BAB III METODE PENELITIAN III. 1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Patologi Klinik RSUD Dr. Moewardi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta pada bulan September 2012 sampai November 2012. III. 2. Jenis Penelitian Penelitian ini adalah penelitian comparative dengan rancangan cross sectional (potong lintang), seluruh pengamatan dan pemeriksaan variabel penelitian dikerjakan satu kali pada episode yang sama. Materi penelitian ini menggunakan saliva pada orang sehat/normal, pasien SIRS, dan pasien sepsis. III. 3. Subyek Penelitian III. 3. 1. Populasi Penelitian Populasi sasaran pada penelitian ini adalah orang sehat/normal, pasien SIRS, dan pasien sepsis dengan usia 19 59 tahun. Populasi terjangkau pada penelitian ini ada lah residen Anestesi dan Terapi Intensif FK UNS RSUD Dr. Moewardi Surakarta untuk populasi sehat/normal, sedangkan untuk pasien SIRS dan pasien sepsis adalah pasien yang datang di RSUD Dr Moewardi Surakarta. Semua populasi dilakukan uji saliva dengan metode flowcytometry dan apus saliva dan telah dilakukan persetujuan ikut dalam penelitian sebelumnya. 42
III. 3. 2. Unit Analisis Sediaan netrofil yang diperoleh dari hasil uji saliva pada orang sehat/normal, pasien yang didiagnosa SIRS, dan pasien yang didiagnosa sepsis dengan metode flowcytometry dan apus saliva. III. 4. Sampel Penelitian III. 4. 1. Kriteria Inklusi Kriteria inklusi dalam penelitian ini adalah: (1) Subyek setuju ikut dalam penelitian dengan menandatangani informed concent; (2) Umur 19 59 tahun; (3) Memenuhi kriteria normal/sehat atau diagnosa SIRS atau diagnosa sepsis. III. 4. 2. Kriteria Eksklusi Kriteria ekslusi dalam penelitian ini adalah : (1) Sepsis berat, dan (2) Syok septik. III. 4. 3. Rumus Ukuran Sampel Sampel dihitung menggunakan role of thumb (Murti, 2010). Besar sampel minimal yang dibutuhkan adalah 30 subyek untuk tiap kelompok sampel. III. 4. 4. Teknik Pengambilan Sampel Sampel penelitian sediaan orang sehat/normal, pasien SIRS dan pasien sepsis diperoleh dengan menggunakan teknik non-probability sampling yaitu menggunakan consecutive sampling. Teknik consecutive sampling digunakan karena semua subyek yang datang dan memenuhi kriteria penelitian dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah subyek yang diperlukan terpenuhi. 43
III. 5. Variabel Penelitian Pada penelitian ini terdapat variabel bebas yaitu: saliva dari orang sehat/normal, saliva dari pasien dengan diagnosa SIRS, dan saliva dari pasien yang didiagnosa sepsis, sedangkan variabel terikat yaitu netrofil saliva yang terdeteksi dengan metode flowcytometry dan apus saliva. Pada penelitian ini terdapat variabel pengganggu tak terkendali: infeksi primer/sekunder sepsis, status imunitas, usia, serotipe sepsis. Variabel pengganggu terkendali dalam penelitian adalah: teknis pengambilan sampel, petugas, transportasi, penyimpanan, alat/kit uji yaitu flowcytometry. Blinding dilakukan pada petugas pengambil sampel bahan uji berbeda dengan petugas laboratorium, dan petugas laboratorium pemeriksa bahan uji saliva. III. 6. Definisi Operasional 1. SIRS adalah pasien yang memiliki dua atau lebih kriteria sebagai berikut: suhu > 38 0 C atau < 36 0 C, denyut jantung > 90 kali/menit, respirasi > 20 kali/menit atau Pa CO 2 < 32 mmhg, hitung leukosit > 12.000/mm 3 atau > 10% sel immature. 2. Sepsis adalah SIRS ditambah tempat infeksi yang diketahui. 3. Netrofil adalah lekosit polimorfonuklear yang paling awal datang ke sumber infeksi dan melakukan fagositosis. 4. Saliva adalah cairan biologis yang dihasilkan oleh kelenjar ludah di dalam rongga mulut yang berperan pada proses kesehatan dalam mulut dan juga mencerminkan kondisi kesehatan secara umum. 5. Uji kuantitatif netrofil adalah pengukuran jumlah netrofil pada saliva dengan menggunakan metode flowcytometry dengan satuan hasil selx10 3 /μl. 6. Uji kualitatif netrofil adalah penilaian aktivitas fagositosis, perubahan morfologi (toxic granulation dan vacuolation) dari netrofil melalui 44
