v) ke dalam susu yang telah disiapkan sebelumnya. Setelah itu diaduk-aduk dengan menggunakan sendok sampai homogen, diinkubasi dalam inkubator pada suhu inkubator (37±1 o C) dan suhu ruang (28±1 o C) selama 24 jam. Pengujian Kualitas Kefir Hasil Aplikasi Granul Kultur Starter Kefir dengan Sinbiotik Terenkapsulasi Kefir yang dihasilkan dengan menggunakan granul kultur starter kefir diuji kualitasnya, meliputi kualitas mikrobiologis dan kualitas fisik. Kualitas mikrobiologis yang diujikan adalah jumlah bakteri asam laktat, kualitas fisik yang diujikan adalah nilai ph dan Total Asam Tertitrasi (TAT). Jumlah Bakteri Asam Laktat (BAL) (DSN, 1992) Sampel dan BPW dihomogenkan dan didapat pengenceran sepersepuluh (P -1 ). Selanjutnya dari P-1 dipipet 1 ml dan dilarutkan ke dalam larutan pengencer BPW 9 ml untuk memperoleh P-2, demikian seterusnya dengan cara yang sama dilakukan sampai P-8. Pemupukan dilakukan pada P-6 sampai P-8 dengan media deman Rogosa Sharpe Agar (MRSA) dengan cara 1 ml inokulan dipipet ke dalam cawan Petri steril dan selanjutnya medium MRSA yang telah dingin (±45 o C) dituang ke dalam cawan Petri steril tersebut sebanyak 12-15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan digerakkan membentuk angka 21
delapan dan dibiarkan hingga agar-agar mengeras. Setelah agar mengeras, cawan Petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37 o C selama 24-48 jam. Jumlah bakteri ditentukan dengan metode hitungan cawan dan untuk melaporkan hasil analisis digunakan Standard Plate Count (SPC). Nilai ph (DSN, 1992) Pengukuran ph menggunakan ph meter yang distandardisasi dengan larutan buffer ph 4 dan 7 sebelum digunakan. Sampel sebanyak 10 ml kefir sinbiotik diambil, kemudian elektroda yang telah dibilas dengan air aquades dicelupkan ke dalam sampel. Nilai yang dibaca adalah nilai saat ph meter telah stabil. Total Asam Tertitrasi (Apriyanto et al., 1989) Pengukuran total asam tertitrasi menggunakan prinsip asam basa. Sebanyak 10 ml kefir sinbiotik dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer kemudian ditambahkan 3 tetes indikator phenolphtalein 1%. Sampel dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N yang telah distandardisasi sampai terbentuk warna merah muda. Nilai TAT dihitung menggunakan rumus berikut: TAT (%) = VNaOH x NNaOH x 90 Vcontoh x 100 x 100% 22