Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Metode horizontal untuk deteksi dan enumerasi Escherichia coli terduga Teknik Angka Paling Mungkin (APM)

Standar Nasional Indonesia Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Metode horizontal untuk deteksi dan enumerasi Escherichia coli terduga Teknik Angka Paling Mungkin (APM) ICS 07.100.30 (ISO 7251:2005, IDT) Badan Standardisasi Nasional

BSN 2012 Hak cipta dilindungi undang-undang. Dilarang menyalin atau menggandakan sebagian atau seluruh isi dokumen ini dengan cara dan dalam bentuk apapun dan dilarang mendistribusikan dokumen ini baik secara elektronik maupun tercetak tanpa izin tertulis dari BSN BSN Gd. Manggala Wanabakti Blok IV, Lt. 3,4,7,10. Telp. +6221-5747043 Fax. +6221-5747045 Email: dokinfo@bsn.go.id www.bsn.go.id Diterbitkan di Jakarta

Daftar isi Daftar isi...i Prakata...ii Pendahuluan...iv 1 Ruang lingkup... 1 2 Acuan normatif... 1 3 Istilah dan definisi... 2 4 Prinsip...2 5 Pengencer, media biakan dan pereaksi... 3 6 Peralatan dan alat gelas... 6 7 Pengambilan contoh... 6 8 Penyiapan contoh uji... 6 9 Prosedur... 6 10 Pernyataan hasil... 9 11 Laporan uji... 9 Lampiran A (normatif) Tabel APM... 11 Bibliografi... 14 Tabel A.1 Tabel APM untuk 5 x 1 g (ml), 5 x 0,1 g (ml) and 5 x 0,01 g (ml)... 11 BSN 2012 i

Prakata Standar Nasional Indonesia (SNI) ISO 7251:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Metode horizontal untuk deteksi dan enumerasi Escherichia coli terduga Teknik Angka Paling Mungkin (APM) merupakan hasil adopsi identik dengan metode terjemahan dari ISO 7251:2005, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli -- Most probable number technique. Standar ini disusun oleh Panitia Teknis (PT) 67-04 Makanan dan Minuman. Standar ini telah dibahas dalam rapat teknis dan terakhir disepakati dalam rapat konsensus pada tanggal 15 Desember 2011 di Jakarta. Untuk tujuan penggunaan standar ini, yang dimaksud dengan This International Standard adalah This National Standar (SNI) dan diterjemahkan menjadi Standar Nasional atau Standar ini. Apabila terdapat keraguan pada standar ini, maka mengacu pada standar aslinya. Standar ISO yang digunakan dalam acuan normatif telah diadopsi identik menjadi SNI, yaitu: 1. ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination -- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions, dan diadopsi identik menjadi SNI ISO 6887-1:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Penyiapan contoh uji, suspensi awal dan pengenceran desimal untuk pengujian mikrobiologi - Bagian 1: Aturan umum untuk penyiapan suspensi awal dan pengenceran desimal. 2. ISO 6887-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination -- Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products diadopsi identik menjadi SNI ISO 6887-2:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Penyiapan contoh uji, suspensi awal dan pengenceran desimal untuk pengujian mikrobiologi - Bagian 1: Aturan khusus untuk penyiapan dan produk daging. 3. ISO 6887-3:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination -- Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery products diadopsi secara identik menjadi SNI ISO 6887-3:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Penyiapan contoh uji, suspensi awal dan pengenceran desimal untuk pengujian mikrobiologi - Bagian 3: Aturan khusus untuk penyiapan ikan dan produk perikanan. 4. ISO 6887-4:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination -- Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products diadopsi secara identik menjadi SNI ISO 6887-4:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Penyiapan contoh uji, suspensi awal dan pengenceran desimal untuk pengujian mikrobiologi - Bagian 4: Aturan khusus untuk produk selain susu dan produk susu, daging dan produk daging, ikan dan produk perikanan. BSN 2012 ii

5. ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examinations. telah direvisi oleh ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- General requirements and guidance for microbiological examinations, diadopsi secara identik menjadi SNI ISO 7218:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Persyaratan umum dan panduan untuk pengujian mikrobiologi. 6. ISO/TS 11133-1:2009, Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory, diadopsi secara identik menjadi SNI ISO/TS 11133-1:2012 Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Panduan penyiapan dan pembuatan media biakan Bagian 1: Panduan umum jaminan mutu untuk penyiapan media biakan di laboratorium. 7. ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media, dan diadopsi secara identik menjadi SNI ISO/TS 11133-2:2012, Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Pedoman penyiapan dan pembuatan media biakan Bagian 2: Panduan praktis pengujian kinerja media biakan. BSN 2012 iii

