ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan penelitian Penelitian ini merupakan penelitian menggunakan desain eksperimental (True experiment-post test only control group design). Dalam penelitian yang pertama dilakukan uji daya hambat ekstrak siwak terhadap E. faecalis dalam kondisi planktonik dengan menggunakan metode dilusi untuk mendapatkan kadar hambat minimum bakteri. Kemudian dilakukan uji antibiofilm menggunakan konsentrasi ekstrak yang sama sehingga diperoleh kadar hambat minimum biofilm bakteri. 4.2 Unit analisis penelitian 4.2.1 Unit analisis uji daya hambat bakteri Unit analisis uji daya hambat bakteri adalah ekstrak siwak 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan 100% yang diberikan terhadap pertumbuhan bakteri E. faecalis, dan jumlah koloni bakteri E. faecalis yang ditanam pada media Trypticase Soy Agar Sampel penelitian adalah kultur bakteri E. faecalis yang diperoleh dari Laboratorium RSPTI Surabaya. Dari sediaan kultur tersebut inokulum masingmasing bakteri diinkubasi pada Trypticase Soy Broth pada suhu 37 C selama 18 jam serta diencerkan dengan 0,85% larutan NaCl steril sehingga mencapai suspensi kekeruhan yang setara dengan Standard Mc.Farland 0,5. Kultur setiap bakteri ditanam pada sediaan Trypticase Soy Agar padat serta diinkubasi selama 40
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 41 24 jam pada suhu 37 C. (Poelongan dan Praptiwi, 2010., Oli et al., 2012; Masadeh et al., 2013). 4.2.2 Unit analisis uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri Ekstrak siwak 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan 100%, yang diberikan terhadap tiap pertumbuhan biofilm bakteri E. faecalis, dan nilai Optical Density biofilm bakteri E. faecalis yang terbaca pada ELISA Reader dengan panjang gelombang 595 nm. Sampel penelitian adalah kultur biofilm bakteri E. faecalis diisolasi dari kultur bakteri E. faecalis yang diperoleh dari Laboratorium RSPTI Surabaya. Dari sediaan kultur tersebut, 100µL suspensi dibiakkan dalam polyprophylene tube yang mengandung 2 ml Trypticase Soy Broth (TSB) dengan penambahan glukosa 1% selama 48 jam pada suhu 37 C. Setelah 48 jam inkubasi, sel biofilm dipanen melalui pembuangan media kultur dan membilas tube sebanyak tiga kali dengan 200µL Phosphat Buffer Saline (PBS, ph 7,2) untuk menghilangkan bagian bakteri yang non adesif. Sel yang adesif dipanen melalui proses vortex dan sentrifugasi. Pellet tersuspensi dalam PBS untuk kemudian dikondisikan pada 0,5 Standar turbiditas (kekeruhan) McFarland. (Oli et al., 2012; Masadeh et al., 2013; Geethashri et al., 2014) 4.3 Besar sampel penelitian Besar sampel penelitian uji daya hambat bakteri maupun daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri menggunakan rumus yang sama. Jumlah sampel
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 42 yang ditentukan dalam masing-masing penelitian ini menggunakan rumus Federer (Federer, 1991; Islam, 2007) : {(p-1) (n-1)} 15 Keterangan: n : jumlah replikasi p : jumlah kelompok perlakuan Uji anti bakteri : p = 14 =13n-13 15, maka n 3 Uji anti biofilm bakteri : p = 16 =15n-15 15, maka n 2 Berdasar perhitungan rumus tersebut maka dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali sehingga didapatkan 4 sampel pada masing-masing perlakuan. 4.4 Variabel penelitian 4.4.1 Variabel bebas penelitian uji daya hambat bakteri dan biofilm bakteri Variabel bebas dalam penelitian uji daya hambat bakteri dan biofilm bakteri adalah ekstrak siwak 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan 100%. 4.4.2 Variabel terikat penelitian uji daya hambat bakteri Variabel terikat dalam penelitian daya hambat ekstrak siwak terhadap pertumbuhan bakteri adalah pertumbuhan bakteri E. faecalis yang terlihat pada medium Trypcase Soy Medium setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam dalam
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 43 suhu 37 C. Ditandai dengan jumlah koloni bakteri pada media penanaman yang dapat dihitung dengan colony counter. 4.4.3 Variabel terikat penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri Variabel terikat dalam penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri adalah Nilai Optical Density (OD) biofilm bakteri E. faecalis dalam medium TSB yang terbaca dalam ELISA Reader panjang gelombang 595 nm. 4.4.4 Variabel terkendali penelitian uji daya hambat bakteri Variabel kendali penelitian uji daya hambat bakteri adalah kultur bakteri E. faecalis, media penanaman kultur dalam penelitian, proses pembuatan ekstrak siwak, lingkungan, metode pemeriksaan, dan cara pemeliharaan. 4.4.5 Variabel terkendali penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri Variabel kendali penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri adalah kultur bakteri E. faecalis yang diambil untuk mendapatkan biofilm, media penanaman kultur biofilm, proses pembuatan ekstrak siwak, waktu penelitian, lingkungan, metode pemeriksaan, cara pemeliharaan, dan teknik screening biofilm.
