KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI SIGIT PURWANTOMO Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Departemen Biologi PROGRAM STUDI BIOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007 i
Judul Nama NRP Program Studi : KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI : SIGIT PURWANTOMO : P17600013 : BIOLOGI Disetujui, Komisi Pembimbing Prof. Dr.Ir. Antonius Suwanto, M.Sc Ketua Prof. Dr.Ir. Alex Hartana Anggota Prof. Dr.Ir. Maggy T Suhartono Anggota Dr.Ir. Inez H Slamet-Loedin Anggota Diketahui Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.Sc Tanggal Ujian: 29 Agustus 2007 Tanggal Lulus: ii
KATA PENGANTAR Puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa sehingga pada akhirnya penelitian dengan judul KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI dapat diselesaikan. Penelitian ini sebagian besar dibiayai oleh KNAW (Dutch Royal Academy of Sciences). Sebagian disertasi ini telah diajukan pada jurnal Anales Bogoriense dengan judul The expression of drought-repressed rice homeobox gene Oshox4 controls reduction of cell size and cell number. Di sampng itu, sebagian disertasi ini telah diajukan pula pada jurnal Plant Molecular Biology dengan judul Annotation of the homeodomain-leucinezipper (HD-Zip) family I, II and III from rice and functional analysis of the HD-Zip family I member Oshox4. Pertama-tama saya mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. Bimbingan, saran, dan dorongan semangat selama saya melakukan studi program doktor ini tidak akan pernah sekalipun saya lupakan. Ucapan terima kasih saya tujukan untuk Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana yang telah memberikan dasar genetika kepada saya selama saya sekolah di IPB. Di samping itu, saran, kritikan, dan masukan dari Bapak telah memberi dorongan positif pada desertasi saya akan selalu diingat. Terima kasih saya ucapkan untuk Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono untuk waktu yang dicurahkan dalam memberi masukan pada desertasi saya. Saran Ibu untuk memberikan desertasi saya dibaca oleh orang lain di luar ilmu yang saya tekuni ini sangat membantu memperbaiki alur berpikir saya. Hal ini akan selalu saya ingat. Terima kasih saya tujukan kepada Ibu Dr. Ir. Inez H Slamet Loedin. Pengalaman saya bekerja dan usaha Ibu Inez untuk mendorong semangat belajar saya tidak cukup untuk digambarkan dalam kalimat ini. Ibu Inez telah memberikan dasar bagi saya untuk bekerja di laboratorium biologi molekuler dan mengenalkan saya kepada teman-teman peneliti di luar negeri. Semuanya ini senantiasa tidak akan hilang dari ingatan. Terima kasih kepada Bapak Dr. Dedy Duryadi Solihin atas dorongan semangat kepada saya. Ucapan terima saya tujukan untuk Ibu Dr. Utut Widiastuti, Bapak Dr. Sony Suharsono, dan Bapak Dr. M Jusuf, serta Bapak Dr. Sugiono Moeljopawiro untuk masukan dan kritik yang telah diberikan. Pada kesempatan ini, saya mengucapkan terima kasih kepada Dr. Annemarie H Meijer yang telah memberi bimbingan selama saya bekerja di laboratorium Clusius di tahun pertama. Disiplin bekerja dan membaca yang ditanamkan tidak akan pernah saya lupakan. Kepada Dr. Pieter. BF Ouwerkerk saya mengucapkan terima kasih untuk teknik molekuler yang telah diberikan serta waktu yang dicurahkan membimbing saya di lab Clusius sejak tahun pertama dan sampai sekarang. Hampir semua teknik molekuler yang saya gunakan adalah berasal dari Pieter. Ini akan saya ingat selalu. Terima kasih saya ucapkan kepada Saskia Rueb yang telah memberikan pelajaran transformasi genetika padi. Ucapan terima kasih juga diucapkan kepada Enrico Scarpella yang telah berbagi teknik membuat preparat potongan padi. Terima kasih diucapkan lepada Marianne Verbenne yang telah dengan senang hati memberikan konstruksi asam salisilat asal bakteri kepada iii