Pendahuluan Karena terdapat berbagai macam produk di bidang aplikasi ini, panduan ini mungkin tidak sesuai dalam setiap rincian untuk produk tertentu dan untuk beberapa produk lain mungkin perlu menggunakan metode yang berbeda. Namun demikian, diharapkan bahwa dalam semua kasus setiap usaha akan dilakukan untuk menerapkan panduan ini sedapat mungkin dan bahwa penyimpangan hanya akan dilakukan jika benar-benar diperlukan karena alasan teknis. Jika standar ini selanjutnya dikaji, pertimbangan akan diambil terhadap semua informasi yang kemudian tersedia, mengenai sejauh mana metode horizontal ini telah diikuti dan alasan penyimpangan dalam kasus pada produk tertentu. Harmonisasi metode uji tidak dapat dilakukan dengan segera, dan untuk kelompok produk tertentu, Standar Internasional dan/atau nasional mungkin sudah ada tetapi tidak sesuai dengan metode horizontal ini. Ketika standar tersebut ditelaah, diharapkan standar akan diubah agar sesuai dengan Standar Internasional ini sehingga yang harus dipertimbangkan selanjutnya dari metode horizontal ini adalah hanya yang diperlukan untuk alasan teknis yang mapan. BSN 2012 iv

Mikrobiologi bahan pangan dan pakan Metode horizontal untuk deteksi dan enumerasi Escherichia coli terduga Teknik Angka Paling Mungkin (APM) 1 Ruang lingkup Standar ini memberikan pedoman umum untuk deteksi dan enumerasi Escherichia coli terduga dengan teknik biakan media cair dan perhitungan angka paling mungkin (APM) setelah diinkubasi pada suhu 37 C, kemudian pada suhu 44 C. Standar ini berlaku untuk - produk yang ditujukan untuk konsumsi manusia dan pakan hewan, dan - contoh lingkungan dalam areal produksi pangan dan penanganan pangan. Perhatian Beberapa strain patogen Escherichia coli tidak tumbuh pada suhu 44 C. Keterbatasan penggunaan standar ini dipengaruhi oleh kerentanan metode ini terhadap variabilitas yang luas (lihat Pasal 10). 2 Acuan normatif Dokumen berikut merupakan bagian tidak terpisahkan untuk penggunaan dokumen ini. Untuk acuan bertanggal, hanya edisi yang diacu digunakan. Untuk acuan tidak bertanggal, edisi terakhir dari dokumen acuan (termasuk amandemen) digunakan ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions. ISO 6887-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products. ISO 6887-3, Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery products. ISO 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products. ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological examinations. ISO 8261, Milk and milk products General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory BSN 2012 1 dari 14

ISO/TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines on preparation and production of culture media Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media 3 Istilah dan definisi Untuk penggunaan standar ini, digunakan istilah dan definisi sebagai berikut. 3.1 Escherichia coli terduga (presumptive Escherichia coli) bakteri ini pada suhu 44 C memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas, dan pada suhu 44 C menghasilkan indol dari tryptophan, ketika dilakukan pengujian sesuai dengan metode spesifik dalam standar ini 3.2 enumerasi Escherichia coli terduga angka paling mungkin E. coli per milliliter atau per gram contoh uji jika uji dilakukan sesuai metode spesifik dalam standar ini 4 Prinsip 4.1 Metode deteksi 4.1.1 Media pengayaan selektif cair diinokulasi dengan sejumlah tertentu suspensi awal contoh uji. 4.1.2 Tabung diinkubasikan pada suhu 37 C dengan waktu sampai dengan 48 jam. Pembentukan gas dalam tabung diperiksa setelah 24 jam dan 48 jam. 4.1.3 Jika tabung memberikan peningkatan kekeruhan (opacity), seperti berkabut atau menghasilkan gas, maka disub-biakkan pada tabung yang berisi media selektif cair (EC broth). 4.1.4 Tabung yang diperoleh pada 4.1.3 diinkubasikan pada suhu 44 C dengan waktu sampai dengan 48 jam. Pembentukan gas dalam tabung diperiksa setelah 24 jam dan 48 jam. 4.1.5 Jika tabung media yang diperoleh pada 4.1.4 menunjukkan pembentukan gas, dari suspensi ini disub-biakkan pada tabung yang berisi pepton water bebas indol. 4.1.6 Tabung yang diperoleh pada 4.1.5 diinkubasikan pada suhu 44 C selama 48 jam. Pengamatan dilakukan terhadap produksi indol dalam tabung, sebagai hasil degradasi tryptophan yang terkandung dalam pepton 4.1.7 Tabung yang memperlihatkan kekeruhan, berkabut atau menghasilkan gas dalam media pengayaan selektif cair (4.1.1) dan menghasilkan gas pada EC broth serta indol dalam peptone water pada suhu 44 C dipertimbangkan mengandung Escherichia coli terduga. Hasil dinyatakan sebagai "ada" atau "tidak ada" Escherichia coli terduga dalam x g atau x ml produk. BSN 2012 2 dari 14