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 44 4.5 Definisi operasional 1. Konsentrasi ekstrak siwak adalah hasil ekstraksi dari bubuk siwak dengan metode sokhletasi yang dibuat di Laboratorium Farmakologi Akademi Farmasi Putra Indonesia Malang dan diencerkan dengan metode dilusi dengan perbandingan bubuk siwak dalam gram dan pelarut dalam milliliter sehingga didapat didapatkan ekstrak siwak 100% (1 gr/ ml), 75% (0,75 gr/ml), 70% (0,7 gr/ml), 65%(0,65 gr/ml), 60% (0,6 gr/ml), 55% (0,55 gr/ ml), 50% (0,5 gr/ml), 25% (0,25 gr/ml). Ekstrak siwak adalah dan diencerkan dengan metode dilusi sehingga didapatkan ekstrak siwak dengan konsentrasi 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan 100%. 2. Minimum Inhibitory Concentration (MIC) adalah konsentrasi ekstrak batang siwak terendah yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. faecalis. 3. Minimum Biofilm Inhibitory Concentration (MBIC) adalah konsentrasi ekstrak siwak terendah yang mampu menghambat pertumbuhan biofilm E. faecalis setelah terbentuk. 4. Kultur pertumbuhan bakteri E. faecalis adalah gambaran kekeruhan dari pertumbuhan bakteri E. faecalis pada media cair Trypticase Soy Broth setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam dalam suhu 37 C dan dibuktikan dengan penanaman kembali pada medium Trypticase Soy padat dimana jumlah koloni dapat dihitung dengan colony counter. 5. Kultur biofilm bakteri E. faecalis adalah gambaran pertumbuhan biofilm yang didapatkan dari sel yang tetap melekat dalam well setelah dilakukan
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 45 pencucian dalam metode microtiter biofilm assay, dari kultur bakteri E. faecalis yang telah diisolasi. Sel yang adesif tersebut dipanen melalui proses vortex dan sentrifugasi. 6. Pertumbuhan biofilm E. faecalis adalah jumlah sel hidup agregat monospesies E. faecalis yang membentuk lapisan padat pada permukaan suatu substrat atau media dan diselimuti oleh pelekat karbohidrat yang dikeluarkan bakteri tersebut dan ditentukan berdasarkan koloni biofilm yang dapat dihitung dengan metode optical density (OD). 7. ELISA reader adalah alat yang digunakan untuk menghitung optical density (OD) atau ukuran intensitas kekeruhan pertumbuhan biofilm yang terbentuk dan diletakkan pada microplate. ELISA reader yang digunakan adalah merk Biorad dengan panjang gelombang 595 nm 4.6 Waktu dan tempat penelitian 1. Penelitian dilakukan di Laboratorium RSPTI (Rumah Sakit Penyakit Tropis dan Infeksi) Surabaya bulan Juni 2014 - Oktober 2015. 2. Pembuatan ekstrak siwak dilakukan di Laboratorium Farmakologi Akademi Putera Farmasi Indonesia Malang bulan Juni 2014 Oktober 2015. 4.7 Alat dan bahan penelitian 4.7.1 Alat dan bahan uji daya hambat bakteri Alat : 1. tabung reaksi dan rak
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 46 2. kawat oese 3. kompor listrik 4. pengaduk 5. mikropipet 6. kertas saring 7. gelas ukur 8. alat timbangan 9. cawan petri 10. inkubator Bahan : 1. Stok Bakteri E. faecalis 2. Ekstrak etanol siwak 3. Media cair Trypticase Soy Broth 4. Media padat Trypticase Soy Agar 5. Akuades steril. 4.7.2 Alat dan bahan uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri Alat : 1. tabung reaksi dan rak. 2. kawat oese 3. kompor listrik 4. pengaduk 5. mikropipet 6. kertas saring
