II. METODE PENELITIAN 2.1 Metode Pengambilan Data 2.1.1 Lokasi dan waktu penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana dan di Laboratorium analitik Universitas Udayana pada bulan Januari 2011 sampai dengan bulan Mei 2011. 2.1.2 Teknik pengambilan sampel dan pengerjaan sampel 2.1.2.1 Isolat Streptococcus mutans Isolat Streptococcus mutans yang digunakan sebagai mikroba uji diperoleh dari stok kultur Laboratorium Organik dan Biokimia Departemen Kimia Universitas Airlangga, Surabaya. 2.1.2.2 Isolasi bakteri Lactobacillus Diambil secara aseptik bagian luar dan dalam permukaan gigi juga pada lidah dengan teknik swab dengan menggunakan cotton bud steril pada pagi hari sebelum probandus menggosok gigi, kemudian cotton bud dimasukkan ke dalam tabung reaksi 9 ml media Nutrient Broth (Oxoid) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Selanjutnya, diambil sebanyak 1 loof jarum ose biakan disebar pada permukaan media MRS Agar yang telah dicampur dengan CaCO3 5% dengan streak kuadran, diinkubasi secara anaerob selama 48 jam pada temperatur 37 o C dan diamati pertumbuhan koloni yang terjadi. Koloni-koloni bakteri yang berbeda diisolasi, dimurnikan, dan disimpan pada temperatur 4 o C, sebelum dilakukan identifikasi (Rayuda, 2007; Pradopo, 2008). 5 5
2.1.2.2 Pengamatan makroskopis Koloni yang tumbuh diamati secara makroskopis meliputi bentuk, ukuran, tekstur dan warna koloni dengan menggunakan buku Isolasi dan Identifikasi Bakteri Klinik (Soemarno, 1987). 2.1.2.3 Uji Katalase Koloni bakteri yang diduga Lactobacillus diambil dan dibuat apusannya pada gelas benda kemudian ditetesi 2 tetes H2O2 3%. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya gelembung gas oksigen yang dihasilkan dari degradasi H2O2 oleh enzim katalase (Purwandani dan Rahayu, 2003). 2.1.2.4 Pengamatan mikroskopis (pewarnaan Gram) Dibuat apusan bakteri pada kaca objek yang kering dan bersih. Kemudian difiksasi di atas nyala api bunsen dan diwarnai dengan larutan kristal violet selama 1 sampai 1,5 menit. Setelah itu dicuci dengan air suling dan ditetesi dengan larutan garam iodin serta dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warnanya terhapus kurang lebih selama 30 detik. Kemudian dicuci dengan air dan diwarnai dengan safranin selama 5 sampai 15 menit lalu dicuci lagi dengan air. Setelah itu dikeringkan di udara atau di atas nyala api bunsen. Diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. 2.1.2.5 Pembuatan isolat bakteri Streptococcus mutans Dimasukkan sebanyak 1 ml suspensi bakteri S. mutans pada larutan gliserol ke dalam tabung reaksi yang telah berisi media Nutrient broth (NB) yang telah steril. Diinkubasi pada suhu 37 C dalam inkubator selama 24 jam. Direisolasi kembali pada media Nutrient Agar (NA) miring dan diinkubasi kembali pada suhu 37 C selama 24 jam bila pada media NB terlihat keruh. 6