4.2 Metode enumerasi 4.2.1 Tiga tabung media pengayaan selektif cair dengan konsentrasi ganda diinokulasi dengan sejumlah tertentu suspensi awal. 4.2.2 Tiga tabung media pengayaan selektif cair dengan konsentrasi tunggal diinokulasi dengan sejumlah tertentu suspensi awal. Selanjutnya pada kondisi yang sama, tiga tabung lain yang berisi media dengan konsentrasi tunggal diinokulasi dengan sejumlah tertentu pengenceran desimal dari suspensi awal. 4.2.3 Semua tabung berisi media konsentrasi ganda dan tunggal diinkubasikan pada suhu 37 C dengan waktu sampai dengan 48 jam. Pembentukan gas dalam tabung diperiksa setelah 24 jam dan 48 jam. 4.2.4 Setiap tabung media konsentrasi ganda yang memperlihatkan peningkatan kekeruhan, berkabut atau peningkatan pengeluaran gas, serta setiap tabung media konsentrasi tunggal yang memberikan peningkatan pengeluaran gas, disub-biakkan pada tabung berisi media selektif cair (EC broth). 4.2.5 Semua tabung yang diperoleh pada 4.2.4 diinkubasikan pada suhu 44 C sampai dengan 48 jam. Produksi gas dalam semua tabung diperiksa setelah 24 jam dan 48 jam. 4.2.6 Setiap tabung media yang diperoleh pada 4.2.5 yang memberikan peningkatan pengeluaran gas disub-biakkan pada tabung yang berisi peptone water bebas indol. 4.2.7 Semua tabung yang diperoleh pada 4.2.6 diinkubasikan pada suhu 44 C selama 48 jam. Pengamatan dilakukan terhadap produksi indol dalam tabung, sebagai hasil degradasi tryptophan yang terkandung dalam pepton 4.2.8 Nilai Angka Paling Mungkin Escherichia coli terduga ditentukan dengan tabel APM (lihat Lampiran A), menurut jumlah semua tabung media konsentrasi ganda dan tunggal dari sub-biakan yang menghasilkan gas dalam EC broth dan indol dalam peptone water pada suhu 44 C. 5 Pengencer, media biakan dan pereaksi Untuk praktek laboratorium terkini, lihat ISO 7218. 5.1 Pengencer Secara umum, lihat ISO 6887-1, tetapi untuk produk susu lihat ISO 8261. BSN 2012 3 dari 14

5.2 Media pengayaan selektif (lauryl sulfate broth) 5.2.1 Komposisi a) Media konsentrasi ganda b) Media konsentrasi tunggal Enzymatic digest of plan and animal tissues 40,0 g 20,0 g Laktosa 10,0 g 5,0 g Dikalium hidrogen fosfat (K 2 HPO 4 ) 5,5 g 2,75 g Kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ) 5,5 g 2,75 g Natrium klorida 10,0 g 5,0 g Natrium lauril sulfat [CH 3 (CH 2 ) 11 OSO 3 Na] 0,2 g 0,1 g Air 1 000 ml 1 000 ml 5.2.2 Penyiapan Larutkan semua bahan atau media lengkap kering (dehydrated) dalam air, dengan pemanasan jika diperlukan. Atur ph jika diperlukan, sehingga ph setelah sterilisasi menjadi 6,8 ± 0,2 pada suhu 25 C. Masukkan masing-masing media sejumlah 9 ml ke dalam tabung berukuran 16 mm x 160 mm (6.4) yang berisi tabung Durham (6.6) untuk media konsentrasi tunggal, dan sejumlah 10 ml ke dalam tabung reaksi berukuran 18 mm x 180 mm atau 20 mm x 200 mm (6.4) yang berisi tabung Durham (6.6) untuk media konsentrasi ganda. Sterilisasi dalam otoklaf (6.1) yang diatur pada suhu 121 C selama 15 menit. Tabung Durham harus tidak berisi gelembung udara setelah sterilisasi. 5.3 EC broth (media selektif) 5.3.1 Komposisi Enzymatic digest of casein Laktosa Bile salts No. 3 a Dikalium monohidrogen fosfat (K 2 HPO 4 ) Kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ) Natrium klorida Air a lihat referensi [1]. 5.3.2 Penyiapan 20,0 g 5,0 g 1,5 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1 000 ml Larutkan semua bahan atau media komersial siap pakai (dehydrated) dalam air, dengan pemanasan jika diperlukan. Atur ph jika diperlukan, sehingga ph setelah sterilisasi menjadi 6,8 ± 0,2 pada suhu 25 C. BSN 2012 4 dari 14