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 47 7. gelas ukur 8. alat vortex dan sentrifugasi 9. cawan petri 10. Anaerobic jar 11. Microplate 11. ELISA reader 12. inkubator Bahan : 1. Stok Kultur Bakteri E.faecalis 2. Trypcase Soy Broth Medium 3. 20% gliserol 4. Phosphat Buffer Saline (PBS) 5. Polyprophylene tube 6. Crystal Violet 0,1 % 7. Media cair Trypticase Soy Broth 8. Media padat Trypticase Soy Agar 9. Acidified isopropanol 10. Akuades steril 4.8 Prosedur penelitian 4.8.1 Tahap persiapan a. Sterilisasi alat
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 48 Sebelum penelitian dilaksanakan, semua alat dan media yang akan digunakan disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan sebesar 1atm selama 15 menit, lalu didinginkan. (Rahardjo dkk, 2006; Todar, 2012) b. Pembuatan ekstrak etanol siwak Digunakan etanol 96%, kemudian dibuat ekstrak siwak yang diperoleh dari Laboratorium Farmasi Akademi Farmasi Putera Indonesia Malang. Bahanbahan tersebut diolah untuk mendapatkan ektrak siwak dengan konsentrasi dosis ekstrak yang efektif dalam menghambat pertumbuhan E. faecalis. Ekstrak siwak yang digunakan adalah menggunakan batang kunyah (chewing stick) yang diambil dari pohon siwak (Salvadora persica) yang segar. Batang siwak dipotong-potong hingga menjadi potongan kecil dan dikeringkan pada suhu kamar selama 2 minggu. Bahan tersebut dihaluskan dengan menggunakan blender untuk mendapatkan bubuk batang siwak. Larutan ekstrak siwak yang digunakan adalah larutan yang dibuat dari 400 gr bubuk batang siwak yang diekstraksi dengan metode sokhletasi. Digunakan pelarut etanol 96%. sebanyak 1,5 kali volume ekstraktor menggunakan alat sokhlet pada suhu 60-80 C sampai warna pelarut pada sokhlet menjadi bening dan diletakkan pada rotary evaporator pada suhu 60 C. Pelarut diuapkan pada elektromanthel hingga diperoleh ekstrak kental, kemudian diencerkan sehingga didapat konsentrasi ekstrak 100%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%. 30%, 25%. (Harborne, 2006; Chivatxaranukul et al., 2008; Kusumasari, 2012)
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 49 Sokhletasi adalah suatu metode atau proses pemisahan suatu komponen yang terdapat dalam zat padat dengan cara penyaringan berulang-ulang dengan menggunakan pelarut tertentu sehingga semua komponen yang diinginkan akan terisolasi. Metode ini digunakan sehingga komponen aktif yang didapatkan dari ekstrak akan optimum dan pengaruh pelarut terhadap efektifitas ekstrak relatif kecil. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 96% sehingga memadai untuk dilakukan pembuatan ekstrak dengan metode sokhletasi karena metode ini harus menggunakan jenis pelarut yang mudah menguap. Dengan metode ini, pelarut organik dapat menarik senyawa organik dari bahan ekstrak, waktu yang digunakan lebih efisien, dan jumlah pelarut yang digunakan lebih sedikit dibandingkan dengan menggunakan metode maserasi maupun perkolasi. Metode ini juga baik digunakan dalam kondisi pemisahan minyak atsiri dengan metode distilasi uap tidak dapat digunakan dengan baik karena presentasi senyawa yang digunakan atau diisolasi memiliki jumlah yang kecil atau tidak mencukupi. (Sandoe et al., 2006) c. Persiapan kultur E. faecalis Sediaan kultur E. faecalis dipersiapkan. Dari sediaan tersebut inokulum bakteri diinkubasi pada Trypticase Soy Broth pada suhu 37 C selama 18 jam serta diencerkan dengan 0,85% larutan NaCl steril sehingga mencapai suspensi kekeruhan setara dengan Standard Mc.Farland 0,5. (Oli et al., 2012; Masadeh et al., 2013). Kemudian diambil sebanyak 200µl suspensi menggunakan standard Mc.Farland dan kultur setiap bakteri ditanam pada sediaan Trypticase Soy Agar padat kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. (Poelongan & Praptiwi, 2010).
