III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian 1.1 Materi Bahan yang digunakan meliputi kultur Candida albicans, sampel vagina wanita usia produktif, medium MRSA (demann Rogosa Sharpe Agar), medium MRSB (demann Rogosa Sharpe Broth), medium SDA (Sabouraud Dextrose Agar), akuades, indikator phenolphthalein (pp 1 %), NaOH 1 N, pepton water, indikator anaerob jar, Gram set (Crystal violet, lugol s iodine, etanol 96%, safranin), reagen H 2 O 2, reagen tetra methyl d- phenilenediamine dihidrochloride, reagen malachite green, alkohol 70% dan spiritus. Alat yang digunakan meliputi tabung reaksi, cawan petri, Beaker glass, labu Erlenmeyer, statif dan buret, pipet ukur dan filler, kamera digital, drugalsky, eppendorf, mikropipet dan tip, aluminium foil, sprayer, pembakar spirtus, object glass, rak tabung, jarum ose, pipet tetes, label, cotton bud, anaerobic jar, refrigerator, hotplate and magnetic stirrer, timbangan analitik, lemari es, kompor gas dan autoclave. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto selama bulan September-Desember 2014. B. Metode Penelitian 1. Rancangan percobaaan Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan isolasi, identifikasi genus BAL (meliputi pengamatan makromorfologi, mikromorfologi dan uji biokimiawi), seleksi dan uji penghambatan. Isolat potensial dilakukan uji aktivitas antimikroba terhadap C. albicans, meliputi uji aktivitas antifungi, pengukuran kadar asam laktat, perhitungan jumlah sel dan pengukuran ph. 2. Cara Kerja 2.1 Isolasi BAL dan C. albicans vagina wanita usia produktif (Modifikasi Grolund et al., 2009) Sampel diambil dari vagina wanita sehat usia produktif. Isolasi dilakukan secara swab menggunakan catton bud steril yang telah dilembabkan 6
dengan pepton water kemudian dilakukan pengenceran hingga 10-4. Dua pengenceran terakhir masing-masing dibiakkan ke media MRSA untuk isolasi BAL dan media SDA isolasi C. albicans dengan metode spread plate, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam. 2.2 Pemurnian (Kismiyati dkk.,2009) Tahap pemurnian ini merupakan tahapan lanjutan dari isolasi bakteri yang bertujuan untuk mendapatkan koloni tunggal dengan cara mengambil koloni yang dominan pada medium MRSA kemudian dipindahkan ke medium yang sama dengan metode four streak sampai mendapatkan koloni tunggal. Selanjutnya dilakukan pembuatan kultur stok dan kultur uji dengan menginokulasikan koloni tunggal yang didapat pada medium MRSA miring dan medium MRSB. Inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 0 C. 2.3 Karakterisasi Bakteri Asam laktat vagina a. Pengamatan Morfologi koloni (Desniar et al., 2012) Pengamatan morfologi koloni dilakukan setelah mendapatkan koloni tunggal atau biakan murni. Koloni yang tumbuh pada permukaan medium diamati morfologinya meliputi: ukuran, bentuk, warna, permukaan, elevasi, dan tepi. Pengamatan morfologi koloni menggunakan mikroskop dengan perbesaran 4 x 10. b. Pewarnaan Gram (Lay, 1994) Pewarnaan Gram digunakan untuk memastikan bahwa kelompok bakteri tersebut termasuk ke dalam bakteri gram positif. Isolat bakteri diulaskan pada object glass dan difiksasi. Ulasan tersebut ditetesi dengan gram A (crystal violet) selama 60 detik dan dicuci menggunakan akuades mengalir kemudian dikeringanginkan. Gram B (lugol s iodine) diteteskan pada ulasan selama 60 detik kemudian dicuci dengan akuades mengalir lalu dikeringanginkan dan ditetesi gram C (ethanol 96%) sampai tetesan berwarna jernih dan dicuci menggunakan akuades mengalir kemudian dikeringanginkan. Terakhir ulasan ditetesi gram D (safranin) selama 45 detik dan dicuci menggunakan akuades mengalir kemudian dikeringanginkan. Selanjutnya, ulasan diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 x 10. Bakteri gram positif ditandai dengan warna sel yang berwarna ungu. 7