Masukan media sejumlah 10 ml ke dalam semua tabung berukuran 16 mm x 160 mm (6.4) yang diberi tabung Durham (6.6). Sterilisasi dalam otoklaf (6.1) yang diatur pada suhu 121 C selama 15 menit. Tabung Durham harus tidak berisi gelembung udara setelah sterilisasi. 5.3.3 Uji kinerja dan jaminan mutu media biakan Untuk menguji kinerja media, lihat ISO/TS 11133-1 dan ISO/TS 11133-2. 5.4 Peptone water, bebas indol 5.4.1 Komposisi Enzymatic digest of casein Natrium klorida Air 5.4.2 Penyiapan 10,0 g 5,0 g 1 000 ml Larutkan semua bahan atau media komersial siap pakai (dehydrated) dalam air, dengan pemanasan jika diperlukan. Atur ph jika diperlukan, sehingga ph setelah sterilisasi menjadi 7,3 ± 0,2 pada suhu 25 C. Masukkan masing-masing media sejumlah 5 ml sampai 10 ml ke dalam tabung berukuran 16 mm x 160 mm (6.4). Sterilisasi dalam otoklaf (6.1) yang diatur pada suhu 121 C selama 15 menit. 5.5 Pereaksi indol (pereaksi Kovacs) 5.5.1 Komposisi 4-Dimetilaminobenzaldehida 2-Metilbutana-1-ol atau pentana-1-ol Asam klorida (ρ 20 1,18 g/ml to 1,19 g/ml) 5.5.2 Penyiapan 5,0 g 75,0 ml 25,0 ml Larutkan 4-dimetillaminobenzaldehida dalam alkohol dengan pemanasan secara perlahan menggunakan penangas air yang dipertahankan antara suhu 50 C dan 55 C. Dinginkan dan tambahkan asam klorida. Lindungi dari cahaya dan simpan pada suhu sekitar 4 C (lihat ISO 7218). Pereaksi harus berwarna kuning terang sampai coklat terang. CATATAN Pereaksi komersial siap pakai yang tersedia juga dapat dipakai. BSN 2012 5 dari 14

6 Peralatan teknis dan alat gelas CATATAN Peralatan sekali pakai (disposable) dapat digunakan jika memiliki spesifikasi yang sama dengan peralatan yang dapat dipakai ulang. Perlengkapan laboratorium mikrobiologi yang umum dan khusus adalah sebagai berikut: 6.1 Peralatan untuk sterilisasi kering (oven) atau sterilisasi basah (otoklaf) Lihat ISO 7218. 6.2 Inkubator, mampu beroperasi pada suhu 37 C± 1 C dan 44 C ± 1 C. 6.3 Penangas air, mampu dipertahankan pada suhu 44 C ± 1 C. 6.4 Tabung reaksi, berukuran kira-kira16 mm x 160 mm dan 18 mm x 180 mm atau 20 mm x 200 mm. 6.5 Jarum-Ose (sampling loop), terbuat dari platina/iridium atau nikel/krom, berdiameter kira-kira 3 mm, atau jarum-ose steril sekali pakai kira-kira 10 μl. 6.6 Tabung Durham, ukuran yang sesuai untuk digunakan dalam tabung reaksi (6.4). 6.7 Pipet habis tuang (total-delivery pippetes), mempunyai kapasitas nominal 1 ml dan 10 ml 6.8 ph-meter, memiliki resolusi 0,01 unit ph dan ketelitian ± 0,1 unit ph pada suhu 25 C. 7 Pengambilan contoh Contoh yang dikirim ke laboratorium sebaiknya mewakili contoh uji. Contoh sebaiknya tidak rusak atau berubah selama pengangkutan atau penyimpanan. Pengambilan contoh bukan bagian dari metode yang dipersyaratkan dalam standar ini. Jika tidak tersedia standar spesifik yang terkait dengan pengambilan contoh produk yang bersangkutan, direkomendasikan untuk mendapat kesepakatan dari pihak-pihak terkait. 8 Penyiapan contoh uji Siapkan contoh uji sesuai dengan standar spesifik yang berhubungan dengan produk terkait. Jika tidak tersedia standar yang terkait dengan pengambilan contoh produk yang bersangkutan, direkomendasikan untuk mendapatkan kesepakatan dari pihak-pihak terkait. 9 Prosedur 9.1 Metode deteksi 9.1.1 Porsi uji dan suspensi awal Lihat bagian yang sesuai pada ISO 6887 yang tergantung pada produk terkait, atau ISO 8261. BSN 2012 6 dari 14

