17 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dimulai dari bulan Juni 2008 hingga Maret 2009 dan, dilaksanakan di rumah kaca kebun percobaan Cikabayan IPB, Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, dan di Laboratorium Anatomi dan Morfologi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: tanah ultisol Cikabayan, pasir, pupuk NPK, TSP dan pupuk kandang. Tumbuhan C3: benih padi gogo (Oryza sativa L.) varietas Situbagendit, caisim (Brassica rapa L.), tumbuhan C4: Echinochloa (Echinochloa crussgalli L.), dan bayam (Amaranthus caudatus), nitrogen cair, kantong kertas, aluminium foil, kertas saring, bahan-bahan untuk pengukuran parameter fotosintesis, sediaan mikroskopis, dan bahan-bahan untuk analisis kandungan asam askorbat. Alat-alat yang digunakan untuk keperluan penanaman adalah rumah kaca, dan timbangan duduk kapasitas 25 kg, rol meter. Alat-alat laboratorium yang digunakan adalah: timbangan analitik, oven, cork borer, tabung reaksi, botol piol, mortar, masker, sarung tangan, corong, biuret 50 ml, gelas ukur (250 ml dan 500 ml), mikroskop cahaya (Nikon SE), dan mikrotom putar (Yamato RV-240), Photosynthetic chlorophyl flourometer (Qubit system model ACT 1), tabung nitrogen cair, cool box, dan freezer -30 o C. Rancangan Percobaan Percobaan dirancang dan dilaksanakan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan rancangan perlakuan faktorial yang terdiri dari dua faktor. Faktor pertama adalah jenis tanaman yang meliputi 4 taraf yaitu: J1 : Padi gogo (O. sativa L.)
18 J2 : Echinochloa (E. crussgalli L.) J3 : Caisim (B. rapa L.) J4 : Bayam (A. caudatus L.) Faktor kedua adalah perlakuan cekaman yang meliputi 2 taraf yaitu: K0 : Disiram setiap hari (Kontrol) K1 : Penundaan penyiraman sampai layu berat (Kekeringan) Ada 24 unit uji ( 8 kombinasi perlakuan yang masing-masing dengan 3 ulangan). Untuk mengetahui pengaruh dari seluruh perlakuan digunakan Analysis of Variance (ANOVA), jika berbeda nyata dilakukan uji lanjut Tukey pada taraf 5% dengan menggunakan program SPSS versi 15. Pelaksanaan Penyiapan media tanam Pada percobaan ini digunakan empat jenis tumbuhan. Padi gogo varietas situbagendit diperoleh dari Balai Benih Ciomas, Bogor, Echinochloa dari P.T. Syngenta Cikampek, caisim dan bayam dari produksi P.T. Sang Hyang Seri (Persero). Tanah diambil dari kebun percobaan Cikabayan pada lapisan olah 0-25 cm, kemudian dikering-udarakan. Setelah itu dihaluskan dan disaring menggunakan saringan dengan diameter lubang 5 mm. Polibag diisi tanah campuran pasir perbandingan 1:1 sebanyak 6 kg yang telah diberi pupuk kandang 600 g per polibag. Sebelum ditanami, tanah di analisis sifat fisik dan kimianya untuk melihat kadar air tanah pada keadaan kapasitas lapang untuk menentukan jumlah air yang harus ditambahkan pada media dan titik layu permanen serta kandungan hara dan ph tanah (Lampiran 1). Penanaman dan pemeliharaan Benih ditanam di polibag yang telah disiapkan, sebanyak 3-5 benih/polibag untuk setiap perlakuan. Pada saat berumur seminggu, semua tanaman percobaan dipupuk dengan NPK 2,5 g/polibag dan TSP 1,12 g/polibag. Setelah padi gogo dan Echinochloa berumur 2 minggu, sedangkan caisim dan bayam berumur 1 minggu, maka tanaman dijarangkan hingga terdapat 2 tanaman per polibag. Tanaman disiram setiap hari sebelum diberi perlakuan cekaman kekeringan.