c. Uji katalase (Kismiyati dkk., 2009) Isolat yang didapatkan kemudian dilakukan pengujian katalase untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim katalase. Pengujian ini dilakukan dengan cara mengulaskan bakteri pada object glass kemudian ditetesi reagen H 2 O 2. Interpretasi hasil positif jika terdapat gelembung gas. d. Uji oksidase (Kismiyati dkk., 2009) Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada isolat uji dengan cara mengulas satu ose isolat uji di atas object glass. Isolat ditutup dengan kertas tissue untuk menghindari kontaminasi dari oksigen yang ada di udara. Ditetesi dengan reagen oksidase (tetramethyl d-phenilenediamin dihydrochloride). Diamati perubahan warna yang terjadi. Jika menunjukkan warna yang lebih gelap dari sebelumnya maka oksidase positif dan sebaliknya. e. Uji MR (Methyl Red) Sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan pada medium cair MR-VP. Selanjutnya diinkubasi selama 2 x 24 jam pada temperatur 37 o C. Setelah diinkubasi, Methyl-red ditambahkan sebanyak 5 tetes diatas preparat isolat bakteri. Hasil positif jika terbentuk kompleks warna pink sampai merah yang menandakan bahwa mikroba tersebut menghasilkan asam. f. Uji VP (Voges Proskauer) Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan kedalam medium cair MR-VP kemudian diinkubasikan pada temperatur 37 o C selama 2 x 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian ditambahkan 3 tetes KOH 40% dan 2 tetes alpha-naphthol pada masing-masing isolat lalu dikocok selama 30 detik. Hasil positif jika medium berubah warna dari warna kuning menjadi merah muda. g. Uji motilitas dan uji kebutuhan O 2 (Kismiyati dkk., 2009) Uji motilitas dilakukan untuk mengetahui pergerakan bakteri uji bisa juga digunakan untuk mengetahui sifat dari kebutuhan oksigennya (bakteri anaerob, aerob, mikroaerofilik, atau fakultatif anaerob). Uji ini menggunakan medium SIMA semisolid dengan perlakuan I ose diinokulasikan secara stab inoculation. Bakteri dikatakan motil apabila 8
setelah inkubasi 2x 24 jam suhu 37 o C bakteri tersebut menunjukkan pola penyebaran pada medium tegak. h. Uji Tipe Fermentasi (Suryani dkk., 2010) Pengujian tipe fermentasi dilakukan dengan uji produksi gas. Pengamatan dilakukan dengan menumbuhkan kultur isolat dalam media MRSB dalam tabung reaksi yang diberi tabung durham dalam keadaan terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh BAL. Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 2-3 hari pada suhu 37 o C. Terdapat dua tipe fermentasi pada bakteri asam laktat, yaitu homofermentasi dan heterofermentasi. BAL homofermentasi hanya menghasilkan asam laktat sebagai produk utama fermentasinya, sedangkan bakteri asam laktat heterofermentasi selain asam laktat juga menghasilkan etanol, asam lain seperti asam asetat serta gas CO 2. Sehingga apabila bakteri asam laktat yang diuji menghasilkan gas yang tertampung dalam tabung Durham, BAL tersebut dinyatakan sebagai heterofermentatif, sedangkan isolat yang tidak menghasilkan atau memproduksi gas disebut homofermentatif. 2.2 Seleksi Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam menghambat pertumbuhan C. albicans Untuk mendapatkan isolat bakteri yang berpotensi dalam menghambat pertumbuhan C. albicans, maka dilakukan pengujian terhadap aktivitas antagonistik atau daya hambat. Seleksi BAL dalam menghambat pertumbuhan C. albicans dilakukan dengan menggunakan metode Kirby- Bauer. Kultur bakteri asam laktat (BAL) sebanyak 1 ml dari kultur diinokulasikan ke dalam 10 ml MRSB dan diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 o C. Sebanyak 1 ml kultur C. abicans diinokulasikan ke dalam 10 ml SDB lalu diinkubasi pada suhu 37 o C sampai jumlah sel 10 6 CFU/mL. kemudian, sebanyak 0,1 ml C. albicans diinokulasikan ke dalam SDA secara spread plate. Sebanyak 25 μl kultur BAL masing-masing diteteskan pada kertas cakram kemudian diletakkan di tengah media, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 2 hari. Diamati zona hambat yang terbentuk, isolat dengan zona hambat tertinggi dilakukan pengujian terhadap aktivitas antifungi. 9