Tambahkan 1 ml suspensi awal pada 9 ml lauryl sulfate broth konsentrasi tunggal [5.2.1 b)] (yaitu 0,1 g atau 0,1 ml contoh), atau 10 ml suspensi awal pada 10 ml lauryl sulfate broth konsentrasi ganda [(5.2.1 a)] (yaitu 1 g atau 1 ml contoh). Untuk volume porsi uji yang lebih besar, siapkan suspensi awal dengan penambahan x ml atau x g ke dalam 9x mll pengencer (lihat ISO 6887 atau ISO 8261), lalu tambahkan seluruh suspensi awal ke dalam 90x ml lauryl sulfate broth konsentrasi tunggal [5.2.1 b)]. Sebagai contoh, tambahkan 5 ml atau 5 g contoh ke dalam 45 ml pengencer, dan tambahkan seluruh suspensi awal ini ke dalam 450 ml lauryl sulfate broth konsentrasi tunggal [5.2.1 b)], atau tambahkan porsi uji pada volume yang sama pada lauryl sulfate broth konsentrasi ganda [5.2.1 a)]. 9.1.2 Inkubasi media pengayaan selektif (lauryl sulfate broth) Inkubasikan lauryl sulfate broth konsentrasi tunggal atau konsentrasi ganda (5.2) dalam inkubator (6.2) yang diatur pada suhu 37 C selama 24 jam ± 2 jam. Jika pada tahapan ini, tidak ada pembentukan gas dan kekeruhan, inkubasikan kembali sampai dengan 48 jam ± 2 jam. CATATAN Untuk kekerangan hidup, dapat digunakan waktu inkubasi selama 48 jam ± 2 jam Untuk beberapa produk susu (misalnya kasein), tabung Durham dapat tetap terletak di bagian bawah tabung media pengayaan selektif. Jika setelah 48 jam inkubasi, kekeruhan teramati tetapi tidak ada pembetukan gas, inokulasi EC broth dengan lauryl sulfate broth ini dan dilanjutkan dengan metode seperti diuraikan sesuai 9.1.3. 9.1.3 Inokulasi dan inkubasi media selektif (EC broth) Setelah inkubasi media konsentrasi ganda [(5.2.1 a)] menurut 9.1.2, jika teramati kekeruhan, berkabut atau penampakkan gas, atau setelah inkubasi media konsentrasi tunggal [(5.2.1 b)] menurut 9.1.2 jika penampakan gas teramati, inokulasikan pada tabung of EC broth (5.3) menggunakan jarum-ose (6.5) dan inkubasikan dalam penangas air (6.3) atau inkubator (6.2) yang diatur pada suhu 44 C selama 24 jam ± 2 jam. Jika tidak terlihat gas dalam EC broth (5.3), total waktu inkubasi diperpanjang sampai dengan 48 jam ± 2 jam. CATATAN Untuk kekerangan hidup, dapat digunakan.total waktu inkubasi tidak lebih dari 24 jam ± 2 jam. 9.1.4 Inokulasi dan inkubasi peptone water Setelah inkubasi menurut 9.1.3, jika pembentukan gas teramati, inokulasikan pada tabung peptone water (5.4) yang telah dipanaskan terlebih dahulu sampai suhu 44 C menggunakan jarum-ose (6.5). Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 44 C. 9.1.5 Pengujian untuk produksi indol Tambahkan 0,5 ml pereaksi indol (5.5) ke dalam tabung peptone water (5.4) yang telah diinkubasi menurut 9.1.4. Kocok merata dan amati setelah 1 menit. Warna merah dalam fase alkohol mengindikasikan adanya indol. 9.1.6 Interprestasi Hasil pengujian dianggap positif, jika media pengayaan selektif yang diinkubasi menurut 9.1.2 menunjukkan peningkatan penampakan gas dalam tabung EC broth (setelah disub- BSN 2012 7 dari 14