saya. Terima kasih ditujukan untuk Huub Loffler sebagai koordinator BIORIN KNAW yang telah memberikan dorongan kepada saya. Terima kasih saya ungkapkan untuk Andi Utama, Diah Retno, dan Ibu Sukendah untuk waktu yang diberikan dalam membaca disertasi saya ini dan sekaligus membantu proses editing. Usaha yang membantu saya mengedit pada disertasi ini akan selalu saya ingat dan tidak akan terlupakan. Akhirnya kepada teman-teman di Biotek LIPI dan di IPB yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu, saya mengucapkan terima kasih yang mendalam untuk semua yang telah diberikan selama saya menempuh S3 ini. Pada desempatan ini, ucapan terima kasih saya ungkapkan kepada keluarga, Ibu-Bapak, Mamak, Mimi-Apa, Mbak Cici-Mas Gun, Iwit-Dewi, Uni, Teh Ina-A Iwan, Teh Ely-A Didi, Hendra-Ika, dan Dindin-Nia yang memberi banyak dorongan untuk saya selama belajar di Belanda dan IPB ini. Terima kasih untuk Aay, ucapan terima kasih tidak cukup hanya diungkapkan dalam dua kata terima dan kasih. Terima kasih untuk mendukung pilihan saya belajar S-3 di Leiden dan IPB. Jakarta, 2007 Sigit Purwantomo iv
RIWAYAT HIDUP Sigit Purwantomo dilahirkan di Jakarta, 10 April 1970. Menamatkan sekolah dasar dan menengah di Jakarta. Tahun 1988 diterima di IKIP Jakarta Jurusan Pendidikan Biologi. Tahun 1993 menyelesaikan pendidikan S-1 di IKIP Jakarta di bawah bimbingan Prof. Dr. Emo Kastama. Memulai pendidikan S-2 di Jurusan Biologi Universitas Indonesia pada tahun 1995 dan menyelesaikannya pada tahun 1997 dengan predikat cum laude. Penelitian S-2 dilakukan di Puslitbang Bioteknologi LIPI di bawah supervisi Dr. Usep Soetisna. Tahun 1997 bergabung dengan kelompok penelitian padi Puslit Bioteknologi di bawah supervisi Dr. Inez H Slamet-Loedin. Tahun 2001 semester genap terdaftar di Institut Pertanian Bogor. Tahun 2001-2003 bekerja di Clusius Lab, Leiden University, The Netherlands di bawah supervisi Dr. Annemarie H Meijer dan Dr. Pieter BF Ouwerkerk. Sampai sekarang bekerja di Kelompok Penelitian Padi, Lab Biologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong. v
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR ix DAFTAR SINGKATAN xiv PENDAHULUAN 1 Latar belakang 1 2 Tujuan dan manfaat penelitian... 2.1 Tujuan penelitian... 4 2.2 Manfaat penelitian... 5 TINJAUAN PUSTAKA 1 Kekeringan 1.1 Budidaya padi dan kekeringan... 7 1.2 Cekaman kekeringan: respon tanaman dan upaya rekayasa genetika untuk meningkatkan toleransi tanaman... 10 1.3 Identifikasi gen potensial untuk padi tahan kering... 17 2 HD-Zip (Homeodomain Leucine Zipper)... 18 3 Asam salisilat 21 3.1 Asam salisilat pada tanaman. 22 3.2 Asam salisilat pada mikroorganisme... 24 3.3 Sinyal dengan perantara asam salisilat... 24 3.4 Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri... 27 BAHAN DAN METODE 1 Waktu dan tempat penelitian... 29 2 Bahan penelitian... 29 3 Metodologi penelitian... 31 3.1 Karakterisasi Gen HD-Zip padi responsif kekeringan... 31 3.1.1 Penapisan HD-Zip yang merespon kekeringan... 31 3.1.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan... 33 A Meningkatkan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV... 33 A.1 Konstruksi 35S-Oshox4... 33 A.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi dan Arabidopsis... 34 A.2.1 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi... 34 A.2.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke Arabidopsis... 36 A.3 Uji kekeringan tanaman transgenik Arabidopsis 35S- B Oshox4... 36 Menurunkan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi... 37 B.1 Konstruksi vektor RNAi-Oshox4... 37 B.2 Transformasi RNAi-Oshox4 ke tanaman padi. 38 B.3 Analisis penurunan ekspresi Oshox4... 39 C Melihat pola ekspresi gen Oshox4... 39 C.1 Konstruksi vektor pc1391z mengandung fusi promoter Oshox4 dengan gen GUS.. 39 vi