pemeriksaan apus saliva yang dilihat dengan mikroskop (pembesaran 100 x), dengan hasil positif atau negatif. 7. Uji flowcytometry adalah pemeriksaan di mana sel-sel dari sampel masuk dalam suatu flow chamber, dibungkus oleh cairan pembungkus, kemudian dialirkan melewati suatu celah atau lubang dengan ukuran kecil yang memungkinkan sel lewat satu demi satu, kemudian dilakukan pengukuran. 8. Apus saliva adalah sediaan apus saliva yang metode pembuatannya sama dengan metode apus darah dengan menggunakan pengecatan hematoksillin eosin. 9. Netrofil dalam saliva adalah adanya daya antimikroba dalam cairan tubuh saliva sebagai tanggapan tubuh atas adanya proses infeksi/sepsis. III. 7. Alat dan Bahan Penelitian Pada penelitian ini alat dan bahan yang digunakan adalah saliva, alat uji diagnostik netrofil, Advia 120 (flowcytometry), wadah sampel saliva yang bersih dan bertutup (seperti wadah/pot sputum), mikropipet, yellow tip, tabung sampel, rak tabung, hemaktosilin eosin, kaca obyek, mikroskop, label identitas bahan uji, dan formulir pemeriksaan. III. 8. Cara Penelitian Penelitian diawali dengan pengambilan bahan uji dari sampel di rumah sakit (hospital based sample, consequtive sample). Sampel saliva diambil dari orang sehat, penderita SIRS sesuai kriteria diagnosa, penderita sepsis sesuai kriteria diagnosa yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi penelitian. Sampel orang sehat diambil satu kali, yaitu pada saat datang ke rumah sakit. Sampel penderita SIRS dan sepsis diambil satu kali, yaitu pada saat masuk rumah sakit. Sampel saliva diambil saat bangun tidur, sebelum mengkonsumsi makanan dan minuman, atau 2 jam setelah makan dan minum terakhir. Sampel saliva dimasukkan dalam wadah khusus dan diberi label identitas, kode, tanggal pengambilan sampel. Bahan uji saliva segera dimasukkan dalam pendingin (termos berisi es) dan segera dibawa atau dikirim ke 45
laboratorium untuk diperiksa. Bahan uji saliva diperiksa netrofil dengan uji flowcytometry dan apus saliva. Prosedur pemeriksaan netrofil dengan flowcytometry : 1. Alat dan bahan pemeriksaan yang diperlukan disiapkan terlebih dahulu, dan diletakkan di atas meja laboratorium. 2. Homogenkan sampel dengan cara mengocok selama 5-10 menit. 3. Scan barcode sampel menggunakan pembaca barcode. 4. Buka tabung yang berisi saliva dan dimasukkan ke dalam probe needle lalu tekan dinding sekali maka lampu hijau akan berkedip diakhiri dengan bunyi pada monitor. 5. Hasil akan keluar pada menu Run Screen. III. 9. Alur Penelitian POPULASI Kriteria inklusi dan eksklusi penelitian Orang sehat/normal Penderita SIRS Penderita sepsis Saliva UJI DIAGNOSA Hasil penelitian: netrofil saliva Analisis statistik: Uji beda rerata : Anova/Kruskal-wallis Uji beda proporsi : Chi-square Kesimpulan Gambar 3.1. Alur Penelitian 46
III. 10. Etika Penelitian Penelitian dilakukan setelah mendapatkan izin dari Komite Etik RSUD Dr. Moewardi Surakarta. Komite Etik melakukan pengkajian, kemudian menyetujui untuk dilakukan penelitian dengan prinsip tidak melanggar etika praktek kedokteran dan tidak bertentangan dengan etika penelitian pada manusia. Penelitian dilakukan dengan persetujuan dari pasien atau keluarga dengan cara menandatangani surat persetujuan operasi yang diajukan oleh peneliti, setelah sebelumnya mendapat penjelasan mengenai tujuan, resiko, alternatif tindakan yang akan dilakukan, prognosis, dan manfaat dari prosedur yang akan dilakukan. III. 11. Analisis Statistik Setelah data terkumpul ditabulasi dan dianalisis menggunakan uji deskriptif dan analitik. Langkah-langkah analisis yang dilakukan adalah: a. Uji prasyarat komparatif. Uji prasyarat yang dilakukan adalah uji normalitas dan uji homogenitas. b. Analisis bivariabel: untuk menguji hubungan antara variabel bebas dan variabel terikat. Uji komparatif digunakan untuk menganalisis perbandingan rerata netrofil saliva pada subyek normal/sehat, pasien SIRS, dan pasien sepsis. Untuk uji beda kelompok lebih dari dua dengan sampel yang berbeda (independent) pada data parametrik dapat menggunakan analisis uji One Way Anova sedangkan untuk data yang tidak normal menggunakan analisis non parametrik dengan rumus Uji Kruskal-wallis. Uji chi-square (X 2 ) digunakan untuk menganalisis perbedaan proporsi kualitas netrosil saliva dengan hasil positif atau negatif dari subyek normal/sehat, pasien SIRS, dan pasien sepsis. Derajat kepercayaan yang digunakan dalam penelitian sebesar 95%, dengan tingkat kemaknaan 5% (p < 0,05). 47