biakkan dan inkubasi menurut 9.1.3 dan 9.1.4), serta menunjukkan produksi indol dalam tabung peptone water. 9.2 Metode enumerasi 9.2.1 Porsi uji, suspensi awal dan pengenceran Lihat bagian yang sesuai pada ISO 6887 sesuai produk terkait, atau ISO 8261. Siapkan sejumlah pengenceran secukupnya untuk memastikan bahwa semua tabung pengenceran terakhir akan menghasilkan nilai negatif. 9.2.2 Inokulasi dan inkubasi media pengayaan selektif (lauryl sulfate broth) 9.2.2.1 Tiga seri tabung disiapkan untuk setiap pengenceran. Untuk kekerangan hidup atau produk tertentu lainnya, dan/atau ketika ketelitian hasil yang lebih tinggi diperlukan, perlu digunakan lima seri tabung (lihat Lampiran A). 9.2.2.2 Ambil tiga tabung media pengayaan selektif dengan konsentrasi ganda [5.2.1 a)]. Pipetkan 10 ml suspensi awal ke dalam setiap tabung menggunakan pipet steril (6.7). Porsi uji ini setara dengan 1 g contoh per tabung. 9.2.2.3 Lalu ambil tiga tabung media pengayaan selektif dengan konsentrasi tunggal [5.2.1 b)]. Pipetkan 1 ml suspensi awal ke dalam setiap tabung menggunakan pipet steril (6.7). Porsi uji ini setara dengan 0,1 g contoh per tabung. 9.2.2.4 Untuk setiap pengenceran lebih lanjut (setara dengan 0,01 g, 0,001 g, dan seterusnya contoh per tabung), dikerjakan seperti dalam 9.2.2.3. Gunakan pipet steril yang baru untuk setiap pengenceran. Hati-hati dalam mencampur inokulum dan media. 9.2.2.5 Inkubasikan semua tabung media pengayaan selektif konsentrasi ganda yang diinokulasi sesuai 9.2.2.2 dan tabung media pengayaan selektif konsentrasi tunggal yang diinokulasi sesuai 9.2.2.3 dan 9.2.2.4 dalam inkubator (6.2) yang diatur pada suhu 37 C selama 24 jam ± 2 jam. Jika pada tahap ini, tidak ada pembentukan gas dan kekeruhan, inkubasikan kembail sampai dengan 48 jam ± 2 jam. Untuk kekerangan hidup, inkubasi harus selama 48 jam ± 2 jam. Untuk beberapa produk susu (misalnya kasein), tabung Durham dapat tetap terletak dibagian bawah tabung media pengayaan selektif. Jika setelah 48 jam periode inkubasi, kekeruhan teramati tetapi tidak ada pembentukan gas, Inokulasikan EC broth dengan lauryl sulfate broth ini dan dilanjutkan dengan metode seperti diuraikan sesuai 9.2.3. 9.2.3 Pembuatan sub-biakan dan inkubasi media selektif (EC broth) 9.2.3.1 Untuk setiap tabung media konsentrasi ganda yang diinkubasikan sesuai 9.2.2.5 dan menunjukkan kekeruhan, berkabut atau penampakan gas, serta untuk setiap tabung media konsentrasi tunggal diinkubasi sesuai 9.2.2.5 yang menunjukkan penampakan gas, buat sub-biakan ke dalam tabung berisi EC broth (5.3) menggunakan jarum-ose.(6.5) 9.2.3.2 Inkubasikan tabung-tabung yang diinokulasi seperti pada 9.2.3.1 dalam penangas air (6.3) atau inkubator (6.2) yang diatur pada suhu 44 C selama 24 jam ± 2 jam. Jika pada tahap ini tidak ada penampakan gas dalam EC broth (5.3), perpanjang total waktu inkubasi sampai dengan 48 jam ± 2 jam. BSN 2012 8 dari 14

Untuk kekerangan hidup, total waktu inkubasi harus dibatasi sampai 24 jam ± 2 jam. 9.2.4 Inokulasi dan inkubasi peptone water Untuk setiap tabung yang diinkubasi sesuai 9.2.3.2 dan menunjukkan penampakan gas, inokulasikan menggunakan jarum-ose (6.5) pada tabung peptone water (5.4) yang telah dipanaskan sampai suhu 44 C. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 44 C. 9.2.5 Pengujian untuk produksi indol Tambahkan 0,5 ml pereaksi indol (5.5) ke tabung peptone water (5.4) yang telah diinkubasi sesuai 9.2.4. Kocok merata dan periksa setelah 1 menit. Warna merah dalam fase alkohol mengindikasikan adanya indol. 9.2.6 Interpretasi Tabung berisi media pengayaan selektif dengan konsentrasi ganda [5.2.1 a)] atau konsentrasi tunggal [5.2.1 b)] yang diinkubasikan sesuai 9.2.2, dianggap positif, jika tabung tersebut menunjukkan peningkatan penampakan gas dalam tabung EC broth (setelah disubbiakkan dan diinkubasi sesuai 9.2.3 dan 9.2.4) serta menunjukkan produksi indol dalam tabung peptone water. Untuk setiap pengenceran, hitung jumlah tabung dengan media konsentrasi ganda [5.2.1 a)] dan konsentrasi tunggal [5.2.1 b)] yang menunjukkan hasil positif. 10 Pernyataan hasil 10.1 Metode deteksi Berdasarkan interprestasi hasil (9.1.6), laporkan ada atau tidaknya Escherichia coli terduga pada porsi uji, berat dinyatakan dalam gram, atau volume dalam milliliter contoh uji. 10.2 Metode enumerasi Lihat Lampiran A. CONTOH Pada penggunaan contoh padat dan tiga seri tabung, dalam 95% kasus, batas kepercayaan bervariasi dari 13 sampai 200 Escherichia coli terduga per gram untuk APM 7,4 x 10 Escherichia coli terduga per gram, dan bervariasi dari 4 sampai 99 Escherichia coli terduga per gram untuk APM 2,4 x 10 Escherichia coli terduga per gram. 11 Laporan uji Laporan hasil uji harus menyatakan: a) semua informasi yang diperlukan untuk identifikasi contoh secara lengkap; b) metode pengambilan contoh, jika diketahui; c) metode uji yang digunakan, dengan mengacu pada standar nasional ini; BSN 2012 9 dari 14

d) semua rincian pelaksanaan yang tidak dijelaskan dalam standar nasional ini, atau diperlakukan sebagai opsional, bersama dengan rincian setiap kejadian yang mungkin mempengaruhi hasil; e) hasil uji yang diperoleh. BSN 2012 10 dari 14