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 50 4.8.2 Prosedur pelaksanaan penelitian uji daya hambat bakteri 1. Disiapkan 7 tabung reaksi yang diisi masing-masing 100 µl media Mueller Hinton Broth Untuk masing-masing bakteri 2. Pada masing-masing tabung dimasukkan 100 µl kultur bakteri 3. Setelah ekstrak siwak disiapkan dalam konsentrasi masing-masing 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, dan 100%., digunakan masing-masing 100 µl ekstrak dan ditambahkan ke dalam tabung. Tabung nomor 1 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 100 %, pada tabung nomor 2 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 75 %, pada tabung nomor 3 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 70 %, pada tabung nomor 4 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 65 % serta pada tabung nomor 5 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 60 %, tabung nomor 6 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 55%, Tabung nomor 7 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 50 %, pada tabung nomor 8 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 45 %, pada tabung nomor 9 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 40 %, pada tabung nomor 10 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 35 %, pada tabung nomor 11 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 30 %, dan tabung nomor 12 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 25%. 4. Disiapkan tabung nomor 13 sebagai kontrol positif dengan menambahkan 100 µl kultur bakteri dengan media cair Trypticase Soy Broth.
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 51 5. Disiapkan tabung nomor 14 sebagai kontrol negatif atau kontrol sterilisasi dengan media cair Trypticase Soy Broth steril (tanpa tambahan kultur bakteri dan ekstrak siwak) 6. Kemudian semua tabung diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 C. 7. Kemudian untuk mengetahui jumlah bakteri dari tiap-tiap hasil biakan bakteri yang diberi perlakuan, dilakukan penanaman pada tiap kultur dari tabung 1 sampai 7 pada cawan petri sebanyak 10 µl menggunakan mikropipet dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C pada media Mueller Hinton Agar padat. Adanya pertumbuhan masing-masing jenis bakteri ditandai dengan adanya koloni pada media. 9. Penghitungan koloni dilakukan dengan menggunakan alat penghitung colony counter. Dengan syarat penghitungan koloni dengan metode plate count tiap cawan petri antara 30-300 koloni. 11. Dilakukan replikasi percobaan sebanyak 3 kali, sehingga didapatkan 4 sampel untuk masing-masing hasil biakan tiap-tiap bakteri. 4.8.3 Prosedur pelaksanaan penelitian uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri a. Pembuktian kultur biofilm E.faecalis 1. Dari sediaan kultur bakteri E. faecalis, 100µL suspensi dibiakkan dalam polyprophylene tube yang mengandung 2 ml Trypticase Soy
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 52 Broth (TSB) dengan penambahan glukosa 1% dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. 2. Sel biofilm dipanen melalui pembuangan media kultur dan membilas tube sebanyak tiga kali dengan 0,2 ml larutan PBS (ph = 7,2) untuk menghilangkan bagian bakteri yang non adesif. 3. Sel yang adesif, yaitu sel yang tetap melekat dalam well setelah dilakukan pencucian dalam metode microtiter biofilm assay, dipanen melalui proses vortex dan sentrifugasi. Pellet kultur sel tersebut disuspensi dalam PBS untuk kemudian dikondisikan pada 0,5 Standar turbiditas (kekeruhan) McFarland. 4. Untuk membuktikan adanya biofilm pada kultur, tube kultur dicat dengan crystal violet. Keberadaan sel biofilm dideteksi lewat adanya garis biofilm yang tampak pada dinding tube. 5. Sampel diambil dari 100µL suspensi Pellet kultur bakteri yang terbukti mampu menghasilkan biofilm dan ditanam pada medium Trypticase Soy Broth. (Masadeh et al., 2013). b. Pelaksanaan uji daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri 1. Disiapkan well yang diisi masing-masing 100 µl media Trypticase Soy Broth dan penambahan glukosa 1%. 2. Pada masing-masing well dimasukkan 100 µl kultur bakteri E.faecalis yang terbukti dapat menghasilkan biofilm. 3. Setelah ekstrak siwak disiapkan dalam konsentrasi masing-masing 100%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30 %, dan 25%. digunakan masing-masing 100 µl ekstrak dan ditambahkan ke