19 Pemberian perlakuan Keempat jenis tumbuhan diberi perlakuan, yaitu disiram setiap hari (K0) dan tanpa disiram (K1). Pemberian perlakuan tanpa disiram sampai tanaman menunjukkan gejala kritis (layu berat). Gejala layu berat terlihat setelah diberi kondisi gelap pada tumbuhan, akan tetapi pada jam enam pagi masih tetap layu. Kontrol setiap tanaman tetap disiram setiap hari. Media tanam ditutup mulsa, agar penguapan langsung dari media dapat diminimalisir. Pengambilan Data Pengukuran KAM dan KAR Pengukuran terhadap status air yang dilakukan meliputi: kadar air media tanam (KAM), dan kadar air relatif daun (KAR). KAM dan KAR diukur pada 0, 4, 8, 12 hari setelah perlakuan (HSP) untuk padi gogo, caisim dan bayam, sedangkan untuk Echinochloa diukur pada 0, 4, 8, 12 dan 14 HSP serta 2 hari setelah penyiraman kembali (recovery). KAM diukur dengan cara mengambil sampel tanah dari bagian atas, tengah dan bawah polibag. Sampel tanah ditimbang untuk memperoleh berat basah (BB), kemudian dioven pada suhu 80 0 C selama 2x24 jam untuk mendapatkan berat kering (BK). KAM diperoleh dengan rumus: BB - BK KAM BB x100% Kadar Air Relatif daun diukur dengan mengambil sampel daun posisi yang ketiga pada tumbuhan dengan menggunakan cork borer diameter 1 cm. Sampel daun yang diperoleh ditimbang untuk mendapatkan berat segar (BS), kemudian dilakukan hidrasi selama 24 jam dalam botol kecil untuk mendapatkan berat jenuh (BJ). Sampel selanjutnya di oven pada suhu 80 0 C selama 2x24 jam untuk memperoleh berat kering (BK) setelah sebelumnya didinginkan dalam desikator (Barr and Weatherley 1962). KAR didapat dihitung dengan rumus: BB - BK KAR BJ - BK x100%
20 Pengukuran Parameter Fotosintesis Pengukuran parameter fotosintesis tanaman dilakukan pada hari ke 0, 4, 8, 12 (padi caisim, dan bayam) dan 0, 4, 8, 12, 14 (echinochloa) dan 2 hari setelah penyiraman kembali. Parameter fotosintesis yang diamati meliputi: efisiensi maksimum fotosintesis (Fv/Fm), energi pelepasan fotokimia (qp), energi pelepasan non-fotokimia (qn), dan hasil quantum fotosintesis (qy). Pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat Photosynthetic Chlorophyl Flourescence (Qubit system tipe ACT 1). Daun pada posisi ke-3 pada tanaman diletakkan pada Kuvet, kemudian daun diadaptasikan pada keadaan gelap dengan cara ditutup kain hitam selama lebih kurang 20 menit. Kemudian saturating flash dinyalakan, dan fluorescence akan meningkat dari nilai ground state (Fo) ke nilai maksimum (Fm). Data yang diperoleh digunakan untuk mengukur efisiensi quantum maksimum fotosintesis dengan rumus: Fv/Fm = (Fm-Fo)/Fm. Selanjutnya Actinic light dinyalakan, pada kondisi ini fluorescence yield akan meningkat dari nilai steady state (Ft). Saturating flash dinyalakan dengan interval 20 detik dan akan dilakukan pengukuran fluorescence yield pada kondisi ada cahaya (Fm ) yang ditentukan setelah nilainya stabil. Pengukuran fluorescence yield akan diperoleh nilai photochemical quenching dengan rumus: qp = (Fm -Ft)/(Fm -Fo), non photochemical quenching, NPQ = (Fm-Fm )/Fm dan quantum Yield dari transfer elektron pada PSII, ( PSII)=(Fm -Ft)/Fm. Analisis Kandungan Asam Askorbat (ASA) (Reiss 1993) Kandungan ASA diukur dengan menggunakan metode titrasi. Sampel daun ( 5 g) digerus dalam 10 ml asam metafosforik 5%, hasil gerusan disaring dengan filter Wathman no.1. Kemudian filtrat yang diperoleh dititrasi dengan dichlorophenol-indolphenol (DCIP) 0,8 g l -1. Titrasi dihentikan ketika filtrat tepat berwarna merah muda. Standar asam askorbat diketahui dengan mentitrasi asam askorbat murni yaitu: 1 ml larutan yang mengandung asam askorbat (4,0 g l -1 ) dan 9 ml asam metaphosporik 5% dititrasi dengan dichlorophenol-indolphenol (DCIP) 0,8 g l -1. Kandungan ASA diperoleh dengan rumus sebagai berikut :