C.2 Penggandaan plasmid dan transformasi Agrobacterium ke tanaman padi dan Arabidopsis... 40 C.3 Analisis ekspresi gen GUS... 40 C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico... 41 3.2 Introduksi gen-gen entc dan pmsb ke dalam tanaman padi... 41 3.2.1 Konstruksi plasmid pc1300 yang mengandung gen entc dan 41 pmsb... 3.2.2 Transformasi konstruksi gen PSA ke tanaman padi Nipponbare... 42 3.2.3 Analisis molekular ekspresi gen entc dan pmsb pada tanaman padi transgenik Nipponbare... 43 3.2.4 Pengukuran asam salisilat dan asam salisilat glukosida... 43 HASIL DAN PEMBAHASAN 1 Hasil penelitian karakterisasi gen HD-Zip 1.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman 45 1.2 Respon gen HD-Zip padi terhadap cekaman abiotik.. 45 1.3 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan. 51 1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV 52 1.4.1 Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat. 52 1.4.2 Uji kekeringan pada tanaman Arabidopsis yang mengandung 35S- Oshox4. 58 1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4 59 1.6 Analisis pola ekspresi gen Oshox4... 60 2 Hasil penelitian introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat ke tanaman padi 2.1 Analisis Northern gen hph 62 2.2 Analisis Northern gen entc.. 62 2.3 Analisis Southern gen pmsb. 63 2.4 Kandungan asam salisilat. 64 3 Pembahasan 3.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman 65 3.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan.. 66 3.3 Introduksi gen-gen penyandi biosintesis asam salisilat asal bakteri ke dalam genom padi 70 4 Pembahasan umum 70 SIMPULAN DAN SARAN 1 Simpulan 74 2 Saran 74 DAFTAR PUSTAKA... 76 vii
DAFTAR TABEL Halaman 1 Target urutan nukleotida dari HD-Zip berupa pseudopalindromic... 20 2 Jenis kultivar padi yang dipakai dalam percobaan cekaman abiotik... 30 3 Jenis bakteri yang dipakai pada percobaan kloning dan transformasi... 30 4 Daftar plasmid yang digunakan pada konstruksi gen 30 5 Perunut yang digunakan 30 6 Distribusi gen-gen HD-Zip Famili I, II, dan III Oryza sativa... 46 7 Respons sejumlah gen Oshox terhadap cekaman abiotik pada tanaman padi. 49 8 Pencarian esxpressed sequence tag (EST) menggunakan cdna gen Oshox4 53 9 Ekspresi GUS pada tanaman transgenik poshox4-gus saat terpapar cekaman kekeringan.... 62 10 Kandungan asam salisilat pada padi transgenik 65 viii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Diagram alur penelitian karakterisasi gen regulator HD-Zip untuk ketahanan kekeringan dan introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis SA berasal dari bakteri untuk ketahanan penyakit blas. Garis titik-titik merupakan tujuan jangka panjang.... 6 2 Mekanisme toleransi kekeringan dan respon tanaman saat terpapar kekeringan (Bartels & Sunkar 2004). Tanda panah menunjukkan arah pengaruh; kotak: bentuk respon sel; +: memberi pengaruh meningkatkan; -: memberi pengaruh menurunkan; ROS: spesies oksigen reaktif. Kotak menggambarkan proses dalam sel.... 9 3 Penerimaan dan respon sel saat terpapar cekaman kekeringan. Kekeringan akan mengubah komposisi protein regulator atau fungsional sel untuk keperluan adaptasi sel (Yamaguchi-Shinozaki et al. 1997).... 11 4 Lintasan penghilangan ROS (spesies oksigen reaktif) pada tanaman (Mitler 2002). A. Siklus air-air. B. Siklus glutationaskorbat. C. Siklus glutation peroksidase (GPX). D. Katalase (CAT). PSI: fotosistem I; SOD: superoksida dismutase; MDA: monodihidroaskorbat; AsA: askorbat; tapx: tilakoid APX; DHA dihidroaskorbat; MDAR: MDA reduktase; GSH: glutation; GSSG: glutation teroksidasi; DHAR: DHA reduktase; GR: glutation reduktase.... 13 5 Sistem dua komponen pada Escherichia coli dan Saccharomyces serevisiae (Kultz & Burg 1998). Huruf miring menunjukkan gen yang dipengaruhi.... 