Lampiran A (normatif) Tabel APM A.1 Perhitungan APM menggunakan 3 tabung Lihat ISO 7218. A.2 Perhitungan APM menggunakan 5 tabung Lihat Tabel A.1. Tabel A.1 Tabel APM untuk 5 x 1 g (ml), 5 x 0,1 g (ml) and 5 x 0,01 g (ml) Jumlah hasil positif Indeks APM Kategori a ketika jumlah contoh (setiap batch) yang diuji adalah Batas kepercayaan 1 2 3 5 10 95 % 95 % 99 % 99 % 0 0 0 < 0,18 0,00 0,65 0,00 0,93 0 0 1 0,18 2 2 2 1 1 0,00 0,65 0,00 0,93 0 1 0 0,18 2 2 2 1 1 0,01 0,65 0,00 0,93 0 1 1 0,36 3 3 3 2 2 0,07 0,99 0,02 1,40 0 2 0 0,37 3 2 2 2 1 0,07 0,99 0,02 1,40 0 2 1 0,55 0 0 0 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10 0 3 0 0,56 0 3 3 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10 1 0 0 0,20 1 1 1 1 1 0,02 0,99 0,01 1,40 1 0 1 0,40 2 1 1 1 1 0,07 1,00 0,02 1,40 1 0 2 0,60 0 0 3 3 3 0,17 1,40 0,09 2,10 1 1 0 0,40 1 1 1 1 1 0,07 1,10 0,03 1,40 1 1 1 0,61 3 2 2 2 1 0,17 1,40 0,09 2,10 1 1 2 0,81 0 0 0 0 3 0,33 2,20 0,20 2,80 1 2 0 0,61 2 1 1 1 1 0,18 1,40 0,09 2,10 1 2 1 0,82 3 3 3 3 2 0,33 2,20 0,20 2,80 1 3 0 0,83 3 3 3 3 2 0,33 2,20 0,20 2,80 1 3 1 1,0 0 0 0 0 3 0,3 2,2 0,2 2,8 1 4 0 1,1 0 0 0 0 3 0,3 2,2 0,2 2,8 2 0 0 0,45 1 1 1 1 1 0,08 1,4 0,04 2,10 2 0 1 0,68 2 1 1 1 1 0,18 1,50 0,09 2,10 2 0 2 0,91 0 3 3 3 3 0,33 2,20 0,20 2,80 2 1 0 0,68 1 1 1 1 1 0,19 1,70 0,10 2,30 2 1 1 0,92 2 2 1 1 1 0,33 2,20 0,20 2,80 BSN 2012 11 dari 14

Jumlah hasil positif Indeks APM Tabel A.1 (lanjutan) Kategori a ketika jumlah contoh (setiap batch) yang diuji adalah Batas kepercayaan 1 2 3 5 10 95 % 95 % 99 % 99 % 2 1 2 1,2 0 0 3 3 3 0,4 2,5 0,2 3,4 2 2 0 0,93 1 1 1 1 1 0,34 2,20 0,20 2,80 2 2 1 1,2 3 3 2 2 2 0,4 2,5 0,2 3,4 2 2 2 1,4 0 0 0 0 3 0,6 3,4 0,4 4,4 2 3 0 1,2 3 2 2 2 1 0,4 2,5 0,2 3,4 2 3 1 1,4 0 3 3 3 3 0,6 3,4 0,4 4,4 2 4 0 1,5 0 3 3 3 3 0,6 3,4 0,4 4,4 3 0 0 0,78 1 1 1 1 1 0,21 2,20 0,12 2,80 3 0 1 1,1 1 1 1 1 1 0,4 2,2 0,2 2,9 3 0 2 1,3 3 3 3 2 2 0,6 3,4 0,4 4,4 3 1 0 1,1 1 1 1 1 1 0,4 2,5 0,2 3,4 3 1 1 1,4 2 1 1 1 1 0,6 3,4 0,4 4,4 3 1 2 1,7 3 3 3 3 2 0,6 3,4 0,4 4,4 3 2 0 1,4 1 1 1 1 1 0,6 3,4 0,4 4,4 3 2 1 1,7 2 2 2 1 1 0,7 3,9 0,5 5,1 3 2 2 2,0 0 3 3 3 3 0,7 3,9 0,5 5,2 3 3 0 1,7 2 2 1 1 1 0,7 3,9 0,5 5,2 3 3 1 2,1 3 3 3 2 2 0,7 3,9 0,5 5,2 3 3 2 2,4 0 0 0 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4 3 4 0 2,1 3 3 2 2 2 0,7 4,0 0,5 5,2 3 4 1 2,4 0 3 3 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4 3 5 0 2,5 0 0 0 3 3 1,0 6,6 0,7 9,4 4 0 0 1,3 1 1 1 1 1 0,4 3,4 0,3 4,4 4 0 1 1,7 1 1 1 1 1 0,5 3,4 0,4 4,4 4 0 2 2,1 3 2 2 2 2 0,7 3,9 0,5 5,2 4 0 3 2,5 0 0 0 0 3 1,0 6,6 0,7 9,4 4 1 0 1,7 1 1 1 1 1 0,6 3,9 0,4 5,1 4 1 1 2,1 1 1 1 1 1 0,7 4,1 0,5 5,3 4 1 2 2,6 3 3 2 2 2 1,0 6,6 0,7 9,4 4 1 3 3,1 0 0 0 0 3 1,0 6,6 0,7 9,4 4 2 0 2,2 1 1 1 1 1 0,7 4,8 0,5 6,1 4 2 1 2,6 2 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 4 2 2 3,2 3 3 3 2 2 1,0 6,6 0,7 9,4 4 2 3 3,8 0 0 0 0 3 1,3 10,0 0,9 14,7 4 3 0 2,7 1 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 4 3 1 3,3 2 2 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 4 3 2 3,9 3 3 3 3 2 1,3 10,0 0,9 14,7 BSN 2012 12 dari 14