21 a. Untuk standarisasi larutan ASA ( 4 mg ASA murni ekuivalen dengan 1 ml yang dititrasi DCIP). DCIP sebagai indikator warna titrasi. ASA (mg) 4 mg ASA murni = 1 ml DCIP Volume DCIP yang dititrasi b. Untuk mengetahui kandungan ASA daun tanaman (ASA per100 gram jaringan daun): mg ASA per aliquot x (total volume ekstrak (ml)/ volume aliquot(ml)) x (100 g/berat segar) Pengamatan Pertumbuhan Pengamatan pertumbuhan tanaman setelah perlakuan kekeringan yang meliputi: tinggi tanaman, panjang akar, luas daun. Pengambilan data tinggi tanaman dan luas daun dilakukan pada 0, 3, 6, 9, 12, 14 HSP dan 2 hari setelah penyiraman. Sedangkan panjang akar diukur setelah 12 HSP pada tumbuhan padi gogo, caisim dan bayam, serta 14 HSP pada Echinochloa. Tinggi tajuk diukur mulai dari permukaan tanah sampai titik tumbuh. Panjang akar diukur mulai dari pangkal akar hingga ujung akar yang paling panjang. Pengukuran panjang dan lebar daun dipilih posisi daun yang kedua, ketiga dan keempat disetiap ulangan percobaan untuk menghitung luas daun (LD). LD dihitung menggunakan ukuran panjang daun (P) dan lebar daun (L) mengikuti metode Sitompul dan Guritno (1995), dengan rumus: LD = P x L x k (konstanta kalibrasi = 0,74) Produksi Bobot Kering Tanaman Pengukuran bahan kering tanaman meliputi; bobot kering tajuk, bobot kering akar, dan bobot kering biji. Penimbangan bobot kering tajuk dan akar dilakukan pada saat akhir perlakuan cekaman kekeringan. Bobot kering akar dan tajuk ditimbang secara terpisah setelah dioven 80 0 C selama 2x24 jam. Bobot kering biji saat panen diperoleh dengan cara menjemur biji di rumah kaca selama kurang lebih 2 minggu, lalu ditimbang.
22 Sediaan miroskopis Sampel daun untuk sayatan mikroskopis diambil pada 11 HSP kemudian langsung dimasukkan ke dalam larutan fiksatif FAA (formaldehid 37%: asam asetat glasial: alkohol 70%= 5:5:90) sebagai bahan pemfiksasi. Irisan transversal dibuat menurut metode parafin dengan campuran larutan n-butanol alkoholakuades sebagai dehidrannya (Nakamura 1995). Daun yang telah difiksasi selama 24 jam di dalam larutan FAA dimasukkan ke dalam seri larutan dehidrasi ke-3 sampai ke-7 (Lampiran 1), dengan masing-masing tahap perendaman selama 1 jam. Infiltrasi parafin dilakukan secara bertahap, selanjutnya blok parafin yang terbentuk diiris setebal 10 m kemudian pita diletakkan pada gelas objek. Sebelum pita parafin diwarnai terlebih dahulu dicelupkan ke dalam larutan xilol selama 5 menit. Sampel yang telah dicuci dengan xilol lalu diwarnai dengan pewarnaan ganda safranin 2% dan fast green 0,5%, kemudian ditetesi dengan canada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya pada 6 bidang dengan perbesaran 100, 400 dan 1000 kali. Parameter pengamatan meliputi; tebal helai daun, epidermis atas, epidermis bawah, sel bulliform, tebal jaringan palisade, tebal jaringan bunga karang, serta diameter xilem dan floem.