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 53 dalam tiap well. Tabung nomor 1 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 100 %, pada tabung nomor 2 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 75 %, pada tabung nomor 3 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 70 %, pada tabung nomor 4 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 65 % serta pada tabung nomor 5 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 60 %, tabung nomor 6 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 55%, Tabung nomor 7 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 50 %, pada tabung nomor 8 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 45 %, pada tabung nomor 9 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 40 %, pada tabung nomor 10 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 35 %, pada tabung nomor 11 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 30 %, dan tabung nomor 12 ditambahkan 100 µl ekstrak siwak 25%. 4. Disiapkan well sebagai kontrol positif dengan menambahkan 100 µl ml kultur bakteri dengan 100 µl media cair Trypticase Soy Broth dan 100 µl chlorhexidine 0,1% sebagai kontrol negatif. 5. Selain itu disiapkan well sebagai kontrol ekstrak yang berisi 100 µl ekstrak siwak 100% saja, dan well sebagai kontrol pewarnaan berisi 100 µl medium saja. 6. Well tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. 7. Kemudian semua tabung dimasukkan ke dalam anaerobic jar berisi gas campuran 95% NO 2 dan 5% CO 2 dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. 8. Kultur biofilm diletakkan pada microplate kemudian dicuci 3 kali dengan 0,2 ml PBS
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 54 9. Kultur biofilm yang menempel pada well di cat dengan 0,2ml crystal violet 2% dan dibilas dengan 100 µl akuades steril. 10. Setelah kering, ditambahkan 0,2 ml acidified isopropanol pada tiap well 9. Nilai Optical Density (OD) dibaca pada ELISA reader dengan panjang gelombang 595 nm. 9. Perhitungan hambatan pertumbuhan biofilm bakteri setelah pemberian ekstrak siwak ditentukan dengan melihat nilai Optical Density melalui rumus biofilm assay sebagai berikut: (Pettit, 2005; Balaji et al., 2013; Tang et al., 2014) % hambatan pertumbuhan Biofilm = nilai OD kontrol positif - nilai OD perlakuan x 100% Nilai OD kontrol positif 10. Dilakukan replikasi percobaan sehingga didapatkan 4 sampel pada masing-masing perlakuan. 4.9 Analisis data penelitian Dari data penelitian, baik daya hambat pertumbuhan bakteri secara planktonik maupun biofilm bakteri, dilakukan uji Kolmogorof Smirnov untuk mengetahui distribusi normalnya, lalu dianalisis menggunakan uji Anova dengan taraf kemaknaan 0,05 untuk mengetahui perbedaan dari masing-masing perlakuan. Kemudian dilakukan uji LSD ( Least Square Differences) untuk melihat perbedaan makna antar perlakuan. Analisis tersebut untuk melihat masing-masing dosis ekstrak siwak yang memiliki daya hambat, baik terhadap pertumbuhan bakteri maupun biofilm bakteri berdasar hasil Optical Density dari E. faecalis. (Pudyani dkk, 2013)
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 55 4.10 Alur penelitian uji daya hambat bakteri dan pertumbuhan biofilm bakteri 4.10.1 Pembentukan biofilm oleh bakteri E. faecalis 100µL suspensi bakteri: E. faecalis polyprophylene tube berisi 2 ml TSB + 1% Glukosa Inkubasi selama 48 jam pada suhu 37 C. Media kultur dibuang dan tube dibilas dengan PBS (Phosphat Buffer Saline) ph 7,2 untuk menghilangkan sel non adesif Sel yang adesif dipanen dengan proses vortex + sentrifugasi Pellet kultur sel disuspensi dalam PBS Uji keberadaan biofilm dengan pengecatan Tryphan blue / Crystal violet pada tube 100µL suspensi Pellet kultur yang terbukti menghasilkan biofilm ditanam pada medium Trypticase Soy Agar.
ADLN PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA 56 4.10.2 Uji daya hambat bakteri dan daya hambat pertumbuhan biofilm bakteri E. faecalis Potongan siwak dikeringkan dan dihaluskan Di rendam ke dalam etanol 96 % dengan metode soxhletasi Ekstrak diperoleh melalui penguapan dengan elektromanthel Ekstrak diencerkan dengan metode dilusi : konsentrasi ekstrak siwak 100%, 75%,70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% Kesimpulan penelitian