2.1.2.6 Pembuatan suspensi bakteri Streptococcus mutans dan Lactobacillus Koloni masing-masing bakteri diambil sebanyak satu atau dua loof ose dan dipindahkan ke media NB (Nutrient Broth) sebanyak 25 ml dengan jarum ose dan diinkubasi kedalam inkubator pada suhu 37 o C. Untuk kekeruhan suspensi digunakan standar Mac Farland 0,5% yang setara dengan 10 8 sel/ml. 2.1.2.7 Pembuatan ekstrak daun sirih dan daun cabai jawa Daun sirih dan daun cabai jawa dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dikering-anginkan, diblender sampai menjadi bentuk tepung, kemudian ditimbang sebanyak 200 gram, dimaserasi dengan 1 Liter metanol selama 72 jam pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kain kasa. Filtrat yang diperoleh melalui penyaringan diuapkan dengan vaccum rotary evapovator pada suhu 40ºC untuk memisahkan solven dan ekstrak. Ekstrak yang terbentuk diencerkan dengan metanol sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan yaitu 100 ppm, 1000 ppm, 10.000 ppm, 100.000 ppm, 1.000.000 ppm dan konsentrasi 0 ppm untuk kontrol (Tunjung et al., 2001). 2.1.2.8 Bioasai ekstrak daun sirih dan daun cabai jawa terhadap bakteri S. mutans dan Lactobacillus Aktivitas antibakteri ditentukan dengan uji sensitivitas Kirby dan Bauer (1996) dengan metode difusi agar dengan menggunakan cakram kertas saring berdiameter 0,6 cm. Kegiatan ini dilakukan dengan menyiapkan cawan petri steril yang telah diisi suspensi bakteri uji sebanyak 1 ml, lalu dituangkan media Nutrient Agar dalam kondisi cair (suhu 40 C-45 C), digoyang secara simultan agar pertumbuhan bakteri terjadi secara merata. Kertas cakram yang telah didedahkan ekstrak daun sirih dan ekstrak daun cabai jawa dengan masing-masing konsentrasi (100 ppm, 1000 ppm, 10.000 ppm, 100.000 ppm dan 1000.000 ppm serta konsentrasi 0 ppm untuk kontrol) diletakkan di atas permukaan agar pada cawan petri, selanjutnya diinkubasi pada suhu 7
37ºC selama 24 sampai 48 jam dalam suasana anaerob dengan tiga kali ulangan. Untuk kontrol, didedahkan metanol pada cakram kertas saring untuk mendapatkan konsentrasi 0 ppm. Aktivitas daya hambatnya ditentukan berdasarkan diameter zona hambatan yang terbentuk di sekitar kertas cakram (zona halo). Besar kecilnya diameter zona hambatan menunjukkan tinggi rendahnya kemampuan ekstrak tanaman dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. mutans maupun Lactobacillus. Pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan dan diambil rata-ratanya. 2.2 Rancangan Percobaan Uji daya hambat ekstrak daun sirih maupun cabai jawa terhadap bakteri S. mutans dan Lactobacillus ini menggunakan rancangan percobaan acak lengkap faktorial (RAL), dengan 5 variasi konsentrasi ditambah kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Secara ringkas rancangan percobaan ini dapat disajikan dalam bagan berikut: SmEsC0 SmEsC1 SmEsC2 SmEsC3 SmEsC4 SmEsC5 SmEcC0 SmEcC1 SmEcC2 SmEcC3 SmEcC4 SmEcC5 LbEsC0 LbEsC1 LbEsC2 LbEsC3 LbEsC4 LbEsC5 LbEcC0 LbEcC1 LbEcC2 LbEcC3 LbEcC4 LbEcC5 Keterangan: Sm=Streptococcus mutans, Lb=Lactobacillus, Es=Ekstrak sirih, Ec=Ekstrak cabai jawa, C0=Konsentrasi 0 (kontrol), C1=Konsentrasi 100 ppm, C2=Konsentrasi 1000 ppm, C3= Konsentrasi 10.000 ppm, C4= Konsentrasi 100.000 ppm, C5=Konsentrasi 1000.000 ppm. 8
2.3 Metode Pengolahan Data Data yang diperoleh dianalisa secara statistik dengan menggunakan metode Analysis of Variance (ANOVA), dari hasil uji ANOVA yang berbeda nyata (P < 0,05) dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat perbedaan antar perlakuan (Steel dan Torrie, 1993). Data yang diperoleh diaplikasikan dengan menggunakan program SPSS for window version 15.0 tahun 2006. 9