Jumlah hasil positif Indeks APM Tabel A.1 (lanjutan) Kategori a ketika jumlah sampel Batas kepercayaan (setiap batch) yang diuji adalah 1 2 3 5 10 95 % 95 % 99 % 99 % 4 4 0 3,4 2 2 1 1 1 1,3 10,0 0,9 14,7 4 4 1 4,0 3 3 2 2 2 1,3 10,0 0,9 14,7 4 4 2 4,7 0 0 0 3 3 1,4 11,3 0,9 14,7 4 5 0 4,1 3 3 3 3 2 1,3 10,0 0,9 14,7 4 5 1 4,8 0 0 3 3 3 1,4 11,3 0,9 14,7 5 0 0 2,3 1 1 1 1 1 0,7 6,6 0,5 9,4 5 0 1 3,1 1 1 1 1 1 1,0 6,6 0,7 9,4 5 0 2 4,3 3 2 2 2 1 0,3 10,0 0,9 14,7 5 0 3 5,8 0 0 0 3 3 2,1 14,9 1,4 20,0 5 1 0 3,3 1 1 1 1 1 1,0 10,0 0,7 14,7 5 1 1 4,6 1 1 1 1 1 1,4 11,3 0,9 14,7 5 1 2 6,3 2 2 1 1 1 2,1 14,9 1,4 20,0 5 1 3 8,4 3 3 3 3 2 3,4 11,0 2,1 27,0 5 2 0 4,9 1 1 1 1 1 1,5 14,9 0,9 20,0 5 2 1 7,0 1 1 1 1 1 2,2 16,8 1,4 23,0 5 2 2 9,4 2 2 1 1 1 3,4 22,0 2,1 28,0 5 2 3 12 3 3 2 2 2 3 24 2 32 5 2 4 15 0 0 0 0 3 6 35 4 45 5 3 0 7,9 1 1 1 1 1 2,3 22,0 1,5 27,0 5 3 1 11 1 1 1 1 1 3 24 2 32 5 3 2 14 1 1 1 1 1 5 35 3 45 5 3 3 17 3 2 2 2 1 7 39 4 51 5 3 4 21 3 3 3 3 2 7 39 4 51 5 4 0 13 1 1 1 1 1 3 35 3 45 5 4 1 17 1 1 1 1 1 6 39 4 51 5 4 2 22 1 1 1 1 1 7 44 4 57 5 4 3 28 2 1 1 1 1 10 70 6 92 5 4 4 35 2 2 2 1 1 10 70 6 92 5 4 5 43 0 0 3 3 3 15 106 9 150 5 5 0 24 1 1 1 1 1 7 70 4 92 5 5 1 35 1 1 1 1 1 10 106 6 150 5 5 2 54 1 1 1 1 1 15 166 10 223 5 5 3 92 1 1 1 1 1 23 253 15 338 5 5 4 160 1 1 1 1 1 40 460 20 620 5 5 5 > 160 CATATAN Hasil ini didasarkan pada acuan [2]. a Untuk penjelasan kategori, lihat ISO 7218. BSN 2012 13 dari 14

Bibliografi [1] ICMSF Microorganisms in Foods, 1988, Vol. 1, p. 280, University of Toronto Press, Toronto, Canada [2] DE MAN, J.C. MPN tables, corrected. Eur. J. Appl. Biotechnol., 1983, 17, pp. 301-305 BSN 2012 14 dari 14