2.3 Uji Penghambatan terhadap Candida albicans a. Pembuatan kultur C. albicans Biakan C. albicans sebanyak 1 ml (jumlah sel 10 6 CFU/mL) diinokulasikan ke dalam medium SDB (Sabaroud Dextrose Broth) kemudian diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 37 o C. b. Penyiapan Inokulum BAL Isolat BAL yang mempunyai kemampuan dalam menghambat pertumbuhan C. albicans tertinggi dikultur dalam media MRSB dengan aktivasi sebanyak 3 kali. Aktivasi pertama dengan menginokulasikan 1 ose biakan murni BAL ke dalam 10 ml MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Aktivasi kedua dengan menginokulasikan 1 ml kultur aktivasi pertama ke dalam 9 ml MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Aktivasi ketiga dengan menginokulasikan 5 ml kultur aktivasi kedua ke dalam 45 ml MRSB kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kemudian dilakukan pengukuran jumlah sel. c. Uji Aktivitas Antifungi (Khunajakr et al., 2008 dalam Khoiriyah, 2014) Sebanyak 1 ml inokulum BAL diinokulasikan dalam 25 ml media MRSB diinkubasi pada suhu 37 o C selama 0, 4,8, 12, 16, 20, 24, 32, dan 72 jam. Kemudian dari setiap perlakuan waktu inkubasi tersebut dilakukan uji aktivitas antifungi, pengukuran kadar asam laktat, perhitungan jumlah sel dan pengukuran ph media. Sebanyak 25 ml kultur BAL pada medium MRSB disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit, sehingga didapatkan supernatan yang bersifat bebas sel (cell free culture). Supernatan kemudian diberi perlakuan dengan penambahan NaOH hingga ph menjadi netral (SN) dan supernatan yang tidak dinetralkan (STN), pengaturan ph supernatan dimaksudkan untuk melihat pengaruh metabolit primer asam organik dan senyawa antimikroba lain pada STN dan pengaruh metabolit asam organik pada SN. kemudian diuji aktivitas antifunginya. Sebanyak 0,1 ml suspensi C. albicans diinokulasikan pada medium SDA secara spread plate. Kertas cakram ( 6 mm) steril diambil dengan pinset dan diletakkan di atas permukaan medium SDA yang telah di inokulasikan C. albicans, kemudian ditetesi 25 µl SN dan diinkubasi 24 jam pada suhu 37 o C. Perlakuaan yang sama dilakukan dengan STN. 10
Aktivitas antifungi ditentukan dengan mengukur cakram. zona hambat dihitung dengan cara: zona hambat pada kertas (3-1) Keterangan: D1= diameter zona hambat vertikal D2= diameter zona hambat horizontal d. Pengukuran Total Asam Laktat Kultur potensial pada medium MRSB diambil sebanyak 10 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, selanjutnya diencerkan dengan akuades sebanyak 90 ml. Ditambahkan 3 tetes indikator phenolphthalein (pp 1 %), Kemudian dilakukan titrasi dengan menggunakan NaOH 1 N secara perlahan sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda (pink). Perhitungan total asam dilakukan dengan menggunakan rumus: Jumlah Asam = (3-2) Keterangan: V = volume larutan NaOH, dinyatakan dalam ml N = normalitas larutan NaOH B = bobot/volume sampel, dinyatakan dalam ml BM asam laktat = 90 Satuan total asam laktat dalam %. e. Pengukuran Jumlah Sel BAL pada media MRSA Perhitungan jumlah sel BAL dilakukan dengan penanaman pada media MRSA secara pour plate sebanyak 1 ml. Diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada media MRSA diamati dan dihitung jumlah koloninya, kemudian ditentukan jumlah total bakteri dengan metode TPC (Total Plate Count). f. Pengukuran ph Media MRSB Pengukuran ph media dilakukan dengan menggunakan ph meter, sehingga dapat diketahui perubahan ph yang terjadi selama masa inkubasi. 11
C. Metode Analisis Hasil yang didapatkan dianalisis menggunakan metode deskriptif dengan cara membandingkan hasil positif yang didapatkan dengan hasil dari penelitian-penelitian sebelumnya yang berkaitan. BAL yang memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan C. abicans diidentifikasi sampai level genus mengacu pada Bergey s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994 dalam Suryani, 2010). Penentuan genus bakteri asam laktat didasarkan pada hasil pengamatan morfologi dan uji biokimiawi. D. Bagan Alir Penelitian Sampling Isolasi Bakteri BAL Karakterisasi bakteri BAL - Pengamatan morfologi - Uji biokimiawi Seleksi Bakteri Asam Laktat Penghasil Substansi Antifungi Uji Aktivitas Antifungi aktivitas antifungi pengukuran kadar asam laktat perhitungan jumlah sel pengukuran ph 12