15 6 Urutan asam amino dari protein homeodomain Drosophila melanogaster antp (http://www.biosci.ki.se). Daerah dengan tanda segitiga terbalik merupakan asam amino yang juga dimiliki oleh gen yang mengandung homeobox lainnya.... 19 7 Model struktur protein HD-Zip. A. Protein HD-Zip terdiri dari dua motif. Motif HD berperan dalam pengikatan DNA pada ujung terminal N, sementara leucine zipper pada ujung terminal C berfungsi untuk dimerisasi. B. Model struktur pengikatan HD-Zip dengan DNA (http://w3.uniroma1.it/centricnr-can/edocs/ire1.htm). 19 8 Ringkasan biosintesis asam salisilat. Tanda panah memperlihatkan alternatif sintesis asam salisilat pada tanaman. Tanda panah putusputus merupakan sintesis asam salisilat pada mikroorganisme melalui konversi langsung asam korismat menjadi asam salisilat. Tanda panah dengan titik-titik adalah lintasan produk perantara yang dapat dipakai untuk mensintesis asam salisilat pada mikroganisme... 22 9 Ringkasan peran asam salisilat dalam mengaktifkan sejumlah gen dan protein. : arah pengaruh; : arah yang dihambat; : bentuk ekspresi... 25 ix
10 Tahapan yang dilakukan dalam penelitian. Penelitian mempunyai dua bagian yang terdiri dari penggunaan HD-Zip (kotak) dan introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri (segitiga) untuk pembuatan padi transgenik.... 31 11 Peta restriksi dari konstruksi untuk meningkatkan ekspresi gen Oshox4. 2 x 35S promoter: promoter ganda yang terdiri dari dua buah promoter 35S, Oshox4: daerah cdna Oshox4 pada koordinat 1-1197, 35S terminator: polya dari 35S.... 34 12 Denah perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4. X: tanaman transgenik. 20 tanaman transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4 ditanam dalam satu buah pot. Dua buah kelompok tanaman dipakai dalam percobaan ini untuk tiap-tiap galur yang dipakai.... 37 13 Konstruksi vektor untuk menurunkan ekspresi Oshox4. Produk PCR sebesar 400 bp disisipkan sebagai sense pada sisi XhoI/EcoRI dan anti-sense pada sisi HindIII/BamHI pada vektor phannibal. Cassette phannibal SacI/PstI selanjutnya disisipkan pada vektor biner pc1300.... 38 14 Konstruksi T-DNA pda vektor pc1391z mengandung promoter Oshox4. Promoter Oshox4 disisipkan pada sisi HindIII/NcoI. mcs: multiple cloning site, hph: hygromisin fosfotransferase, nos ter: terminator dari nofalin sintase, GUS: gen glukuronidase, RB: batas kanan, LB: batas kiri.. 40 15 Peta restriksi dan konstruksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri. 35S: promoter 35S dari CaMV, ss: small subunit dari Rubisco, entc: gen penyandi isokorismat sintase dari E. Coli, pmsb: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari Pseudomonas fluorescens, PIT: terminator dari gen inhibitor proteinase kentang, angka menunjukkan ukuran nukleotida apabila dipotong dengan restriksi enzim tertentu.... 42 16 Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan menggunakan gen salt sebagai penanda. Tanda panah menunjukkan terjadinya induksi gen salt pada tingkat transkripsi. j: jam... 47 17 Transkripsi gen Oshsp16.9 Oryza sativa: perlakuan kejut-panas diberikan selama 2 jam pada suhu 42 o C menggunakan analisis Northern. NB: Nipponbare; TP: Taipei. NB: Nipponbare; TP: Taipei; -: tanpa perlakuan kejut-panas; +: perlakuan kejut-panas... 47 18 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman kejut panas. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perlakuan kejut-panas 42 o C selama 2 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan... 48 19 Pola transkripsi HD-Zip Oshox19 pada cekaman kekeringan. Tanda panah menunjukkan adanya induksi.. 48 20 Pola transkripsi HD-Zip Oshox6 pada saat terpapar kekeringan. Tanda panah menunjukkan pola transkripsi terepresi... 48 21 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman perendaman. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perendaman selama 4 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan... 49 x